Artigo de método

Investigando a função de Coronin A no Precoce fome resposta de Dictyostelium discoideum Por agregação Ensaios

DOI:

10.3791/53972

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18 de junho de 2016

 ,  ,  , 
1Biozentrum, University of Basel

Neste artigo

Resumo

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A ameba social Dictyostelium discoideum sofre uma transição de desenvolvimento para um organismo multicelular quando morre de fome. A proteína evolutivamente conservada coronina A desempenha um papel crucial no início do desenvolvimento. Usando ensaios de agregação como nosso principal método, pretendemos elucidar o papel da coronina A no desenvolvimento inicial.

Resumo

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Dictyostelium discoideum ameba são encontrados no solo, alimentando-se de bactérias. Quando as fontes de alimentos se tornam escassos, eles secretam fatores para iniciar um programa de desenvolvimento multicelular, durante o qual células individuais chemotax para os centros de agregação 1-4. Este processo é dependente da libertação de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) 5. O AMPc é produzido em ondas através da acção concertada de adenilato-ciclase e fosfodiesterase, e liga-se a receptores de G cAMP acoplados à proteína 6,7. Um ensaio amplamente utilizado para analisar os mecanismos envolvidos no ciclo de desenvolvimento do Dictyostelium discoideum eucariota inferior é baseado na observação de agregação de células em condições submersas 8,9. Este protocolo descreve a análise do papel de coronin A no ciclo de desenvolvimento pela inanição em placas de cultura de tecidos imersos em solução salina equilibrada (BSS) 10. Coronin A é um membro da PR amplamente conservadaotein família de coronins que têm sido implicados numa grande variedade de actividades 11,12. Dictyostelium células que carecem coronin A são incapazes de formar agregados multicelulares, e este defeito pode ser resgatado por fornecimento de impulsos de AMPc, o que sugere que coronin A actua a montante do cAMP cascata 10. As técnicas descritas nestes estudos fornecem ferramentas robustas para investigar as funções das proteínas durante as fases iniciais do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum a montante da cascata do AMPc. Assim, a utilização deste ensaio de agregação pode permitir a um estudo mais aprofundado da coronin Uma função e fazer avançar nossa compreensão da biologia coronin.

Introdução

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A família de proteínas coronin é altamente conservada durante toda eucariotas. Estas proteínas são caracterizadas pela presença de um triptofano-aspartato amino-terminal (WD) região seguido por uma região única ligado a um domínio em espiral espiralada carboxi-terminal contendo 13,14 repetir-(Figura 1). Coronins têm sido implicados numa variedade de funções celulares, incluindo a regulação do citoesqueleto e transdução de sinal 12. Nos mamíferos, até seis moléculas curtas coronin coronin (1-6), bem como um "conjunto" coronin 7, pode ser co-expressa 12,15. Coronin um membro da família é o mais extensivamente estudado, e foi mostrado para ser envolvido na destruição de agentes patogénicos, a sobrevivência das células T e sinalização neuronal. Como, exatamente, coronin 1 realiza estas actividades ainda não está claro. Enquanto coronin 1 foi mostrado para regular Ca 2+ e de sinalização dependente de cAMP, bem como de F-actina do citoesqueleto modulação 16-18, o potencial de co-expression de até 7 membros da família em mamíferos tornou-se um desafio para estudar a função molecular de coronins nesses sistemas, devido a potenciais despedimentos. Ao contrário de organismos de mamíferos, o discoideum eucariota Dictyostelium inferior expressa apenas dois membros coronin familiares (coronin A, o ortólogo de mamífero coronin 1 e coronin B, ort�logo de coronin mamíferos 7) com funções aparentemente não redundantes 15,19,20. Este fato faz com Dictyostelium discoideum um modelo potente para estudar a função dos coronins.

