A geração de cardiomiócitos a partir de células-tronco pluripotentes in vitro permite o acesso a grandes quantidades de tecido cardíaco in vitro para ciência básica e aplicações clínicas. Este protocolo utiliza o fator atrializante Grem2 tanto para aumentar o número de cardiomiócitos obtidos quanto para gerar cardiomiócitos com fenótipo atrial.
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Artigo de método
Diferenciação de Atrial Cardiomyocytes de células-tronco pluripotentes Usando o BMP Antagonista Grem2
Neste artigo
Resumo
Resumo
Protocolos para a produção de populações de cardiomiócitos a partir de células estaminais pluripotentes têm sido desenvolvidos, mas estes em geral produzem fenótipos de células misturadas. Os pesquisadores interessados em prosseguir estudos envolvendo subtipos miócitos específicas requerem uma abordagem diferenciação mais direcionado. Por tratamento de células estaminais embrionárias de ratinho (ES) com Grem2, um antagonista de BMP segregada que é necessário para a formação da câmara atrial in vivo, um grande número de células cardíacas com um fenótipo fibrilação pode ser gerado. A utilização da linha de células estaminais pluripotentes engenharia Myh6-DsRED-Nuc permite a identificação, selecção e purificação de cardiomiócitos. Neste protocolo de corpos embrióides são geradas a partir de células-Myh6 DsRED-Nuc, utilizando o método de gota suspensa e mantido em suspensão até ao dia diferenciação 4 (D4). Em células D4 são tratados com Grem2 e plaqueadas em placas revestidas com gelatina. Entre D8-D10 grandes áreas contratantes são observados nas culturas e continuar a expandir e mAture através d14. Molecular, as análises histológicas e electrophysiogical indicam células em células tratadas com Grem2 adquirir características atriais-como fornecendo um modelo in vitro para estudar a biologia dos cardiomiócitos atriais e a sua resposta aos vários agentes farmacológicos.
Introdução
As células estaminais pluripotentes são uma ferramenta poderosa para gerar e estudar as células de um hospedeiro de difícil acesso aos tecidos para estudos de investigação básica e pré-clínicos, especialmente em seres humanos 1-5. modulação correcta de vias de sinalização de desenvolvimento podem dirigir a diferenciação de células estaminais pluripotentes para o destino fenotípica desejada. Muitos protocolos têm sido desenvolvidos para gerar cardiomiócitos (CMS) a partir de células estaminais pluripotentes 6-14. Estes protocolos geralmente envolvem a modulação da superfamília TFGβ (Activina, BMP e TGF-p) e percursos através de adição atempada de....
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Protocolo
1. Preparação de celular Meios de Cultura, soluções e reagentes.
- Prepare a 500 ml de células estaminais embrionárias rato (Mesc) dos suportes por mistura e filtragem esterilizada (0,2 um de tamanho de poro) 445 ml de Meio Essencial Mínimo de Glasgow (GMEM), 50 ml de soro de bovino fetal (FBS) inactivado, 5 mL de 100X concentrado L- substituição de glutamina, 5 ul de pequeno rato recombinante da leucemia factor inibidor (LIF) em 1 x 10 7 unidades por ml, e 1,43 uL de ß-mercaptoetanol (concentração final é de 50 uM). Armazenar a 4 ° C até que esteja pronto para uso.
- Preparar 500 ml de embrióides corpo (EB) meios de diferenciação por mist....
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Resultados
Antes de diferenciação, as células estaminais pluripotentes deve ser compacta e isenta de diferenciação espontânea. As células mostrados na Figura 1A está pronto para ser singularizados e usado para pendurar gotas, tal como descrito no ponto 5.1 da secção de protocolo. As células mostradas na Figura 1B estão diferenciação espontânea e não deve ser utilizada para a preparação de gotas de suspensão.
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Discussão
Este protocolo rotineiramente produz culturas com uma elevada percentagem de CMS que são característicos da linhagem atrial. Como acontece com qualquer protocolo de diferenciação, a qualidade dos mESCs anteriores à diferenciação deve ser dada especial atenção. mESCs devem ser monitorizados por rotina para a morfologia adequada (Figura 1A). Qualquer diferenciação espontânea que ocorre antes da formação da EBS irá limitar severamente a eficiência de CARDIOGENESIS e deve ser removido antes passaging
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Divulgações
Os autores deste manuscrito não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Este trabalho foi financiado pelo NIH concede HL083958 e HL100398 (AKH) e 2T32HL007411-33 "Programa em Mecanismos Cardiovasculares: Formação em Investigação" (JB).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| GMEM | Life Technologies | 11710 | |
| FBS | Life Technologies | 10082 | |
| Glutamax | Life Technologies | 35050 | |
| LIF | EMD Millipore | ||
| Sigma | M3148 | ||
| IMDM | Sigma | I3390 | |
| Aminoácidos Não Essenciais | Sigma | M7145 | |
| Placas de Cultura de Tecidos de 10 cm | Sarstedt | 83.3902 | |
| Placas de Petri Bacterianas de 10 cm | VWR | 25384-342 | |
| Placas de Petri Bacterianas de 6 cm | VWR | 25384-092 | |
| Placas de Cultura de Tecidos de 6 poços | Sarstedt | 83.3920 | |
| Gremlin 2 proteína recombinante | R& AMP; D Systems | 2069-PR-050 | |
| Unidades de filtro estéreis | Thermo Fisher | 09-741-02 | |
| Gelatina (de pele suína) | Sigma | G1890 | |
| 10X PBS, Estéril | Sigma | P5493 | |
| BSA | Solução Sigma | 5470 | |
| 0,05% de tripsina-EDTA | Life Technologies | 25300054 | |
| DPBS, sem cálcio, sem magnésio | Life Technologies | 14200 |
Referências
- Loya, K., Eggenschwiler, R., et al. Hepatic differentiation of pluripotent stem cells. Biological Chemistry. 390 (10), 1047-1055 (2009).
- Narazaki, G., Uosaki, H., et al. Directed and systematic differentiation of cardiovascular cells from....
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Reimpressões e permissões
