Method Article

Identificação de MyoD interactome Usando purificação de afinidade em tandem Acoplado a Espectrometria de Massa

DOI:

10.3791/53924

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May 17th, 2016

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1Epigenetics and Cell Fate, UMR 7216 CNRS, Centre National de la Recherche Scientifique CNRS - Université Paris Diderot, Sorbonne Paris Cité

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

MyoD é um fator de transcrição miogênico com forte capacidade de induzir a transdiferenciação miogênica de muitas linhagens celulares não musculares totalmente diferenciadas. Os mecanismos epigenéticos envolvidos nessa transdiferenciação são amplamente desconhecidos. Aqui descrevemos um método de purificação de dupla afinidade seguido de espectrometria de massa para caracterizar exaustivamente os parceiros MyoD.

Abstract

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diferenciação terminal músculo esquelético começa com o compromisso de células precursoras pluripotentes mesodermais de mioblastos. Estas células ainda tem a capacidade de proliferar ou eles podem se diferenciar e se fundem em miotubos multinucleadas, que maturate ainda mais para formar fibras musculares. diferenciação terminal músculo esquelético é orquestrada pela ação coordenada de vários fatores de transcrição, em particular os membros dos fatores ou MRFs reguladoras muscular (MyoD, miogenina, Myf5 e MRF4), também chamado de bHLH miogênica fatores de transcrição da família. Estes factores cooperar com complexos de remodelação da cromatina dentro da rede reguladora da transcrição elaborada para atingir tecido muscular esquelético. Neste, MyoD é considerado o fator de transcrição miogênica mestre no desencadeamento de diferenciação terminal muscular. Esta noção é reforçada pela sua capacidade de converter MyoD células não musculares em células do músculo esquelético. Aqui nós descrevemos uma abordagem utilizada para identificar MyoDparceiros de proteína de forma exaustiva, a fim de elucidar os diferentes fatores envolvidos na diferenciação terminal músculo esquelético. O objectivo a longo prazo é compreender os mecanismos epigenéticos envolvidos na regulação de genes musculares esqueléticas, ie., Metas MyoD. parceiros MyoD são identificados usando purificação de afinidade em tandem (TAP-tag) a partir de um sistema heterólogo acoplada a espectrometria de massa de caracterização (MS), seguido de uma validação do papel de parceiros relevantes durante a diferenciação terminal de músculo esquelético. formas aberrantes de factores miogénicos, ou a sua regulação aberrante, está associada com um número de desordens musculares: miastenia congénita, distrofia miotónica, rabdomiossarcoma e defeitos na regeneração muscular. Como tal, os factores miog�icas fornecer um conjunto de potenciais alvos terapêuticos em doenças musculares, tanto no que diz respeito aos mecanismos que causam doença em si e os mecanismos regenerativos que pode melhorar o tratamento da doença. Assim, o understan detalhadaDing das interacções intermoleculares e os programas genéticos controlados pelos factores miog�icas é essencial para a concepção racional de terapias eficientes.

Introduction

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organismos multicelulares eucarióticos são compostas de diferentes órgãos e tecidos. Cada tecido funcional tem um padrão de expressão do gene específico, o qual é determinado em cada passo de diferenciação. Diferenciação celular envolve a activação de genes específicos, manutenção da sua expressão e, geralmente, o silenciamento de um conjunto de genes tais aqueles que estão envolvidos na proliferação celular. diferenciação de músculo esquelético, ou miogénese, é, assim, um processo multi-etapa, que começa com a determinação de células estaminais mesodermal em mioblastos, e, em seguida, leva à diferenciação terminal destes mioblastos em primeiro mono-nucleadas, e, em seguida, multi-nucleadas, miotubos . Assim, mioblastos são "determinado" células, que ainda são capazes de proliferar, mas eles estão comprometidos com a linhagem músculo esquelético, e, portanto, pode diferenciar exclusivamente em células musculares esqueléticas, quer durante o desenvolvimento embrionário ou em regeneração muscular adulta. O processo de terminal de músculo esquelético diferemciação é orquestrado por um programa genético específico que se inicia com a saída permanente do ciclo celular de células precursoras de mioblastos que leva a um silenciamento definitivo da proliferação de genes associados, tais como E2F genes alvo 1. Com efeito, durante o processo de diferenciação terminal, paragem proliferação de mioblastos é um passo crucial que precede a expressão de genes específicos do músculo esquelético e a fusão de mioblastos em miotubos 2. Tal programa permite que as células-tronco musculares adultas, também chamados de células satélites, para diferenciar durante o processo de regeneração após lesão do músculo esquelético.

Myogenesis mamíferos é criticamente dependente de uma família de miogênica hélice-volta-hélice (bHLH) fatores de transcrição MyoD, Myf5, MRF4 e miogenina, frequentemente referida como a família de fatores esqueléticos determinação muscular ou MRFs (músculo fatores regulatórios) 3. Cada um deles desempenha um papel essencial na especificação e DIFdiferen- das células musculares esqueléticas e tem um padrão de expressão específico abril 05-07. A ativação de Myf5 e MyoD constitui o passo determinante que compromete as células da linhagem miogênica e subsequente expressão de miogenina desencadeia myogenesis com a ativação de genes específicos do músculo esquelético, como MCK (Muscle Creatina Quinase). Factores de transcrição bHLH Miogênica cooperar com os membros da família MEF2 na activação de genes musculares de loci anteriormente silenciosos 8. Eles também estimulam esquelético transcrição do gene muscular como heterodímeros com proteínas bHLH onipresente, E12 e E47, conhecidas como proteínas E, que se ligam chamados E-caixas em várias regiões do gene-regulação 8. Torção, Id (inibidor de diferenciação) e outros factores regulam negativamente este processo, por competir com MyoD para proteínas E de ligação 8.

