Uma nova abordagem para avaliar o resultado Motor de profunda do cérebro dos efeitos de estimulação no Rato Hemiparkinsonian: Escadaria e cilindro de ensaio

Resumo

A estimulação cerebral profunda (DBS) é uma opção de tratamento eficaz para a doença de Parkinson. Estabelecemos um desenho de estudo para rastrear novos paradigmas de estimulação em ratos. O protocolo descreve o uso do teste da escada e do teste do cilindro para avaliação do resultado motor em ratos hemiparkinsonianos tratados com DBS.

Resumo

A estimulação cerebral profunda do núcleo subtalâmico é uma opção de tratamento eficaz para a doença de Parkinson. Em nosso laboratório foi estabelecido um protocolo para a tela diferentes padrões de neuroestimulação no hemiparkinsonian (unilateral lesionado) ratos. Ela consiste na criação de lesão um unilateral de Parkinson através da injecção de 6-hidroxidopamina (6-OHDA) no feixe do cérebro anterior medial direito, implantação de eléctrodos de estimulação crónica para o núcleo subtalâmico e a avaliação dos resultados do motor no fim de períodos de 24 h de neuro-estimulação externa ligada ao cabo . A estimulação foi realizada com a estimulação de corrente constante. A amplitude foi ajustado de 20% abaixo do limiar individual para efeitos colaterais. A avaliação dos resultados do motor foi feito pela avaliação do uso pata espontânea no teste do cilindro de acordo com Shallert e pela avaliação do especialista atingindo no teste de escada de acordo com Montoya. Este protocolo descreve em detalhes a formação na caixa da escada, o cylinder teste, bem como o uso de tanto em ratos hemiparkinsonian. O uso de ambos os testes é necessário, porque o teste de escada parece ser mais sensível para a deficiência de habilidade motora fina e apresenta maior sensibilidade a alterações durante neuroestimulação. A combinação do modelo de Parkinson unilateral e os dois testes comportamentais permite a avaliação de diferentes parâmetros de estimulação de uma forma padronizada.

Introdução

A estimulação cerebral profunda do núcleo subtalâmico (STN) é uma opção de tratamento eficaz para a doença ¹ e outro movimento distúrbios de Parkinson. Os mecanismos subjacentes ainda são pouco compreendidas e multifactorial, mas uma característica fundamental é a modulação da actividade de rede neuronal por despolarização repetitivo de axónios na vizinhança do eléctrodo estimulante ^2-4. estimulação de alta frequência (> 100 Hz) é necessário para um efeito benéfico na maioria dos objectivos do cérebro e para a maioria das indicações de DBS. Os efeitos colaterais do resultado estimulação cerebral profunda da coativação inadvertida de outras fibras, que são cobertos pelo volume de estimulação e que subserve funções diferentes, tais como o trato piramidal. Por isso, seria desejável desenvolver parâmetros de estimulação, que activam preferencialmente os elementos neurais benéficos, evitando ao mesmo tempo o efeito elementos de coativação lateral ^5,6. Embora neurofisiologia podem oferecer tais tuni finaopções ng de DBS, o progresso científico tem sido mínima durante as últimas duas décadas, porque estratégias de programação fundamentalmente foram avaliados por "tentativa e erro" em pacientes e restrita pelas opções de programação limitado de dispositivos DBS disponíveis comercialmente, em vez de usar uma visão neurofisiológica e definiu as configurações experimentais para explorar sistematicamente o espaço de parâmetros completo.

Para superar o obstáculo de translação em pesquisa DBS estamos propondo um protocolo para a tela parâmetros de estimulação alternativos em modelos de roedores de parkinsonismo antes da exploração clínica. Doença unilateral de Parkinson em ratos é modelada usando injeções de 6-hidroxidopamina no feixe do cérebro anterior medial direito ^7,8. A lesão resultante, descrito mais como hemiparkinsonian, é avaliada no teste de apomorfina pela avaliação da pontuação rotação após a injeção de apomorfina dose baixa e confirmou post mortem por tirosina hidroxilase immunohistochemistry. O método é fácil de aplicar e altamente reprodutível, tendo ao mesmo tempo uma baixa mortalidade e morbilidade. Os défices motores resultantes são muito discreta ^7,8; os animais exibem uma ligeira deterioração da pata esquerda contralateral tanto durante a exploração espontânea e apreensão complexo comportamento ^9,10.

Para avaliar a eficácia dos protocolos de estimulação profunda do cérebro são necessários testes que permitem medir uma mudança rápida e de confiança no desempenho do motor e pode ser repetido ao longo do tempo com diferentes configurações de neuroestimulação. Vários grupos propuseram diferentes abordagens de estimulação e testes diferentes para avaliar as funções motoras em ratos ¹¹ com resultados altamente variáveis ​​e inconsistentes ^11-14. Isso obrigou-nos a escolher um conjunto de testes com alta prever validade e complementaridade. Além disso, para avaliação dos resultados de motor sob condições de estimulação profunda do cérebro, os testes foram favorecidos que poderia ser realizada por animals conectado via cabo ao gerador de estímulos. Para estes fins, nós estabelecemos nossa bateria de testes consiste em um teste para uso pata assimetria e um teste para alcançar qualificado. O desenho do estudo é ilustrada na Figura 1.

