Métodos para estudar MRP4 contendo Complexos Macromoleculares no regulamento de Fibroblasto Migração

Summary

MRP4 regula vários eventos de sinalização dependentes de nucleótidos cíclicos, incluindo um papel recentemente elucidados na migração de células. Nós descrevemos uma abordagem direta, mas multifacetada para desvendar os alvos moleculares jusante de MRP4 resultando em identificação de um interactome MRP4 única que desempenha um papel-chave na regulação afinado da migração de fibroblastos.

Abstract

Multidrug proteína de resistência 4 (MRP4) é um membro da família de cassete de ligação de ATP dos transportadores de membrana e é um transportador de efluxo endógena de nucleótidos cíclicos. Modulando concentração de nucleótido cíclico intracelular, MRP4 pode regular vários eventos celulares dependentes de nucleotídeos cíclicos, incluindo a migração celular. Anteriormente, foi demonstrado que na ausência de MRP4, células de fibroblasto de conter níveis mais elevados de nucleótidos cíclicos intracelulares e pode migrar rapidamente. Para entender os mecanismos subjacentes a este achado, adotamos uma abordagem direta ainda multifacetada. Em primeiro lugar, foram isoladas potenciais complexos de proteínas interactuantes de MRP4 a partir de um sistema de célula de MRP4 sobre-expressão usando imunoprecipitação seguida por espectrometria de massa. Após a identificação de proteínas específicas no interactoma MRP4, utilizou Engenho Pathway Analysis (IPA) para explorar o papel destas interacções proteína-proteína no âmbito da transdução de sinal. Nós elucidou o potencial papel do complexo de proteína de MRP4 na migração celular e identificado F-actina como um importante mediador do efeito de MRP4 sobre a migração celular. Este estudo também enfatizou o papel da cAMP e cGMP como jogadores-chave nos fenómenos migratórios. Utilizando microscopia de elevado teor, realizamos ensaios de migração celular e observou-se que o efeito de MRP4 sobre a migração de fibroblastos é completamente abolida por disrupção do citoesqueleto de actina ou a inibição da cinase A dependente de AMPc (PKA). Para visualizar sinalização modulações numa célula migrar em tempo real, que utilizado um sensor baseado em TERF para medir a actividade de PKA e encontrado, a presença de actividade de PKA mais polarizada perto do bordo de ataque da migração de MRP4 ^{- / -} de fibroblastos, em comparação com MRP4 ^{+ / +} fibroblastos. Este por sua vez, o aumento na formação de actina cortical aumentada e o processo de migração. A nossa abordagem permite a identificação das proteínas que actuam a jusante para MRP4 e fornece-nos com um excessovista do mecanismo envolvido na regulação dependente de MRP4 da migração de fibroblastos.

Introduction

A migração celular é um processo multi-passo complicado. Estudos têm demonstrado que durante a células de migração são polarizada em bordos de ataque e de fuga. Ao aderir à matriz extracelular, o bordo de ataque fornece a força necessária para o corpo da célula para se mover para a frente. Finalmente, os acessórios traseiros de arrasto lançamentos de ponta e completa o ciclo de ^1,2 a migração.

polarização celular para a migração celular eficiente é regulada pela segregação espacial de sinalização intracelular. Segundos mensageiros celulares, tais como cAMP, mediar a compartimentalização dos eventos de sinalização requeridos para a migração de células ^3,4 afinadas direccional. Acumulações preferenciais de cAMP e da atividade PKA quinase dependente de cAMP na vanguarda desempenham papéis fundamentais na migração celular direcional ^5,6. Por fosforilação pequenas GTPases, como substrato relacionadas com Ras toxina botulínica C3 (RAC) e controle da divisão celular proteína 42 homólogo ou Cdc42, PKA ativa relacionada actina-proteína 03/02 (Arp 2/3) no bordo de ataque e induz a formação de lamelip�ios ^7-9. PKA também fosforila um agente anti-capping, vasodilatador estimulado fosfoproteína (VASP), assim, regula os ciclos oscilatórios de extensão de membrana e retração ^10,11.

