Murino Hind Limb Ossos Longos Dissecção e Medula Óssea O isolamento

Resumo

Aqui apresentamos um protocolo para a dissecção de ossos longos de membros posteriores (fêmures e tíbias) do camundongo de laboratório. Descrevemos ainda uma técnica rápida para isolamento da medula óssea desses ossos que utiliza centrifugação para remoção da medula óssea do espaço da medula óssea.

Resumo

A investigação do osso e da medula óssea é crítica em muitos campos de pesquisa, incluindo biologia óssea básica, imunologia, hematologia, metástase de câncer, biomecânica e biologia de células-tronco. Apesar da importância do osso em estados saudáveis e patológicos, no entanto, é um órgão amplamente pouco pesquisado devido à falta de conhecimento especializado sobre dissecção óssea e isolamento da medula óssea. Os camundongos são um organismo modelo comum para estudar os efeitos no osso e na medula óssea, necessitando de um método padronizado e eficiente para dissecção de ossos longos e isolamento da medula óssea para processamento de grandes coortes experimentais. Descrevemos um procedimento de dissecção simples para a remoção do fêmur e da tíbia que é adequado para aplicações a jusante, incluindo, mas não se limitando a, análise histomorfológica e teste de força. Além disso, descrevemos um procedimento rápido para isolamento da medula óssea dos ossos longos por centrifugação com tempo de manuseio limitado, ideal para classificação de células, cultura de células primárias ou extração de DNA, RNA e proteínas. O protocolo é simplificado para processamento rápido de amostras para limitar o erro experimental e é padronizado para minimizar a variabilidade de usuário para usuário.

Introdução

O estudo dos ossos longos e das células da medula óssea é fundamental para uma infinidade de disciplinas de pesquisa, incluindo, mas não se limitando a, biologia óssea, biologia do câncer, imunologia, hematologia e biomecânica. O osso é um órgão altamente dinâmico que, juntamente com a cartilagem, forma o esqueleto para fornecer suporte mecânico contra carga e proteção dos órgãos internos. Além disso, os componentes minerais do osso são um sumidouro de armazenamento para as moléculas sinalizadoras críticas cálcio e fósforo, além de outros fatores¹. Finalmente, os ossos abrigam a medula óssea e, juntamente com osteoblastos formadores de osso metabolicamente ativos e osteoclastos de reabsorção óssea, fornecem o nicho de células-tronco necessário para a manutenção das populações de células hematopoiéticas e linfóides.

O osso e a medula óssea são afetados em muitos distúrbios, muitas vezes levando à disfunção da medula óssea, dor óssea intensa e fratura patológica. O osso é um local comum de metástase em muitos tumores sólidos, principalmente câncer de mama e câncer de próstata, onde as células tumorais envolvem diretamente o nicho da medula óssea para iniciar o ciclo vicioso de metástase óssea e deslocar células-tronco hematopoiéticas^2,3. As neoplasias hematopoiéticas, incluindo mieloma e leucemia, são caracterizadas por disfunção da medula óssea, bem como desregulação da remodelação óssea saudável¹. Outros distúrbios esqueléticos não malignos também são áreas ativas de pesquisa, como osteoartrite, osteoporose, escoliose e raquitismo. Mesmo em um indivíduo saudável, a falha biomecânica em um osso leva a uma fratura dolorosa. Todos esses distúrbios representam áreas ativas de pesquisa com o objetivo de identificar novas medidas preventivas e regimes de tratamento para reduzir a morbidade e a mortalidade.

Para pesquisar a infinidade de papéis do osso e da medula óssea, tanto em condições fisiológicas quanto patológicas, é fundamental que os pesquisadores tenham um método padronizado simples e eficiente para dissecação dos ossos longos do camundongo para processamento rápido de grandes experimentos in vivo. O protocolo de dissecção descrito aqui é adequado para todas as análises de ossos longos, incluindo imagens ex vivo, histologia, histomorfometria e testes de força, entre outros. Da mesma forma, um método padronizado de isolamento da medula óssea com alta recuperação de células da medula óssea e baixa variabilidade entre usuários é importante para análises experimentais, como classificação de células ativadas por fluorescência (FACS) ou PCR quantitativo (qPCR), bem como aplicações a jusante, como cultura de células primárias de células da medula óssea.

Protocolo

Todo o trabalho com animais foi aprovado pelo Comitê Institucional de Cuidados e Uso de Animais de acordo com as recomendações descritas no Guia para o Cuidado e Uso de Animais de Laboratório dos Institutos Nacionais de Saúde.