MyoD é considerado como o jogador mais importante no desencadeamento de terminal muscular diferenciação 9 uma vez que tem a capacidade de induzir um programa de determinação miogénica / diferenciação (trans-diferenciação), em muitos sistemas não-musculares completamente diferenciadas 10-13. Na verdade, a expressão forçada de MyoD induz a trans-diferenciação de diferentes tipos celulares, mesmo aqueles derivados de outra origem embriológica 12. Por exemplo, pode converter MyoD hepatócitos, f ibroblastos, melanócitos, neuroblastos e adipocitos em células musculares semelhante. A ação trans-de diferenciação de MyoD envolve uma ativação anormal do programa genético miogênica (nomeadamente os seus genes-alvo) em um ambiente não-muscular, concomitante ao silenciamento do programa genético de origem (nomeadamente, os genes de proliferação).

Em proliferando mioblastos, MyoD é expresso, mas não é capaz de ativar seus genes-alvo, mesmo quando ele se liga aos seus promotores 14-16. Por conseguinte, o requisito de MyoD de ser continuamente expresso em mioblastos indiferenciadas permanece bastante Elusive. MyoD pôde reprimir seus genes-alvo devido ao recrutamento de enzimas modificadoras da cromatina repressivas em proliferando mioblastos antes do carregamento de ativar cromatina remodelação enzimas 14,17. Por exemplo, na proliferação mioblastos, MyoD está associada com o co-repressor de transcrição KAP-1, histona desacetilases (HDACs) e metiltransferases lisina repressivas (KMTS), incluindo a histona H3 lisina 9 ou H3K9 e H3K27 KMTS, e suprimir de forma activa a expressão de genes alvo através do estabelecimento de uma estrutura de cromatina 14,17 localmente repressivo. Importante, um relatório recente indicou que MyoD é em si directamente metilado pelo H3K9 KMT G9a resultando na inibição da sua actividade de transactivação 16.

Os mecanismos epigenética envolvidas neste trans-diferenciação de células não musculares por MyoD são em grande parte desconhecida. Notavelmente, algumas linhas de células são resistentes a trans-diferenciação induzida por MyoD. Assim, em células HeLa, MyoD é ou inactiva ouainda pode funcionar como repressor, em vez de activador da transcrição devido à falta de expressão da subunidade BAF60C remodelação da cromatina complexo SWI / SNF 18. Este modelo pode, assim, ser de escolha para melhor caracterizar os mecanismos de repressão do gene induzida por MyoD. É igualmente apropriado para ensaiar a capacidade de MyoD para induzir ambiente cromatina repressivo na sua loci alvo com seus parceiros associados e, portanto, desvendar os mecanismos repressivos dependente de MyoD em proliferando mioblastos para afinar a diferenciação terminal.

Aqui descrevemos o protocolo para a identificação de parceiros MyoD usando purificação de afinidade em tandem (TAP-tag) acoplada a espectrometria de massa (MS) caracterização. A utilização de células HeLa-S3 que expressam estavelmente Bandeira-HA-MyoD permitida para obter material suficiente para purificar os complexos a partir de extractos nucleares MyoD fraccionados. A identificação de parceiros MyoD no sistema heterólogo foi seguido por validatino em um sistema relevante.

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Protocol

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1. Preparação de fracções HeLa-S3 Nuclear Salt-extraíveis e cromatina-bound