Nas células, os níveis de cAMP são regulados por três processos principais: i) síntese de guanilato ciclase, ii) degradação por fosfodiesterases, e iii) o transporte por transportadores de efluxo ligada à membrana ^3. proteína de resistência a múltiplas drogas 4 (MRP4), um membro da cassete de ligação a ATP (ABC) da família de transportadores de membrana, funciona como um transportador de efluxo endógena de nucleótidos cíclicos. Portanto, MRP4 pode regular os níveis de AMPc intracelular e celular dependente de AMPc sinalização ^11-13. Temos anteriormente demonstrado que, em MRP4 ^{- / -,} os fibroblastos contêm níveis relativamente elevados de nucleotídeos cíclicos e migrar c mais rápidoompared para MRP4 fibroblastos ^{+ / + 14.} Nós também relataram um efeito bifásico de nucleotídeos cíclicos sobre a migração de fibroblastos. Com base em estudos anteriores e nossa conclusão de que MRP4 ^{- / -} fibroblastos conter cAMP mais polarizada durante o curso da migração, a hipótese de que este regulamento mediada por MRP4 da migração de fibroblastos é cAMP dependente. A fim de compreender o mecanismo a jusante, fizemos uma abordagem direta ainda multifacetada.

Para identificar as proteínas associadas e na interação com MRP4, nós imunoprecipitadas complexos macromoleculares contendo MRP4 de células HEK293 que mais expressam MRP4. Utilizando espectrometria de massa, foram identificadas várias proteínas interagindo MRP4 e analisados ​​sua interconectividade usando Ingenuity Pathway Analysis (IPA). IPA é uma ferramenta útil para analisar as interações proteína-proteína (tanto estruturais e funcionais) e explorar as suas contribuições em particular fisiológico e patológicoacontecimentos com base na literatura e evidências experimentais ^15,16. IPA indicou que a actina F é um dos principais alvos a jusante de MRP4 no contexto da migração celular em que cAMP e cGMP são a chave ¹⁷ moléculas de sinalização. Estes dados foram confirmados por microscopia de elevado teor. Microscopia de elevado teor podem capturar e analisar o comportamento de células, tais como migração de células de um modo mais conveniente, preciso e de alto rendimento ^18. Os dados de alto teor de microscopia demonstraram que o efeito de MRP4 sobre a migração de fibroblastos é completamente abolida mediante a interrupção do citoesqueleto de actina ou inibição da PKA ^17.

Além disso, utilizou-se uma transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) à base de PKA do sensor para controlar a dinâmica de PKA em células migrantes em tempo real. Sensores de quinase baseados em FRET geralmente consistem de péptidos substrato de fosforilação específicos flanqueadas por PCP e YFP fluoróforos ^19-21. pmAKAR3 é uma melhorada e membrane alvo sensor de PKA baseado em FRET que contém domínio associado-forkhead 1 (FHA1) e a sequência de substrato PKA LRRATLVD ^5,22. A fosforilação de PKA pmAKAR3 pelos aumentos de subunidades catalíticas FRET sinal entre PCP e YFP ^19. A inserção de um domínio modificação lipídica no sensor que tem como alvo a membrana plasmática para o monitoramento da dinâmica de PKA, especificamente no compartimento da membrana ^23.

Usando pmAKAR3, demonstramos que a vanguarda de migrar MRP4 ^{- / -} fibroblastos exibiram atividade PKA mais polarizada do que MRP4 ^{+ / +} fibroblastos, que por sua vez aumentou a formação de actina cortical na vanguarda da célula ^17. Juntos, estes eventos resultou no melhor polarização celular e migração celular mais rápido direccional na ausência de MRP4. A nossa abordagem específica e diretamente identificados alvos a jusante-chave para MRP4 e fornece uma importante, mas comodo ainda inexplorado mecanismo para a regulação dependente de MRP4 da migração de fibroblastos.