1. Dissecção de ossos longos de membros posteriores

1. Eutanásia do camundongo de acordo com as diretrizes institucionais.
2. Posicione o mouse em decúbito dorsal e fixe prendendo as quatro pernas nas almofadas das patas do mouse abaixo da articulação do tornozelo.
3. Pulverize o mouse com etanol 70%, molhando completamente as pernas.
4. Faça uma pequena incisão à direita da linha média na parte inferior do abdômen, logo acima do quadril.
5. Estenda a incisão pela perna e passe pela articulação do tornozelo.
6. Puxe a pele para trás e corte o músculo quadríceps ancorado na extremidade proximal do fêmur para expor o lado anterior do fêmur e prender a perna, colocando o pino em um ângulo de 45 graus em relação à placa.
7. Com a lâmina da tesoura contra a parte posterior do fêmur, corte os isquiotibiais da articulação do joelho.
8. Puxe para trás a pele e os músculos isquiotibiais ancorados na extremidade proximal do fêmur para expor o lado posterior do fêmur e prenda a perna, colocando o pino em um ângulo de 45 graus em relação à prancha.
9. Com a pinça, segure a extremidade distal do fêmur, logo acima da articulação do joelho. Guie as lâminas da tesoura em ambos os lados da diáfise femoral em direção à articulação do quadril, tomando cuidado para não cortar o próprio fêmur.
10. Após atingir a cabeça femoral, indicada pela abertura leve da tesoura, gire a tesoura com a lâmina superior da tesoura movendo-se diretamente sobre a cabeça femoral para deslocar o fêmur, tomando cuidado para não quebrar o osso abaixo da cabeça femoral.
11. Segure a parte superior da diáfise femoral com a pinça, corte o tecido mole da cabeça do fêmur para liberá-lo do acetábulo.
12. Puxe todo o osso da perna, incluindo fêmur, joelho e tíbia, para cima e para longe do corpo, cortando cuidadosamente o tecido conjuntivo e o músculo que conecta a perna à pele.
13. Estenda demais a articulação do tornozelo e use novamente a tesoura em um movimento de torção para deslocar a tíbia.
14. Agarrando a extremidade distal da tíbia, tomando cuidado para não cortar os tendões, puxe a tíbia para cima e para longe do corpo e da placa de pinos.
15. Corte qualquer tecido conjuntivo restante que prenda o osso longo ao camundongo no joelho.
16. Remova qualquer músculo adicional ou tecido conjuntivo ligado ao fêmur e à tíbia.
17. Para quaisquer aplicações que exijam que o osso permaneça intacto (histologia, histomorfometria, testes biomecânicos, etc.), prossiga com protocolos internos padrão (como em ^4-7). Para isolar a medula óssea, prossiga para a seção 2.

2. Preparação de ossos longos para isolamento da medula óssea

1. Usando a pinça, segure o fêmur com a patela voltada para longe e a extremidade proximal (cabeça femoral) para baixo.
2. Estenda demais a articulação do joelho e use a tesoura em um movimento de torção para deslocar a tíbia e o fêmur.
3. Corte qualquer tecido conjuntivo que mantenha o fêmur e a tíbia juntos.
4. Usando a pinça, segure o fêmur com o lado anterior voltado para longe e a extremidade proximal (extremidade da cabeça femoral) para baixo.
5. Guie a tesoura pela diáfise femoral até os côndilos.
6. Gire suavemente a tesoura para frente e para trás para remover os côndilos, a patela e a epífise para expor a metáfise.
7. Remova qualquer músculo adicional ou tecido conjuntivo preso ao fêmur usando fórceps, tesouras e Kimwipes.
8. Usando a pinça, segure a tíbia com o lado anterior voltado para longe e a extremidade distal (extremidade do tornozelo) para baixo.
9. Se a epífise tibial estiver intacta, guie a tesoura pela haste da tíbia até os côndilos.
10. Gire suavemente a tesoura para frente e para trás para remover os côndilos e a epífise para expor a metáfise.
11. Remova qualquer músculo adicional ou tecido conjuntivo preso à tíbia usando fórceps, tesouras e Kimwipes.

3. Isolamento da medula óssea

1. Empurre uma agulha de 18 G pelo fundo de um tubo de microcentrífuga de 0,5 ml.
2. Coloque os ossos longos (máximo de 2 fêmures e 2 tíbias) no tubo, com a extremidade do joelho para baixo e para baixo e feche a tampa.
3. Encaixe o tubo de microcentrífuga de 0,5 ml em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Centrifugue os tubos aninhados a ≥ 10.000 x g em uma microcentrífuga por 15 segundos.
5. Verifique se a medula óssea foi arrancada dos ossos por inspeção visual. Os ossos devem parecer brancos e deve haver um grande pellet visual no tubo maior.
6. Rejeitar o tubo de microcentrífuga de 0,5 ml com os ossos.
7. Suspenda a medula óssea em solução apropriada (por exemplo, PBS, meio de cultura, tampão FACS) e prossiga com o protocolo experimental (isolamento de DNA, RNA ou proteína, análise FACS ou cultura de células primárias).