  1. Recolha das células
    1. Cresça HeLa-S3 Bandeira-HA-MyoD e HeLa-S3 Bandeira-HA (linha celular de controlo) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de vitelo, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina (crescimento meio) a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador húmido.
      Nota: as células HeLa-S3 expressam de forma estável células transduzidas com o vector vazio (HeLa-S3 Bandeira-HA) Flag-HA-MyoD e HeLa-S3 poderia ser ou estabelecida usando o protocolo descrito em: 19,20, ou fornecido pelos autores.
    2. Amplificar as células até 10 completamente confluentes pratos 150 mm de cada linha celular (células HeLa-S3 Bandeira-HA-MyoD e HeLa-S3 Bandeira-HA).
    3. Recolher o sobrenadante (contêm subpopulação não aderente) em 5 L Spinner.
    4. Lava-se a subpopulação aderente com 10 ml de PBS por prato de 150 mm, trypsinize células durante 1 min a TEM quartoratura (solução de tripsina-EDTA a 0,05%, 2 ml para cerca de 15 cm de disco).
    5. Adicionar 4 ml de meio por mm prato 150 e recolher as células em tubos de 50 ml.
    6. Combinar o sobrenadante a partir do passo 1.1.3 (no 5 L Spinner) e as células a partir do passo 1.1.5, adicionar 500 ml de meio de crescimento fresco pré-aquecido para cada linha celular.
    7. Transferir suspensão de células em 5 L rotativo e crescer as células durante pelo menos 60 horas a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador húmido.
    8. Adicionar 500 ml de meio de crescimento fresco e as células crescer durante 24 h.
    9. Adicionar 1 L de meio de crescimento fresco e as células crescer durante 24 h.
    10. Retire 1 ml da suspensão de células para contagem das células e verificar a viabilidade das células. Cor 30 ul de suspensão de células com 30 ul de 0,4% de azul de tripano e contagem de células vivas (não azul) sob o microscópio usando hemocitômetro.
    11. Manter a densidade de células a 2 - 6 x 10 5 células / ml por adição de meio de crescimento fresco diariamente; não exceda 1 X 10 6 células / ml. O máximode volume durante um 5 L Spinner é de 2,5 L.
      Nota: Para os passos seguintes, proceder por lotes de 2-2,5 L de cultura a uma densidade de 1 x 10 6 células / ml. Repita os passos 1.1.12 - 1.1.14 para recolher cerca de 20 L (≈ 20 g de sedimento seco) de cada linha celular antes de prosseguir para o passo seguinte.
    12. as células por centrifugação a 500 xg durante 5 min a 4 ° C e desprezar o sobrenadante.
    13. Ressuspender as células em 100 ml de PBS gelado por pipetagem e centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C para lavar o sedimento.
    14. Repetir a lavagem por ressuspensão das células com 25 ml de PBS gelado, transferindo a suspensão para tubo de 50 ml e centrifugar a 500 xg durante 5 min a 4 ° C.
      Nota: Os sedimentos celulares podem ser imediatamente utilizada ou congelado em azoto líquido e armazenado a -80 ° C durante vários dias.
  2. Isolamento dos Núcleos
    Nota: Execute as etapas 1.2.1 - 1.4.3 na câmara fria.
    1. da-manhã pré-chillrs e homogeneizadores.
    2. Se usando material congelado, descongelar rapidamente os sedimentos de células em banho de água a 37 ° C.
    3. Ressuspender 20 g (Å 20 ml) de células em 20 ml (volume igual ao tamanho do agregado de células) de tampão hipotónico A (Tabela 3), utilizando 10 ml de tampão a primeira, em seguida, a adição de 5 ml, em seguida, adicionando mais 5 ml. Lavam-se as pipetas bem com tampão fresco para obter o máximo de células.
    4. Transferência de suspensão de células de 40 ml para o homogeneizador de pré-refrigerada com um pilão apertada.
    5. Homogeneizar células com 20 golpes num homogeneizador (20 dentro e fora movimentos) e transferir a suspensão de células em tubo de 50 ml.
    6. Lavar o homogeneizador com 7 ml de tampão de sacarose (1/3 do volume inicial da célula, Tabela 3) para recuperar o máximo de células. Transferir esta suspensão rapidamente para dentro do tubo 50 ml do passo 1.2.5 para preservar os núcleos e limitar as fugas.
    7. Manchar uma alíquota de 30 ul com 30 ul de 0,4% de trypan azul, analisar ao microscópio para controlar a eficiência de lise (Se a lise for bem sucedida, todos os núcleos devem ser azul). Se necessário, repita o passo de homogeneização.
    8. Centrifugar durante 7 min a 10000 xg e 4 ° C para sedimentar os núcleos. Salve o sobrenadante como a fracção citoplasmática.
  3. Preparação de Sal-extraível (SE) Fraction Nuclear
    1. Ressuspender o sedimento de núcleos em 8 ml de tampão de sacarose (um volume igual ao tamanho do grânulo de núcleo). Adicionar gota a gota, enquanto se mistura cuidadosamente sobre um vórtice 8 ml de tampão de alto teor salino (volume de sedimento 1 núcleos, Tabela 3) para obter uma concentração final de NaCl de 300 mM. Incubar durante 30 min em gelo e misturar a cada 5 min.
    2. Diminuir a concentração de NaCl para 150 mM, por adição de 8 ml (1/3 do volume total) de tampão de sacarose. Centrifugar durante 10 minutos a 13000 xg e 4 ° C. Recolher o sobrenadante (fracção de sal-extraível nuclear, SE).
      Nota: Ou vá para o passo 1.3.3 ou sair da SEfração no gelo durante a preparação da fracção ligada à cromatina e, em seguida, ultra-centrifugação ambas as frações simultaneamente.
    3. Ultra-SE centrífuga durante 30 min a 85000 xg, a 4 ° C. Tome sobrenadante (≈ 26 ml).
    4. Congelar 100 ul aliquota em azoto líquido. Avance para o passo 2 "Protein purificação complexa", usando o resto do extrato.
      Nota: A alíquota é para ser usado como um controle de entrada durante o passo 5.1.1.
  4. Preparação da fracção ligada à cromatina
    1. Ressuspender o sedimento (a partir do passo 1.3.5.) Meticulosamente em 7 ml (um volume igual ao tamanho do grânulo) de tampão de sacarose.
    2. Adicionar CaCl2 até uma concentração final de 1 mM (28 ul de 0,5 M de CaCl2 por 14 ml de suspensão) para activar MNase (passo 1.4.4) e misturar.
    3. suspensão de pré-aquecimento durante 1 min a 37 ° C.
    4. Adicionar 70 ul nuclease Micrococo (MNase) para obter concentração final de 0,0025 U / mL (1/200 diluição de 0,5estoque / ul U) e misturar.
    5. Incubar exactamente 12 minutos a 37 ° C. Misture todos os 4 min.
    6. Imediatamente coloque a reação no gelo.
    7. Para parar a actividade MNase, adicionar 112 ul de EDTA 0,5 M, pH 8,0 (1/125 diluição) a uma concentração final de 4 mM. Incubar durante 5 min em gelo.
    8. Sonicar 5 vezes durante 1 minuto a alta amplitude, entre dois sonicações permitir uma pausa de 1 min (10 min no total).
    9. Ultracentrífuga durante 30 min a 85000 xg e 4 ° C.
    10. Recolhe-se o sobrenadante (fracção enriquecida nucleossoma, NE, ≈ 12 ml).
    11. Congelar aliquota de 50 ul em azoto líquido. Avance para o passo 2 "Protein purificação complexa", usando o resto do extrato.
      Nota: A alíquota é para ser usado como um controle de entrada durante o passo 5.1.1.

2. Proteína Complexos de Purificação

Nota: Proceda extratos paralelas provenientes de cada linha de células (HeLa-S3 Bandeira-HA-MyoD e de controle, Hela-S3 Bandeira-HA).