Protocol

1. Análise Ingenuity Pathway

1. Upload Dataset Protein-interactome
   1. Insira as proteínas / genes de interesse em uma planilha com os seus identificadores de genes únicos (de preferência símbolos de genes e números de identificadores gene como obtidos com os dados de espectrometria de massa).
   2. Atribuir uma coluna na folha de cálculo para o número identificador Gene e uma coluna para o valor de observação (por exemplo., Dobra-mudança ou p-valor). Selecione o 'contém cabeçalho da coluna' opção para visualizar os títulos das colunas.
   3. Faça o upload do conjunto de dados sobre o IPA clicando na guia de upload conjunto de dados e selecionando a planilha mencionado acima. Escolha a guia formato flexível, e selecione a categoria apropriada de identificador gene.
      Nota: Um formato flexível do conjunto de dados supera as especificações de formatação para upload.
   4. Depois que o conjunto de dados exibida, selecione ID e de observação colunas. Certifique-se de que todas as proteínas (MRP4 interactome como identificado por massa-SPectrometry) são mapeados através da verificação Na guia Resumo conjunto de dados. O conjunto de dados está agora pronto para a análise pretendida.
2. Análise de dados
   Nota: Descrito são os usos parciais de IPA características que foram utilizados para este estudo.
   1. Após o upload MRP4 interactome com seus nomes de genes como os identificadores únicos, clique em Novo e escolha a análise do núcleo no menu superior esquerdo do software IPA.
   2. Definir o valor cortes de expressão para a intensidade de acordo com o tipo de experiência (valor de intensidade de 100 é recomendado para análise).
   3. Calcule o fold-mudança na expressão durante a preparação do conjunto de dados, se as condições de controlo e experimentais estão envolvidos e incluí-lo como parte do arquivo de conjunto de dados, se uma análise de comparação precisa ser executada (A valor de corte de 1,5 a mudança vezes é geralmente recomendado para análise ).
      Nota: Após a finalização da análise do núcleo, pode ser obtida de várias secções análises. A primeira aba mostra o resumo do the análises totais e sugere principais vias canônicas, reguladores a montante, funções moleculares e celulares e redes entre outros; todos calculados com base no nível de confiança (valor de p) e dispostos em ordem crescente de valor de p.
   4. Abra as principais vias canônicas (usando a opção via aberta) como grandes redes moleculares que mostram graficamente falando cruz, sobreposição, e afetou as vias de sinalização.
      Veja a lista das vias que são canónicas majoritariamente la com base no valor de p (p <0,05 é considerado como significativo).
      Nota: Os valores de significância para as vias canônicas são calculadas pelo teste exato de Fisher-atado direita. O significado indica a probabilidade de associação de moléculas a partir do conjunto de dados com a via canonical por acaso sozinho.
   5. Confirme as proteínas de entrada (interactome MRP4 conforme identificado por espectrometria de massa) entre a lista de proteínas envolvidas em cada via.
      Nota: Usando esta optioN, observou-se que a rede do citoesqueleto de actina celular de sinalização é a principal via afectada e como as proteínas de entrada encaixar-la (Figura 1). Essa abordagem ajuda a identificar quais as redes moleculares estaria intimamente associada e afetados pelas proteínas de teste.
   6. Utilize a guia rede nas análises para identificar as doenças e as funções de topo que estão potencialmente ligados a uma rede de proteína em particular com base no número de moléculas de foco.
      Nota: Um valor pontuação é dada com base nas proteínas conhecidas que são determinados como parte de uma rede, por exemplo, a montagem celular e rede da organização, através do conhecimento da literatura e evidências experimentais e concentrar-se moléculas que são identificados a partir do conjunto de dados e tornar-se parte da rede. . Daqui em diante, a rede é filtrado em primeiro lugar, com base no número de moléculas de foco.