Para estudar o papel de coronin A em Dictyostelium discoideum, que induziu o ciclo de desenvolvimento pela inanição em placas de cultura de tecidos contendo solução de sal equilibrada tampão (BSS) usando quer células do tipo selvagem ou de células sem coronin Um 10. Descobrimos que as células sem coronin A foram incapazes de formar agregados multicelulares sobre fome. Para uma avaliação quantitativa exacta deste fenótipoimagens de células vivas automatizado descrito neste protocolo é uma ferramenta vital. O defeito na iniciação da resposta de fome no início de células sem coronin A pode ser resgatado por fornecimento de impulsos de AMPc, o que sugere que coronin A actua a montante da cascata do AMPc. A aplicação exógena de impulsos de campo para simular a iniciação do desenvolvimento tem sido utilizado por vários laboratórios no passado 8,9. No entanto, este procedimento é também conhecido por ser altamente dependente da densidade das células e de temporização. Portanto, o protocolo aqui descrito destina-se a reduzir estes variabilidades, a fim de garantir um elevado grau de reprodutibilidade. Tomadas em conjunto, as técnicas utilizadas nestes estudos fornecem ferramentas robustas para investigar as funções das proteínas durante as fases iniciais do ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum e tem o potencial para identificar para cima, bem como efectores a jusante de coronin uma função.

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Protocolo

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  1. Observe a resposta de fome precoce de Dictyostelium discoideum por microscopia de lapso de tempo.
    1. Cultivar células DH1.10 ou células cora -deficient num balão de Erlenmayer contendo HL-5 meio (para 1 L: 5 g de proteose peptona, 5 g thiotone E peptona, 10 g de glicose, 5 g de extracto de levedura, 0,35 g de Na 2 HPO 4 * 7H 2 O, 0,35 g de KH 2 PO 4, 0,05 g de sulfato de di-hidroestreptomicina-, pH 6,6) a 22 ° C numa incubadora com agitação com uma rotação de 160 rpm. Manter as células a uma densidade entre 0.01 x 10 6 células / ml e 2 x 10 6 culas / ml.
    2. Examinar a agregação de células, por meio da colheita de log-fase de cultivo de células DH1.10 21 ou cora as células -deficient 10 gerado no fundo DH1.10, crescidas em cultura com agitação com HL-5 forma a 22 ° C. Para fazer isso, tomar uma quantidade apropriada de células (normalmente entre 10 e 50 ml), centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar as células duas vezes em BSS (10 mM de NaCl, 10 mM de KCl, CaCl 2 2,5 mM, pH 6,5).
    3. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Subsequentemente, as células em placas a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Permitir-lhes a aderir durante 1 hora a 22 ° C no BSS.
    4. Visualize a agregação por microscopia de lapso de tempo, tal como descrito antes de 10, a tomada de imagens a cada 135 segundos. utilizando uma imagem de células vivas configurar equipada com objectiva 5X e uma câmara de dispositivo de carga acoplada de multiplicação de electrões automatizado pelo software adequado (ver Materiais Tabela).
  2. pulsante AMPc das células Dictyostelium discoideum durante inanição.
    1. Examinar o efeito de impulsos de cAMP aplicados externamente sobre o desenvolvimento de células DH1.10 21 ou DH1.10 Cora -deficient células 10, por colheita de células. Para fazer isso, tomar uma quantidade apropriada de células (normalmente entre 10 e 50 ml), centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar duas vezes em BSS.
    2. Count células utilizando um hemocitómetro e ressuspender as células a uma densidade de 1 x 10 7 células / mL em BSS. Agitar as culturas (160 rpm) a 22 ° C durante 2 h antes de aplicar pulsos. Adicionar pulsos de cAMP utilizando uma bomba peristáltica controlado temporizador. Programar a bomba para fornecer um impulso de 5 segundos a cada 6,5 ​​min de 15 uL de 50 nM de cAMP (concentração final) durante um período de 5 horas.
    3. Contagem de células utilizando um hemocitómetro. Subsequentemente, a chapa células a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Permitir a aderir durante 1 h em BSS.
    4. Visualizar a agregação após 16 horas a 22 ° C por microscopia de campo brilhante utilizando uma objectiva de 5x.
  3. Indução de Dictyostelium discoideum desenvolvimento através da exposição ao meio condicionado.
    1. Prepare meio condicionado fresco como descrito 22. Coletar células DH1.10 de fase log 21 ou DH1.10 Cora -deficient células 10, de tremer cultmentos com HL-5 forma a 22 ° C, utilizando uma pipeta, centrifuga-se durante 3 min a 400 xg e lavar as células três vezes em PBM (fosfato de potássio 0,02 M, 10 mM de CaCl2, e 1 mM de MgCl2, pH 6,1).
    2. Células utilizando um hemocitómetro Contagem, ressuspender estas em PBM a uma densidade de 1 x 10 7 células / ml e agita-se durante 20 h a 110 rpm / 22 ° C.
    3. Recolhe meio condicionado após a centrifugação a 400 x g durante 3 min e clarificar por centrifugação a 8000 × g durante 15 min a 4 ° C.
    4. Filtrar o meio condicionado através de um filtro de 0,45 um (ver Tabela Materiais) e dilui-se três vezes em PBM.
    5. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e placa a uma densidade de (5, 10, 20, ou 40) 4 x 10 células / cm2 numa placa de 24 poços. Lhes permitem aderir durante 1 hora a 22 ° C.
    6. Troca de sobrenadante das células com o meio condicionado previamente preparada.
    7. Visualize a agregação de umepois de 16 horas por microscopia de campo brilhante usando uma objetiva de 5X.