  1. Purificação com base FLAG-
    1. Pré-lavagem de resina Bandeira. Utilize 600 mL de resina Bandeira (do estoque comercial de 50%) para cada ponto experimental (frações SE e NE para cada linha de células).
    2. Resina de transferência em tubo de 15 ml, ressuspender em 13 ml de tegn fria (Tabela 3), centrifuga-se durante 2 min a 1000 x g e remover o sobrenadante. Repita 5 vezes. Após a resina Bandeira ressuspender última lavagem em igual volume de tegn (300 ml para cada ponto experimental).
    3. Para cada ponto experimental, misturar 600 ul de resina bandeira lavadas e os extractos de proteína correspondentes (em um tubo de 15 mL para o 12 ml de NE e em um tubo de 50 ml para as fracções de 26 ml SE, respectivamente). Incubar durante a noite em uma roda rotativa, a 4 ° C.
    4. Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xg, a 4 ° C, o sobrenadante posto de lado e manter a 4 ° C até que o resultado do teste de eficiência de purificação (2.2).
    5. Para as amostras SE, ressuspender a resina Bandeiraem 4 ml de tegn e transferir para um tubo de 15 ml. Repetir esta etapa 3 vezes, cada vez que a transferência para o mesmo tubo de 15 mL para evitar a perda de pérolas. Centrifugar 2 min a 1000 xg e 4 ° C e remover o sobrenadante.
    6. Lavar a resina bandeira 7 vezes em um tubo de 15 mL, utilizando 13 ml de tegn e centrifugação 2 min a 1000 xg e 4 ° C.
    7. Após a última lavagem, ressuspender em 1 ml tegn e transferir para um tubo de 1,5 ml de baixa ligação. Centrifugar 2 min a 1000 xg e 4 ° C e remover o sobrenadante.
    8. Ressuspender em 200 ul de solução de péptido FLAG no 4 mg / ml a pH 7,8 para cada ponto experimental. Misturar os grânulos e péptido. Adicionar 200 ul de tampão tegn e incubar a 4 ° C durante pelo menos 4 horas ou durante a noite para eluir as proteínas ligadas.
    9. Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xg, a 4 ° C e transferir a resina e o sobrenadante (a bandeira de eluato) a uma coluna de centrifugação vazia colocada num tubo de 2 mL.
    10. Centrifugar a coluna, recolher o sobras de sobrenadante no tubo de 2 mL.
    11. Recolhe-se o Bandeira resina através da adição de tampão tegn à coluna e prossiga para a segunda eluição Bandeira com 200 ul de solução de péptido Flag (4 mg / ml) durante a noite a 4 ° C para cada ponto experimental.
    12. Repita os passos 2.1.9 - 2.1.10 para coletar segunda eluição. Combine primeiro e segundo eluatos.
  2. Ensaio de eficiência de purificação
    Nota: Durante o passo 2.1.11 - 2.1.12, execute SDS-PAGE e coloração de prata (2.2.1 - 2.2.2).
    1. Tomar 15 ul dos produtos de eluição, adicionam-se 5 ul de tampão de carga 4x e 10x 2 ul de agente de redução, ferver durante 5 min a 96 ° C e executar um de SDS-poliacrilamida a 4 - 12% de gel de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Mancha do gel utilizando o kit de coloração de prata (siga as instruções do fabricante). Se há diferenças claras nos padrões de proteínas entre Flag-HA-MyoD e bandeira-HA eluatos mock, em especial, a banda da Bandeira-HA MyoD (cerca de 50 kDa, Figura 1A), prossiga para a próxima step.
  3. A hemaglutinina (HA) com base na purificação
    1. Lavar a resina de HA por transferência para 15 ml de tubo, ressuspensão em 13 ml de tegn e centrifugação 2 min a 1000 xg, a 4 ° C. etapa de lavagem Repita 5 vezes. Depois de pérolas ressuspender última lavagem em igual volume de tampão tegn.
      Nota: O volume deve ser ajustado de acordo com a eficiência de purificação baseado em bandeira. Comece com 300 ul do estoque comercial de 50% para cada ponto experimental.
    2. Transferência de resina HA para cada ponto experimental dentro de um tubo de ligação baixa de 1,5 ml. Centrifugar 2 min a 1000 xg, a 4 ° C, para eliminar o máximo do tampão de lavagem (Tabela 3) e adicionar os produtos de eluição da purificação à base de bandeira para a resina de HA.
    3. Incubar os tubos sobre a roda rotativa durante a noite a 4 ° C.
    4. Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xg, a 4 ° C, o sobrenadante posto de lado e manter a 4 ° C até que o resultado do teste de eficiência de purificação (2.3.12.).
    5. Résuspender a resina de HA em 0,5 mL de tegn, transferir para um novo tubo de 1,5 ml de ligação baixa. Repetir a adição de ressuspensão uma vez com o mesmo tubo de 1,5 mL para evitar a perda de contas e de centrifugação 2 min a 1000 xg e 4 ° C. Remover o sobrenadante.
    6. Lavar as esferas 8 vezes usando 1 ml de cada vez tegn, centrifugação 2 min a 1000 xg e 4 ° C e remoção de sobrenadante (evitar perder grânulos). Após a última lavagem, transferir as contas em 0,5 ml tubos.
    7. Remover tanto sobrenadante quanto possível. Adicionar 100 ul de solução de HA péptido livre (4 mg / ml) a pH 7,8 em grânulos para eluir as proteínas ligadas. Incubar na roda rotativa durante a noite a 4 ° C.
      Nota: A quantidade de AH-péptido tem de ser ajustado dependendo da abundância dos complexos.
    8. Centrifugar durante 2 minutos a 1000 xg, a 4 ° C e transferir a resina e o sobrenadante (HA eluato) a uma coluna de centrifugação vazia colocada num tubo de 2 mL.
    9. Centrifugar a coluna para recolher o sobrenadante esquerda cima no tubo de 2 mL.
    10. Executar uma segunda eluição com 100 ul de péptido HA (4 mg / ml) para cada ponto experimental. Incubar na roda rotativa durante a noite a 4 ° C. Repita o passo 2.3.8 - 2.3.9 para coletar segunda eluição.
    11. Combine primeiro e segundo eluatos.
    12. Ensaio de eficiência de purificação por SDS-PAGE e coloração com prata (ver passos 2.2.) (Figura 1A).
    13. Concentra-se o eluato para HA 30 ul usando unidades de filtro centrífugo com cerca de 10 kDa de corte (limite de peso molecular nominal, NMWL) de acordo com as instruções do fabricante.
    14. Dividir as amostras concentradas em duas partes: 22,5 (3/4) e 7,5 (1/4) ul. Snap congelar 1/4 de amostras em azoto líquido e armazenar a -80 ° C. Use a parte 3/4 para a etapa 3.
      Nota: A parte congelada 1/4 é para ser usado para a confirmação dos resultados de espectrometria de massa por Western blot (ver passo 5.1).