Resultados

O protocolo descrito aqui é otimizado para dissecção rápida do fêmur e tíbia do camundongo com um mínimo de danos ao tecido ósseo. Essa técnica é adequada para uma série de análises a jusante, incluindo estudos biomecânicos, histomorfometria (Figura 1A - B) e histologia (Figura 1C)^4,7. A reconstrução histomofométrica representativa do micoCT 3D (Figura 1A - B) demonstra que tanto o osso esponjoso quanto a casca cortical são mantidos, o que permite a quantificação precisa dos parâmetros estruturais padronizados para histomorfometria óssea, incluindo número, espessura e espaçamento trabecular; volume ósseo; e espessura cortical, entre outras medidas⁸. O corte histológico representativo mostra uma tíbia fixada em formalina e descalcificada corada com H&E (Figura 1C). A imagem demonstra a integridade do osso calcificado e da medula óssea celular para análise histológica.

O procedimento de isolamento da medula óssea preserva a esterilidade do espaço da medula óssea, tem baixo manuseio para reduzir a contaminação e não requer corte do osso longo, reduzindo assim a perda de rendimento da medula óssea. Esta medula óssea é adequada para muitas aplicações a jusante, incluindo análises de citometria de fluxo⁵ e PCR. Além disso, esse procedimento pode ser usado para isolar a medula óssea para cultura de células primárias de células da medula óssea, incluindo osteoclastos e osteoblastos (Figura 2A - B)^4,6.

Figura 1. Análises histomorfológicas e histológicas de ossos longos de camundongos. Reconstrução tridimensional por microTC de uma tíbia de camundongo mostrando (A) a concha cortical externa e (B) o osso trabecular (barra de escala = 0,5 mm). (C) Coloração histológica de H&E de uma tíbia descalcificada e seccionada (4x). Imagens cortesia de Katherine Weilbaecher, Escola de Medicina da Universidade de Washington, EUA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Figura 2. Cultura primária de células da medula óssea para diferenciação de osteoclastos e osteoblastos. (A) Coloração TRAP para osteoclastos multinucleados após 7 dias em meio osteoclastogênico (4x). (B) Fosfatase alcalina (cor roxa) para osteoblastos e coloração vermelha de alizarina (cor vermelha) para mineralização após 21 dias em meio osteogênico. Imagens cortesia de Katherine Weilbaecher, Escola de Medicina da Universidade de Washington, EUA. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

Apresentamos um método simples e eficiente para remoção de ossos longos posteriores de camundongos e subsequente isolamento da medula óssea. Este método mantém a alta integridade estrutural e celular dos ossos e da medula óssea e tem baixo tempo de manuseio, minimizando a probabilidade de fratura induzida pelo usuário ou escore ósseo que pode influenciar as análises a jusante. Além disso, o método de centrifugação para isolar a medula óssea não requer o corte do osso para expor o espaço da medula óssea ou fluido para lavar a medula óssea, reduzindo os pontos potenciais de contaminação. Além disso, a técnica de centrífuga é de rendimento relativamente alto com menor tempo de prática do que outros métodos, reduzindo assim o tempo de processamento.

A alta variação é inerente aos estudos in vivo em camundongos devido à alta variação fenotípica de camundongo para camundongo. Para maximizar o impacto da pesquisa de estudos caros e trabalhosos com camundongos, é fundamental minimizar o erro técnico experimental^9,10. O tempo desde o sacrifício do animal até a análise a jusante ou fixação do tecido introduz variações experimentais que podem superar mudanças sutis e reduzir grandes diferenças entre os grupos. Portanto, o processamento rápido de amostras é essencial para uma análise precisa dos dados. As técnicas de dissecção de ossos longos e isolamento da medula óssea descritas aqui são otimizadas para processamento rápido de animais e amostras para reduzir a variação técnica.

Este protocolo pode ser amplamente aplicado a muitos campos de pesquisa, incluindo a investigação do próprio tecido ósseo ou interrogação das células da medula óssea. Além disso, essa abordagem direta para a dissecção de ossos longos permitirá que pesquisadores em áreas relacionadas interroguem diretamente as contribuições ósseas, a fim de expandir nosso conhecimento sobre a disfunção da medula óssea em patologias pouco estudadas.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Pinboard Pins
70% Etanol
Tesoura de dissecação
Pinça
Kimwipes	Kimberly-Clark	34120
16 G agulha
1,5 ml Tubo
0,5 ml Tubo
Microcentrífuga