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Resultados

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As células deficientes em coronin Um show de um defeito no desenvolvimento inicial (Figura 2). Na ausência de um coronin células são incapazes de formar agregados multicelulares, que é o passo inicial durante o ciclo de desenvolvimento de Dictyostelium discoideum. Portanto, coronin Um parece desempenhar um papel durante a resposta precoce fome e / ou a sinalização de cAMP. Com efeito, a falta de formação de agregados multicelulares na ausência de coronin A é aco...

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Discussão

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As proteínas coronin são encontrados na maioria dos taxa do clado eucariótica. Dictyostelium discoideum coronin A, o homólogo de coronin mamíferos 1, está envolvida na resposta de fome precoce, uma vez que coronin Um deficiente em células não são capazes de formar centros de agregação durante o início do desenvolvimento ciclo 10. Para ser capaz de avaliar quantitativamente e com precisão o atraso no desenvolvimento entre as cepas, um microscópio imagens de células vivas set-up com o controlador de es...

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Divulgações

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Não há conflitos de interesse declarados.

Agradecimentos

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Agradecemos ao Dictyostelium Stock Center pelas cepas e reagentes. Este estudo foi financiado por doações da Fundação Nacional de Ciências da Suíça e do Cantão de Basileia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Meio HL-5 (para 1 L: 5 g de peptona de proteose, 5 g de peptona de tiotona E, 10 g de glicose, 5 g de extrato de levedura, 0,35 g de Na2HPO4*2H2O, 0,35 g de KH2PO4, 0,05 g de diidroestreptomicina-sulfato, pH 6,6)
Peptona de proteoseBD Bioscience211693
Peptona de tiotona EBD Bioscience211684
Extrato de leveduraBD Bioscience212750
GlucoseAppliChemA3666
Na2HPO4*2H2OFluka71643
KH2PO4AppliChemA1043
dihidroestreptomicina-sulfatoSigma-AldrichD1954000
PBM (fosfato de potássio 0,02 M, 10 μ M CaCl2 e l mM MgCl2, pH 6,1)BSS (
10 mM NaCl, 10 mM KCl, 2,5 mM CaCl2, pH 6,5)auto-fabricado
0,45-μ m Filtro S FiltropureSarstedt83.1826
Falcon Placa de cultura de tecidos de 24 poçosFisher Scientific08-772-1H
Microscópio CellobserverAxioVision personalizado Zeiss
Zeiss
– bomba de distribuição controladaISMATECISM 931
Axiovert 135M microscópioZeiss491237-0001-000
Agitador de incubaçãoInforst HT Minitron
Software Microprocessador IPC