Análise 3. Espectrometria de Massa

Nota: Os seguintes passos devem ser discutidos com a instalação de Espectrometria de Massa, que irá realizar a análise.

  1. Suplemento 3/4 (22,5 ul) das amostras com 7,5 ul de tampão de carga 4x e 10x 3,3 ul de agente de redução e ferver durante 5 min a 96 ° C.
  2. amostras de carga em um SDS-poliacrilamida 4 - gel a 12%. Executar gel a 150 V constante durante 5 min para permitir que todas as proteínas de entrar no gel de separação, sem.
  3. Lavar o gel com água; fixar para 20 - 30 min com a solução fixadora (10% de ácido acético, 50% de metanol, 40% de água ultra-limpo), em seguida, lavar o gel fixo 5 vezes em água ultra-limpo.
  4. Corte as bandas que contêm as proteínas de armazenamento, em 1 ml de água em um tubo de 1,5 ml e enviar a instalação de espectrometria de massa.

Análise 4. Dados

Nota: Esta é uma orientação geral para a análise. Os passos exactos dependerá do modo particular de os dados fornecidos pela instalação MSusado para realizar a análise (por exemplo, 21,22).

  1. Compare a lista das proteínas identificadas em eluatos "MyoD" com a lista obtida a partir de correspondente preparação de controlo negativo. Excluir a partir da análise das proteínas encontradas em ambas as listas.
  2. Eliminar as proteínas que têm ≤2 número total de peptídeos identificados a partir de lista restante.
  3. Acesso anotação funcional e classificação funcional da lista obtida de proteínas utilizando os recursos DAVID Bioinformática (http://david.abcc.ncifcrf.gov/home.jsp) e classificar a lista das proteínas 23,24.
  4. (Opcional) remover da lista de "caronas", encarregados proteínas não-nucleares com forte acidental vinculativas para carga negativa DNA 25. Estes contêm proteínas do citoesqueleto, citoplasmáticos, mitocondriais, membrana e receptores (dobramento de proteínas, as proteínas do grupo citoesqueleto e diversos em Tabelas 1 e 2).
  5. Comparar as listas obtidos dos interactores provenientes de fracções MyoD SE e NE para identificar proteínas e proteínas comuns específicos para cada fracção (Figura 2).