Para uso espontânea da pata foi realizado o ensaio descrito por cilindro Shallert ^15, que é um teste amplamente utilizado para a utilização da pata durante a exploração vertical. Sem treino do animal é necessária. Para a avaliação do comportamento de apego mais complexo que estabeleceu o teste de escada de acordo com Montoya ^16. Nosso protocolo é modificado de acordo com Kloth ^17. Os ratos são treinados durante um período de doze dias para atingir pelotas na caixa de teste. Após o período de treino, o teste pode ser aplicado para medir o comportamento complexo agarramento por contagem da taxa de sucesso descrito como o número de peletes consumidos. O artigo apresenta o treinamento detalhado na caixa da escada, bem como o desempenho de ambos behtestes avioral sob naïve, hemiparkinsonian e condições de estimulação profunda do cérebro.

Protocolo

Experiências com animais foram aprovados pela Universidade de Wuerzburg e as autoridades estaduais legais de Lower Franconia, de acordo com as diretrizes de proteção animal e orientações Comunidades Europeias do Conselho (número da aprovação: 55,2-2531,01 76/11). Todos os esforços foram feitos para minimizar a dor ou desconforto dos animais utilizados.

Nota: O implante de eléctrodo foi realizada como descrito em outro lugar ^18.

1. Cilindro de ensaio (figura 2)

1. Preparar um cilindro de vidro de plástico transparente (altura: 40 cm, diâmetro: 19 cm) com a limpeza do cilindro com uma solução de ácido acético a 0,1%.
2. Prepare cartas com data de experimento e número de identificação de cada rato.
3. Coloque dois espelhos em ângulo de 90 ° atrás do cilindro.
4. Coloque a câmara em frente do cilindro de tal modo que a distância entre a câmara e o cilindro permite uma boa visão das patas.
5. Coloque o rato na caixa de transporte.
   Nota: Os animais devem ser manuseados pelo experimentador antes do ensaio a fim de evitar o stress.
6. Transportar o rato da gaiola para o cilindro usando a caixa de transporte.
7. Colocar o rato dentro do cilindro (Figura 3).
   1. Sempre realizar todos os testes comportamentais, ao mesmo tempo do dia para evitar diferenças circadianos na actividade. Se o animal está ligado ao gerador de estímulos por cabo, verifique se o cabo não está torcido durante o experimento.
8. Pressione o botão "record" na câmera. Mostrar o cartão com a data real da experiência e número de identificação do rato para a câmera. Comece a gravar.
9. Depois de cinco minutos, retire o animal do cilindro e colocá-lo de volta para a gaiola usando a caixa de transporte.
10. Limpar o cilindro com uma solução de ácido acético a 0,1%.
11. Avaliar o uso da pata do vídeo gravado pela contagem dos contatos esquerda e direita parede paw (uso pata no por cento), bem como rbrincos (em pé sobre as patas traseiras, com ou sem apoio na parede do cilindro). O teste do cilindro pode também ser avaliado automaticamente por um software adequado.
    Nota: Um rato saudável usa ambas as patas de forma igual. O rato hemiparkinsonian usa a pata afetada devido à lesão em menor grau.