Referências

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  1. Weijer, C. J. Morphogenetic cell movement in Dictyostelium. Semin Cell Dev Biol. 10, 609-619 (1999).
  2. Devreotes, P. Dictyostelium discoideum: a model system for cell-cell interactions in development. Science. 245, 1054-1058 (1989).
  3. Kimmel, A. R., Firtel, R. A. cAMP signal transduction pathways regulating development of Dictyostelium discoideum. Curr Opin Genet Dev. 1, 383-390 (1991).
  4. Clarke, M., Gomer, R. H. PSF and CMF, autocrine factors that regulate gene expression during growth and early development of Dictyostelium. Experientia. 51, 1124-1134 (1995).
  5. Robertson, A., Drage, D. J., Cohen, M. H. Control of Aggregation in Dictyostelium discoideum by an External Periodic Pulse of Cyclic Adenosine Monophosphate. Science. 175, 333-335 (1972).
  6. Konijn, T. M., Chang, Y. Y., Bonner, J. T. Synthesis of cyclic AMP in Dictyostelium discoideum and Polysphondylium pallidum. Nature. 224, 1211-1212 (1969).
  7. Iranfar, N., Fuller, D., Loomis, W. F. Genome-wide expression analyses of gene regulation during early development of Dictyostelium discoideum. Eukaryot Cell. 2, 664-670 (2003).
  8. Darmon, M., Brachet, P., Da Silva, L. H. Chemotactic signals induce cell differentiation in Dictyostelium discoideum. Proc Natl Acad Sci U S A. 72, 3163-3166 (1975).
  9. Mann, S. K., Firtel, R. A. Cyclic AMP regulation of early gene expression in Dictyostelium discoideum: mediation via the cell surface cyclic AMP receptor. Mol Cell Biol. 7, 458-469 (1987).
  10. Vinet, A. F., et al. Initiation of multicellular differentiation in Dictyostelium discoideum is regulated by coronin A. Mol Biol Cell. 25, 688-701 (2014).
  11. Eckert, C., Hammesfahr, B., Kollmar, M. A holistic phylogeny of the coronin gene family reveals an ancient origin of the tandem-coronin, defines a new subfamily, and predicts protein function. BMC Evol Biol. 11, 268(2011).
  12. Pieters, J., Muller, P., Jayachandran, R. On guard: coronin proteins in innate and adaptive immunity. Nat Rev Immunol. 13, 510-518 (2013).
  13. Gatfield, J., Albrecht, I., Zanolari, B., Steinmetz, M. O., Pieters, J. Association of the Leukocyte Plasma Membrane with the Actin Cytoskeleton through Coiled Coil-mediated Trimeric Coronin 1 Molecules. Mol Biol Cell. 16, 2786-2798 (2005).
  14. Kammerer, R. A., et al. A conserved trimerization motif controls the topology of short coiled coils. Proc Natl Acad Sci U S A. 102, 13891-13896 (2005).
  15. Uetrecht, A. C., Bear, J. E. Coronins: the return of the crown. Trends Cell Biol. 16, 421-426 (2006).
  16. Jayachandran, R., et al. Coronin 1 Regulates Cognition and Behavior through Modulation of cAMP/Protein Kinase A Signaling. PLoS Biol. 12, e1001820(2014).
  17. Suo, D., et al. Coronin-1 is a neurotrophin endosomal effector that is required for developmental competition for survival. Nat Neurosci. 17, 36-45 (2014).
  18. Mueller, P., et al. Regulation of T cell survival through coronin-1-mediated generation of inositol-1,4,5-trisphosphate and calcium mobilization after T cell receptor triggering. Nat Immunol. 9, 424-431 (2008).
  19. de Hostos, E. L., Bradtke, B., Lottspeich, F., Guggenheim, R., Gerisch, G. Coronin, an actin binding protein of Dictyostelium discoideum localized to cell surface projections, has sequence similarities to G protein beta subunits. EMBO J. 10, 4097-4104 (1991).
  20. Shina, M. C., et al. Redundant and unique roles of coronin proteins in Dictyostelium. Cell Mol Life Sci. 68, 303-313 (2011).
  21. Cornillon, S., et al. Phg1p is a nine-transmembrane protein superfamily member involved in dictyostelium adhesion and phagocytosis. J Biol Chem. 275, 34287-34292 (2000).
  22. Gomer, R. H., Yuen, I. S., Firtel, R. A. A secreted 80 x 10(3) Mr protein mediates sensing of cell density and the onset of development in Dictyostelium. Development. (112), 269-278 (1991).
  23. Iijima, N., Takagi, T., Maeda, Y. A proteinous factor mediating intercellular communication during the transition of Dictyostelium cells from growth to differentiation. Zoological science. 12, 61-69 (1995).
  24. Mehdy, M. C., Firtel, R. A. A secreted factor and cyclic AMP jointly regulate cell-type-specific gene expression in Dictyostelium discoideum. Mol Cell Biol. 5, 705-713 (1985).
  25. Jain, R., Yuen, I. S., Taphouse, C. R., Gomer, R. H. A density-sensing factor controls development in Dictyostelium. Genes Dev. 6, 390-400 (1992).
  26. Loomis, W. F. Cell signaling during development of Dictyostelium. Dev Biol. 391, 1-16 (2014).

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Dictyostelium discoideumCoronin AAggregation AssayCyclic AMP PulsesCell AggregationTime lapse MicroscopyHemocytometer CountingConditioned MediumStarvation ResponseDevelopmental Biology

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