5. A confirmação de interactianos identificado por Western Blot

  1. Confirmação em HeLa-S3 Bandeira-HA-MyoD e HeLa-S3 Bandeira-HA
    1. Descongelar as amostras de eluato obtido no passo 2.3.14 (7,5 ul) em gelo. Adicionar 12 ul de tampão tegn, 10 ul de tampão de carga 4x e 10x 3 ul de agente redutor. amostras ferver durante 5 min a 96 ° C.
    2. Preparar amostras de entrada para a transferência de Western.
      1. Descongelar alíquotas dos passos 1.3.9 e 1.4.11 e medir a concentração de proteína, por exemplo, utilizando o kit BCA (siga as instruções do fabricante).
      2. Usar 15 jig de proteína por pista. Medir a quantidade apropriada do extracto e ajustar o volume da amostra até 15 ul com tampão de tegn.
      3. Adicionar 5 mL de buffer 4x carga e1,5 ul 10x agente redutor. amostras ferver durante 5 min a 96 ° C.
    3. Realizar uma análise de Western blot com anticorpos de interesse (específicos para o candidato parceiro identificados durante a análise MS), utilizando 15 ul de amostras de eluato. Use extractos de entrada como um controlo dos níveis endógenos de proteína (Figura 3A).
  2. Confirmação no Sistema Cellular Relevante
    1. Preparação do extracto nuclear total de mioblastos de rato C2C12.
      1. Cresça mioblastos C2C12 de rato em meio DMEM suplementado com 15% de soro fetal de vitelo, 100 U / ml de penicilina e 100 ug / ml de estreptomicina a 37 ° C e 5% de CO 2 num incubador húmido. Nunca exceda a confluência celular de 80% para manter as células em estado proliferativo.
      2. Crescer pelo menos dois pratos de 150 mm de C2C12 para um ponto (um anticorpo) de imunoprecipitação (IP). Aspirar o meio, lavar as células duas vezes com 10 ml de PBS.
      3. Raspe as células e recolher em tubo de 15 ml. Centrifuge a 250 xg durante 5 min a 4 ° C. sobrenadante de descarte.
      4. Estimar o volume do (= células V) da pelota celular. Suavemente ressuspender o sedimento em 3 volumes de células de V hipotónico tampão B para interromper membrana citoplasmática (Tabela 3).
      5. Adicionar o volume da célula de 0,44 V x de 10% de NP-40 para atingir a concentração final de 1% (v / v). Inverter cuidadosamente o tubo várias vezes para misturar.
      6. Adicionar o volume das células V 0,89 x de SR (Tabela 3) para preservar a integridade núcleos. Inverter cuidadosamente o tubo várias vezes para homogeneizar a suspensão e centrifuga-se durante 5 min a 2000 xg para sedimentar os núcleos.
      7. Remover o sobrenadante (fracção citosólica). Estimar o volume de sedimento núcleos (= V nuc). Pelete núcleos Ressuspender em um volume V nucA de tampão de sacarose.
      8. Adicionar gota a gota, enquanto se mistura cuidadosamente sobre um vórtice um volume V nucA de tampão de elevado teor de sal para obter uma concentração final de 300 mMDe NaCl, e incubar durante 30 min em gelo. Misture todos os 5 min.
      9. Adicionar um volume V nucA de tampão de sacarose (para diminuir a concentração de NaCl a 150 mM) e CaCl2 (1 mM de concentração final). Misturar.
      10. suspensão de pré-aquecimento durante 1 min a 37 ° C, adiciona-nuclease microcócica para obter final da concentração de 0,0025 U / mL (1/200 de estoque de 0,5 U / ul). Misturar.
      11. Incubar exactamente 12 minutos a 37 ° C. Misture a cada 3 min.
      12. Imediatamente coloque reacção em gelo e adicionar EDTA (concentração final 4 mM) para parar a atividade MNase. Incubar durante 5 min em gelo.
      13. Sonicar 5 vezes para cada 0,5 minutos em alta amplitude. Entre dois sonicações, permite uma quebra de 0,5 min (5 min no total).
      14. Ultra-centrifugação durante 30 min a 85000 xg e 4 ° C. Recolher o sobrenadante (extracto nuclear total).
      15. Medir a concentração de proteína do extracto nuclear total de, por exemplo, utilizando o kit BCA (siga as instruções do fabricante), e proceder immédiatEly para a etapa 5.2.2.
    2. A imunoprecipitação (IP) de MyoD endógena.
      1. Para pré-clara os extractos, lavar 10 ul de proteína G agarose para cada ponto de IP.
        1. Transferir o volume necessário de proteína G esferas de agarose para um tubo de 1,5 ml, ressuspender em 1,4 mL de tegn frio, centrifugar durante 2 minutos a 1800 x g e remover o sobrenadante. Repita 3 vezes.
      2. Misture pré-lavado esferas de Proteína G agarose com o volume apropriado de extracto nuclear total. Use 500 ug de proteína total extracto nuclear por ponto IP.
      3. Incubar numa roda rotativa, a 4 ° C durante 2 hr de pré-limpar os extractos.
      4. Centrifugar durante 5 min a 1800 xg, a 4 ° C. Mantenha sobrenadante.
      5. Misture 5 ug de MyoD Ab ou 5 ug de IgG de coelho com 500 ug extractos nucleares total de pré-apuradas em tubos de 1,5 ml de ligação baixas. Adicionar tampão tegn até 1 ml. Incubar numa roda rotativa, a 4 ° C durante a noite.
        Nota: Execute o fepois etapas durante o passo 5.2.2.3.
      6. Pré-lavagem 7,5 ul de proteína A / G solução grânulos Stock por ponto IP.
        1. Transferir o volume necessário de esferas em um tubo de 1,5 ml, grânulos ressuspender em 1 ml de tegn e centrifugar a 1800 xg, a 4 ° C durante 2 min. Remover o sobrenadante. Repita 3 vezes.
      7. / G esferas de proteína A ressuspender em 1,5 ml de solução (Tabela 3) e incuba-se numa roda rotativa de bloqueio durante a noite a 4 ° C.
      8. extractos nucleares totais Centrífuga incubadas com ABS (passo 5.2.2.5) a 16.000 xg durante 10 min a 4 ° C. Mantenha sobrenadante.
      9. Centrifugar bloqueado Uma proteína / g de resina (passo 5.2.2.7) a 1800 xg durante 2 min a 4 ° C. Descartar o sobrenadante e ressuspender em 1 ml de tampão de tegn. Re-centrifugar a 1800 xg durante 2 min a 4 ° C para lavar o tampão de bloqueio.
      10. Ressuspender bloqueado proteína A / g de resina em 1 ml de tampão e tegn aliquota em novos tubos de baixa ligação de proteína para se obter 7,5 blo ulproteína cked Uma resina / G por ponto IP. Centrifugar a 1800 xg, a 4 ° C durante 2 min e remover tanto quanto possível do sobrenadante.
      11. Adicionar os extractos nucleares totais incubadas com o Abs (ou IgG de controlo) para a resina A / G. Misturar e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente (TA) sobre uma roda rotativa.
      12. suspensão Centrífuga 1800 xg à temperatura ambiente durante 2 min. Elimine o sobrenadante, ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem e suspensão de transferência para novos tubos de ligação baixas. Incubar à temperatura ambiente numa roda rotativa durante 5 min.
      13. Centrifuga-se a suspensão à TA 1800 xg durante 2 min, ressuspender em 1 ml de tampão de lavagem e incubar à TA numa roda rotativa durante 5 min. Repita 4 vezes. Para a última transferência para a lavagem para um novo tubo de ligação baixa.
      14. Remover o máximo do sobrenadante. Adicionar 7 ul de tampão de lavagem, 7 uL de tampão de carga 4x e 10x 3 ul de agente de redução para os grânulos, misturar e deixar ferver durante 5 min a 96 ° C.
      15. Realizar uma análise de Western blot com anticorpos de interest (específico para o candidato parceiro para o imunológico precipitada proteína). Use 1% (5 ug) de extractos de entrada como um controlo dos níveis endógenos de proteína (Figura 3B).

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Results

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Para compreender a regulação da actividade MyoD, realizamos a caracterização exaustiva dos complexos MyoD usando purificação bioquímica, com base no imunopurificação de uma forma marcada com o dobro da MyoD seguido por espectrometria de massa (MS). A utilização da linha de células de HeLa-S3 que expressa Flag-MyoD marcada com HA e uma linha de células de controlo que expressam HA-autorizações de bandeira para obter material suficiente para purificar o complexo MyoD efectuando a purificaç...

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Discussion

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O método apresentado permite a identificação exaustiva de parceiros de um fator de transcrição, MyoD. Revelou parceiros MyoD num sistema heterólogo resistente a diferenciação induzida por MyoD, nomeadamente células de HeLa-S3. Assim, por definição, MyoD parceiros identificados são expressos ubiquamente. Estes incluem factores gerais e específicos de sequência de transcrição, enzimas modificadoras da cromatina, proteínas de processamento de RNA, quinases (Tabelas 1 e 2). Dado que as célu...