2. Escada de ensaio (figura 4)

1. fase de aquisição
   1. Um dia antes da formação familiarizar os animais com os peletes utilizados no teste em escada.
      1. Opcional: Para aumentar a motivação do animal usar uma restrição dietética (10-15 g de ração de laboratório padrão para manter o peso corporal em 90% do nível de alimentação livre de ^16). No entanto, isto não é obrigatório para conseguir um efeito positivo de treinamento. Este estudo foi realizado sem restrição alimentar.
   2. Prepare uma caixa de escada de vidro transparente de plástico (altura: 34,5 cm, comprimento: 35,5 cm, largura: 12 cm e estreito compartimento 6 cm) com a limpeza da caixa com uma ac 0,1%solução de ácido etic. Nota: A caixa de escada é um de dois compartimentos-box com uma plataforma elevada e duas escadas no compartimento estreito. As etapas restantes na escada no compartimento estreita só pode ser alcançado com a pata esquerda, os passos certos única com a pata direita.
      Nota: As caixas de escada padrão consiste de dois compartimentos com uma tampa, se é para ser usado para as experiências com ratos estimulados através de um cabo, usar uma caixa de alta sem tampa.
   3. Remover a escada e encher os poços em cada passo com oito 45 mg de pellets.
   4. Insira a escada e colocar oito pelotas adicionais sobre a plataforma elevada.
   5. Coloque o rato na caixa de transporte.
   6. Transportar o rato da gaiola para a caixa de escada usando a caixa de transporte.
   7. Colocar o rato na caixa de escada (Figura 5).
   8. Depois de cinco minutos, retire o animal da caixa de escada e colocá-lo de volta para a gaiola usando a caixa de transporte.
   9. Observe quantaspelotas foram comidos de plataforma e (eventualmente) a partir de escada direita e esquerda.
   10. Encha novamente a escada, preenchendo os poços em cada etapa com oito 45 mg de pellets.
   11. Limpar a caixa de escada com uma solução de ácido acético a 0,1% e colocar as pelotas adicionais sobre a plataforma.
   12. Repita este procedimento (fase de aquisição) três dias seguidos.
       Nota: Todas as experiências descritas foram realizadas em ratos macho Sprague Dawley. A duração dos diferentes módulos de formação pode ser diferente em ratos de diferentes tensão, sexo e vender.
2. Teste de Livre Escolha
   1. Limpar a caixa de escada com uma solução de ácido acético a 0,1%.
   2. Remover a escada e encher os poços em cada passo com oito 45 mg de pellets.
   3. Coloque o rato na caixa de transporte.
   4. Transportar o rato da gaiola para a caixa de escada usando a caixa de transporte.
   5. Coloque o rato na caixa da escada.
   6. Depois de cinco minutos, remover o animal da escadacaixa de caso e colocá-lo de volta para a gaiola usando a caixa de transporte.
      Observe quantas pelotas foram comidos de escada direita e esquerda.
   7. Nota: Se os animais ainda têm problemas com agarrar pellet, adicione um pouco mais sobre a plataforma onde podem ser facilmente alcançado.
   8. Encha novamente a escada, preenchendo os poços em cada etapa com oito 45 mg de pellets.
   9. Limpar a caixa de escada com uma solução de ácido acético a 0,1% para o próximo animal.
   10. Repita este procedimento (fase de escolha livre), três dias seguidos.
       Nota: Os resultados apresentados foram obtidos por formação conduzida sem um período de descanso entre os módulos. Alguns grupos preferem um dia de descanso para a consolidação, para apoiar o processo de formação.
3. Teste de escolha forçada
   1. Limpar a caixa de escada com uma solução de ácido acético a 0,1%.
   2. Retirar a escada e encher os poços em cada passo na escada esquerda, com oito (primeiros três dias do módulo) ou quatro (thr consecutivodias ee do módulo) 45 mg de pellets.
      1. Realizar o teste de escolha forçada na lateral, onde o comprometimento irá ocorrer.
         Nota: Realizamos a lesão Parkinson no hemisfério direito e, portanto, treinar selectivamente a pata esquerda.
   3. Coloque o rato na caixa de transporte.
   4. Transportar o rato da gaiola para a caixa de escada usando a caixa de transporte.
   5. Coloque o rato na caixa da escada.
   6. Depois de cinco minutos, retire o animal da caixa de escada e colocá-lo de volta para a gaiola usando a caixa de transporte.
   7. Observe quantas pelotas foram comidos da escada esquerda.
   8. Encha novamente a escada, preenchendo os poços em cada etapa com oito ou quatro de 45 mg de pellets (número de pelotas depende dia de treinamento).
   9. Limpar a caixa de escada com uma solução de ácido acético a 0,1% para o próximo animal.
   10. Repita este procedimento (fase de escolha forçada) seis dias seguidos.
4. Aquisição de dados
   1. Realizar a experiência como se descreveu para o módulo de escolha forçada (quatro pastilhas em cada poço na escada da esquerda) em dois dias consecutivos. Calcula-se a taxa de sucesso (granulados comidos número de) como a média dos dois dias.

Resultados

Todos os animais foram submetidos a um pós-mortem de verificação histológica tanto a lesão dopaminérgico e a localização do eléctrodo. Apenas os animais com a colocação correcta do eléctrodo no interior da STN (Figura 6) e lesão dopaminérgico completa (> 90% de perda de neurónios dopaminérgicos na substantia nigra) foram incluídos na secção de resultados (Figura 7).

O teste do cilindro real...

Discussão

Este artigo descreve um protocolo de treinamento detalhado para o teste do cilindro e escadaria. Este último é concebido para avaliar o comportamento apreensão complexa e movimento motora fina devido a alcançar qualificados em ratos ^16,17. A medida do resultado é expresso como o número de peletes consumidos durante o ensaio, o que é uma medida objectiva. O protocolo pode ser utilizado em modelos de rato para a doença de Parkinson e outros modelos de doenças do motor. O teste de cilindro envolve uma abordagem ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Caixa de escada sem tampa	Glas Keil, Alemanha		caixa
de cilindro	Glas Keil, Alemanha		pellets
de precisão sem poeira feitos sob medida, 45 mg	Bio Serv	F0021

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