Isolamento e Caracterização de uma cabeça e pescoço carcinoma espinocelular subpopulação Tendo-tronco características celulares

Resumo

Compreender o papel das células-tronco cancerígenas na recorrência tumoral e na resistência às terapias tornou-se um tópico de grande interesse na última década. Este artigo descreve o isolamento e a caracterização da subpopulação de células-tronco cancerígenas de linhagens celulares de carcinoma escamoso de cabeça e pescoço (CECP).

Resumo

Apesar dos avanços na compreensão da cabeça e pescoço progressão carcinomas de células escamosas (CECP), a taxa de sobrevivência de cinco anos permanece baixa devido à recorrência local e metástases à distância. Uma hipótese para explicar esta recorrência é a presença de câncer de células estaminais-like (CSCs) que apresentam quimioterapia inerente e radio-resistência. A fim de desenvolver novas estratégias terapêuticas, é necessário dispor de modelos experimentais que validam a eficácia dos tratamentos específicos e, por conseguinte, dispor de métodos fiáveis ​​para a identificação e isolamento das CSCs. Para este fim, é apresentado um protocolo para o isolamento de linhas CSCs de células de carcinoma epidermóide humano que assenta na combinação de duas células sucessivas ordenações realizadas por células activadas por fluorescência (FACS). O primeiro é baseado na propriedade de CSCs para superexpressão ATP de Ligação a cassete (ABC) proteínas transportadoras e, portanto, excluir, entre outros, corantes de ADN vitais como a Hoechst 33342. As células classificadas com thé método são identificados como um "side population" (SP). À medida que as células SP representa uma percentagem baixa (<5%) de células parentais, uma fase de crescimento é necessária, a fim de aumentar o seu número, antes da segunda separação de células. O próximo passo permite a selecção de células que possuem outras duas características de células estaminais HNSCC ie alto nível do marcador da superfície celular CD44 (CD44 ^alto) e o-expressão através de aldeído desidrogenase (ALDH ^alta) expressão. Uma vez que a utilização de um único marcador tem numerosas limitações e armadilhas para o isolamento de CSCs, a combinação de SP, CD44 e marcadores ALDH fornecerá uma ferramenta útil para isolar CSCs para mais ensaios analíticos e funcionais que necessitam de células viáveis. As características estaminais semelhante de CSCs finalmente foi validado in vitro pela formação de tumorispheres e a expressão de β-catenina.

Introdução

carcinoma da cabeça e pescoço de células escamosas (CECP) é um tumor maligno comum em todo o mundo e apesar dos progressos em tratamentos atuais, os pacientes com doença avançada têm um mau prognóstico. A taxa de sobrevivência de cinco anos geral do paciente é de cerca de 30%, apesar da combinação de abordagens terapêuticas, incluindo cirurgia, radioterapia e quimioterapia-segmentados terapias. Estudos recentes atribuem recorrência local e metástases à distância para a sobrevivência de câncer de células estaminais-like (CSCs) após terapias anticâncer ^1. Existem provas acumuladas de apoiar a existência de células que apresentam propriedades de células estam....

Protocolo

Todos os procedimentos com animais foram realizados de acordo com as diretrizes locais sobre cuidados com animais. Todos os detalhes deste estudo foram aprovados pelo CECCAPP, uma comissão de ética francesa.

1. Selecção de uma População lateral (SP) pelo corante Hoechst efluxo Ensaio

1. A coloração 50 milhões de células com corante Hoechst 33342.
   1. Preparar dois tubos de 15 ml estéreis com um fundo cônico: um tubo rotulado "Hoechst" e um marcado "Hoechst e Verapamil". Preparar 10 ml de uma solução 5 mM de cloridrato de verapamil em água estéril. Prepara-se o meio de cultura (CM) de células estaminais.
      1. Para preparar CM para CSC (....

Resultados

O isolamento de CSCs de linhas celulares CECP necessários dois triagem sucessiva por causa da percentagem muito baixa de CSCs na linha de células parental. A primeira classificação baseou-se na capacidade das CSCs de excluir o corante Hoechst devido a transportadores de efluxo de drogas. Isto resultou na aquisição de 1-5% da população total de células classificadas (Figura 1). Durante a separação de células negativa Hoechst corante, verifique o tamanho e granulação de cé.......

Discussão

Este protocolo descreve um método de confiança para o isolamento bem sucedido de CSCs a partir de uma linha celular específica, que é aplicável a outras linhas de células de carcinoma epidermóide. CSCs de cabeça e pescoço isoladas são então adequado para posterior caracterização molecular in vitro e validação funcional por transplante em ratinhos imunodeficientes ^19. No entanto, algumas modificações podem ser testados de acordo com a população CD44 lado ou os ^alta / ALDH percentagens ^.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Soro de bezerro fetal Gold	GE Healthcare	A15-151
Hidrocortisona solúvel em água	Sigma-Aldrich	H0396-100MG
Penicilina/Estreptomicina 100x	Dominique Dutscher	L0022-100
DMEM	Gibco	61965-026
F12 Nut Mix (1x) + GlutaMAX-I	Gibco	31765-027
EGF	Promega	G5021	A solução deve ser preparada imediatamente antes do uso porque é muito instável
Heparina	StemcellTM Technologies	7980
B-27 Suplemento (50x), menos vitamina A	Gibco	12587-010
Hoechst 33342	Sigma-Aldrich	14533	Corrosivo, toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) categoria 4
Cloridrato de	VerapamilSigma-Aldrich	V-4629	Toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) categoria 3
Iodeto de propídio	Sigma-Aldrich	P4170	Toxicidade aguda (oral, dérmica, inalação) categoria 4
Kit ALDEFLUOR	Células-tronco	1700
CD44-APC, anticorpo humano	Miltenyi Biotech	130-095-177
IgG1-APC, anticorpo humano	Miltenyi Biotech	130-093-189
Z1 coulter partícula	Beckman Coulter	6605698
Microscópio óptico	Olympus	Linha celular CKX31
SQ20B	Presente do John Little ' s Linha	laboratório-FaDu
	ATCC	HTB-43
Placas de ancoragem baixa	Thermo Fischer Scientific	145383
BD FACSDiva software v8.0.1	BD Biosciences	-