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Disclosures

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm nada a divulgar.

Acknowledgements

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

O trabalho no laboratório Ait-Si-Ali foi apoiado pela Association Française contre les Myopathies Téléthon (AFM-Téléthon); Instituto Nacional do Cancro (INCa); Agence Nationale de la Recherche (ANR), Fondation Association pour la Recherche sur le Cancer (Fondation ARC); Groupement des Entreprises Françaises pour la Lutte contre le Cancer (GEFLUC); CNRS; Université Paris Diderot e o "Quem sou eu?" Laboratório de Excelência #ANR-11-LABX-0071 financiado pelo governo francês por meio de seu programa ''Investimentos para o Futuro'' operado pela ANR sob a concessão #ANR-11-IDEX-0005-01. O EB foi apoiado por uma doação do INCA

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Linhagens celulares
HeLa-S3ATCCCCL-2.2
C2C12ATCCCRL-1772
Equipamento
SpinnerHomogeneizador 778531
:  Homogeneizador DounceWheaton432-1273 e 432-1271
Dispositivo de agitação para spinnersBellco778531
SonicatorDiagenodeUCD 200
HemocitômetroMarienfeld Superior 640610
Tubos de baixa ligaçãoSorenson27210
Coluna de rotação vaziaBio-Rad7326204
Reagents
SDS-polyacrylamide 4-12%  gelLife technologiesNP0336BOX
4x tampão de carregamento Life technologiesNP0007
Agente redutor 10xLife technologiesNP0004
Unidades de filtroLife technologiesA8592
, 10KMilliporeUFC501024
Protein G contas de agaroseSigma-AldrichP4691
Protein A/G  ResinaThermo Scientific53132
Resina de bandeira (gel de afinidade anti-Flag M2-agarose)Resina Sigma-AldrichA2220
HA (monoclonal Anti-HA agarose)Sigma-AldrichA2095
MNaseSigma-AldrichN3755
Peptídeo livre de bandeira (DYKDDDDK)Ansynth Service BVSíntese personalizadaRessuspender até 4 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Peptídeo livre de HA (YPYDVPDYA)Ansynth Service BVSíntese personalizadaRessuspender até 4 mg/ml em 50 mM Tris-HCl, pH 7,8
Kit de ensaio de proteína à base de ácido bicinchonínico : Kit BCAThermo Scientific23225
Inibidores de proteaseSigma-AldrichS8830
Substrato HRP de quimioluminescência aprimorada (ECL) à base de luminolTecnologias de vida34075
BSASigma-AldrichA9647
DNA de esperma de salmão cisalhado (sal de sódio do ácido desoxirribonucléico dos testículos de salmão)Sigma-AldrichD1626
Cloridrato de esperminaSigma-AldrichS1141
EspermidinaSigma-AldrichS0266
GlicerolSigma-AldrichG5516
PBSSigma-AldrichD8537
MOPS buffer de corridaLife technologiesNP0001
DMEM (alta glicose)Sigma-AldrichD0822Pré-aquecido  a 37 ° C antes
de usar Tripsina-EDTA (0,05% fenol vermelho SoroLife technologies25300-054
GEhealthcare life sciences PAA A15-102Cada lote de soro deve ser testado primeiro para suas células.
Penicilina e estreptomicina Life technologies15140-122
Solução Azul de Tripano, 0,4%Life technologies15250-061
Água (filtrada estéril)Sigma-AldrichW3500
Anticorpos
HA de rato (12CA5)Bandeira 11583816001
Sigma-AldrichA8592
MyoDSanta Cruzsc-32758Para usar para western blotting
MyoDSanta CruzSC-760Para usar para imunoprecipitação e western blotting
CBFbetaSanta CruzFL-182 
HP1alphaEuromedex2HP2G9
HP1betaEuromedex1MOD1A9AS
HP1gammaEuromedex2MOD1GC
Suv39h1Tecnologia de Sinalização Celular8729
BAF47BD Biosciences612111
Myf5Santa CruzSC-302
TubulinaSigma-AldrichT9026
ActinSigma-AldrichA5441
IgG MouseSanta CruzSC-2025
IgG CoelhoSanta CruzSC-2027
Cabra anti-rato -HRPSigma-AldrichA9037
Cabra anti-coelho -HRPSigma-AldrichA6154 
Cabra anti-rato -HRPSigma-AldrichA4416
Corning Kit de coloração de prata centrífugo Roche

References

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Ait-Si-Ali, S., et al. A Suv39h-dependent mechanism for silencing S-phase genes in differentiating but not in cycling cells. Embo J. 23 (3), 605-615 (2004).
  2. Buckingham, M. Skeletal muscle development and the role of the myogenic regulatory factors. Biochem Soc Trans. 24 (2), 506-509 (1996).
  3. Arnold, H. H., Winter, B. Muscle differentiation: more complexity to the network of myogenic regulators. Curr Opin Genet Dev. 8 (5), 539-544 (1998).
  4. Buckingham, M. Skeletal muscle formation in vertebrates. Curr Opin Genet Dev. 11 (4), 440-448 (2001).
  5. Yun, K., Wold, B. Skeletal muscle determination and differentiation: story of a core regulatory network and its context. Curr Opin Cell Biol. 8 (6), 877-889 (1996).
  6. Molkentin, J. D., Olson, E. N. Defining the regulatory networks for muscle development. Curr Opin Genet Dev. 6 (4), 445-453 (1996).
  7. Arnold, H. H., Braun, T. Targeted inactivation of myogenic factor genes reveals their role during mouse myogenesis: a review. Int J Dev Biol. 40 (1), 345-353 (1996).
  8. Puri, P. L., Sartorelli, V. Regulation of muscle regulatory factors by DNA-binding, interacting proteins, and post-transcriptional modifications. J Cell Physiol. 185 (2), 155-173 (2000).
  9. Tapscott, S. J. The circuitry of a master switch: Myod and the regulation of skeletal muscle gene transcription. Development. 132 (12), 2685-2695 (2005).
  10. Lassar, A. B., Paterson, B. M., Weintraub, H. Transfection of a DNA locus that mediates the conversion of 10T1/2 fibroblasts to myoblasts. Cell. 47 (5), 649-656 (1986).
  11. Davis, R. L., Weintraub, H., Lassar, A. B. Expression of a single transfected cDNA converts fibroblasts to myoblasts. Cell. 51, 987-1000 (1987).
  12. Tapscott, S. J., et al. MyoD1: a nuclear phosphoprotein requiring a myc homology region to convert fibroblasts to myoblasts. Science. 242, 405-411 (1988).
  13. Weintraub, H., et al. Activation of muscle-specific genes in pigment, nerve, fat, liver, and fibroblast cell lines by forced expression of MyoD. Proc Natl Acad Sci U S A. 86 (14), 5434-5438 (1989).
  14. Mal, A., Harter, M. L. MyoD is functionally linked to the silencing of a muscle-specific regulatory gene prior to skeletal myogenesis. Proc Natl Acad Sci U S A. 100 (4), 1735-1739 (2003).
  15. Ohkawa, Y., Marfella, C. G., Imbalzano, A. N. Skeletal muscle specification by myogenin and Mef2D via the SWI/SNF ATPase Brg1. Embo J. 25 (3), 490-501 (2006).
  16. Ling, B. M., et al. Lysine methyltransferase G9a methylates the transcription factor MyoD and regulates skeletal muscle differentiation. Proc Natl Acad Sci U S A. 109 (3), 841-846 (2012).
  17. Zhang, C. L., McKinsey, T. A., Olson, E. N. Association of class II histone deacetylases with heterochromatin protein 1: potential role for histone methylation in control of muscle differentiation. Mol Cell Biol. 22 (20), 7302-7312 (2002).
  18. Forcales, S. V., et al. Signal-dependent incorporation of MyoD-BAF60c into Brg1-based SWI/SNF chromatin-remodelling complex. The EMBO journal. 31 (2), 301-316 (2011).
  19. Nakatani, Y., Ogryzko, V. Immunoaffinity purification of mammalian protein complexes. Methods Enzymol. 370, 430-444 (2003).
  20. Ouararhni, K., et al. The histone variant mH2A1.1 interferes with transcription by down-regulating PARP-1 enzymatic activity. Genes Dev. 20 (23), 3324-3336 (2006).
  21. Fritsch, L., et al. A subset of the histone H3 lysine 9 methyltransferases Suv39h1, G9a, GLP, and SETDB1 participate in a multimeric complex. Mol Cell. 37 (1), 46-56 (2010).
  22. Robin, P., Fritsch, L., Philipot, O., Svinarchuk, F., Ait-Si-Ali, S. Post-translational modifications of histones H3 and H4 associated with the histone methyltransferases Suv39h1 and G9a. Genome Biol. 8 (12), R270(2007).
  23. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID bioinformatics resources. Nat Protoc. 4 (1), 44-57 (2009).
  24. Huang da, W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists. Nucleic Acids Res. 37 (1), 1-13 (2009).
  25. Ohta, S., et al. The protein composition of mitotic chromosomes determined using multiclassifier combinatorial proteomics. Cell. 142 (5), 810-821 (2010).
  26. Yahi, H., et al. Differential cooperation between heterochromatin protein HP1 isoforms and MyoD in myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).
  27. Philipot, O., et al. The core binding factor CBF negatively regulates skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 5 (2), (2010).
  28. Joliot, V., et al. The SWI/SNF subunit/tumor suppressor BAF47/INI1 is essential in cell cycle arrest upon skeletal muscle terminal differentiation. PloS one. 9 (10), e108858(2014).
  29. Tanese, N. Small-scale density gradient sedimentation to separate and analyze multiprotein complexes. Methods. 12 (3), 224-234 (1997).
  30. Singh, K., et al. A KAP1 phosphorylation switch controls MyoD function during skeletal muscle differentiation. Genes Dev. 29 (5), 513-525 (2015).
  31. Cong, L., et al. Multiplex genome engineering using CRISPR/Cas systems. Science. 339 (6121), 819-823 (2013).
  32. Yahi, H., Philipot, O., Guasconi, V., Fritsch, L., Ait-Si-Ali, S. Chromatin modification and muscle differentiation. Expert Opin Ther Targets. 10 (6), 923-934 (2006).
  33. Sun, L., Liu, L., Yang, X. J., Wu, Z. Akt binds prohibitin 2 and relieves its repression of MyoD and muscle differentiation. J Cell Sci. 117. 117 (Pt 14), 3021-3029 (2004).
  34. Caretti, G., et al. The RNA helicases p68/p72 and the noncoding RNA SRA are coregulators of MyoD and skeletal muscle differentiation. Dev Cell. 11 (4), 547-560 (2006).
  35. Knoepfler, P. S., et al. A conserved motif N-terminal to the DNA-binding domains of myogenic bHLH transcription factors mediates cooperative DNA binding with pbx-Meis1/Prep1. Nucleic Acids Res. 27 (18), 3752-3761 (1999).
  36. Albini, S., Puri, P. L. SWI/SNF complexes, chromatin remodeling and skeletal myogenesis: it's time to exchange! Exp Cell Res. 316 (18), 3073-3080 (2010).
  37. Yahi, H., Fritsch, L., Philipot, O., Guasconi, V., Souidi, M., Robin, P., Polesskaya, A., Losson, R., Harel-Bellan, A., Ait-Si-Ali, S. Differential Cooperation between Heterochromatin Protein HP1 Isoforms and MyoD in Myoblasts. J Biol Chem. 283 (35), 23692-23700 (2008).

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