Microscopia 2. Alta-content

1. Preparação de Células
   Nota: Todos os trabalhos de cultura de células foi feita sob o capô de cultura de células horizontal-flow.
   1. Use microplacas de 96 poços para o ensaio de cicatrização da ferida.
   2. Revestimento da microplaca com uma solução de fibronectina 1% (reconstituídos em PBS), e manter a placa numa incubadora de _CO2 padrão a 37 ° C durante 2 h.
   3. Remove MRP4 ^{- / -} e MRP4 ^{+ / +} de fibroblastos de rato embrionário (MEFs) cultivadas em frascos de cultura celular de 25 cm² da incubadora, lavar uma vez com PBS, e trypsinize as células durante 5 minutos com 1 ml de 4x uma solução de tripsina-EDTA.
   4. Lavam-se as células com meio completo (DMEM contendo 10% FBS e 1% de penicilina / estreptomicina) e ressuspender-los em 5 ml de meio completo.
   5. Aspirar a solução de fibronectina a partir dos poços. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e sementes 30.000 células (número de células tem de ser optimizado com base no tipo de células) para cada poço.
   6. Crescer as células a 100% de confluência num padrãoIncubador de _CO2 a 37 ° C durante 24 h.
2. criando Wound
   1. Certifique-se de todos os poços são preenchidos com a solução. Encha as cavidades não utilizadas com PBS para evitar danos na ferramenta fazendo ferida (por exemplo., WoundMaker).
   2. Após a confirmação de confluência celular a 100%, colocar a placa de 96 poços no interior da ferramenta ferida tomada sobre a chapa metálica de base e pressionar o bloco de pinos de 96 poços para baixo.
   3. Lavam-se as células três vezes com PBS para remover quaisquer células desalojadas e adicionar 100 uL de meio completo.
   4. Adicione os compostos de teste - H-89 (50 mM; 1: 1000 diluição com meios completos usando o estoque 50 mM em DMSO) ou Latrunculin B (1? M, 1: 1000 diluição com mídia completa usando o estoque 1 mM em DMSO), nesta fase, .
   5. Colocar a placa de ensaio no interior do leitor, a 37 ° C e monitorar a migração ao longo do período experimental.
3. Migração de monitoramento celular
   Nota: A migração celular foi monitorizada utilizando o microscópio e software PRovided com sistema de microscopia de elevado teor. A utilização de microplacas de 96 poços assegura que as feridas são automaticamente monitorizada pelo microscópio e registado pelo software.
   1. Definir o software para digitalizar a placa de ensaio a cada hora para ensaios de migração usando a guia de digitalização programação. Seleccionar uma hora de início, pelo menos, 15 minutos após a colocação da placa de ensaio no interior do leitor para permitir o equilíbrio antes da imagiologia.
   2. Selecione a bandeja e escolher o tipo de embarcação (96 poços de microplaca) e tipo experimento (zero Wound).
   3. Selecione objetiva de 10X e escolha os parâmetros de imagens de contraste de fase. Selecione os poços que precisam ser digitalizados usando a opção de edição padrão de leitura.
   4. Especificar os grupos de tratamentos e quaisquer repetições, selecionando a guia propriedades ea criação de um mapa da placa. A digitalização pode ser interrompido a qualquer momento com base na condição experimental.
4. Análise de dados
   1. Depois que a exploração é feita, selecione a guia vista vaso para a placa de ensaio. Go para os utilitários de trabalho de análise e selecione Iniciar tarefa nova análise.
   2. Definir ferida zero como tipo de trabalho e selecione o intervalo de tempo para a análise (0 ponto de tempo para o ponto de tempo de 24 h).
   3. Selecionar os poços a serem escolhidos para análise por um único clique sobre o bem e clique em "OK" para iniciar a análise. Uma vez que a análise é feita, graficamente visualizar dados densidade relativa ferida (RWD) para cada poço em cada ponto de tempo usando exportação para a opção gráfico.
   4. Ver o de contraste de fase conjunto de imagens de cada poço correspondente a diferentes pontos de tempo usando a guia imagem vista. Selecione um bem específico, clicando no mapa da placa, selecione um ponto de tempo específico na guia intervalo de tempo e clique na guia imagem vista.

3. Transfira Förster Ressonância Energia (FRET)

1. Preparação de Células
   1. Brasão de 35 mm pratos com fundo de vidro com 100 ml de solução de fibronectina 1% (conforme descrito na seção 2.1) e mantê-los emum padrão incubador de _CO2 a 37 ° C durante 2 h.
   2. Aspirar a solução de fibronectina a partir das placas e sementes números iguais de células HEK293 (10.000 células / placa) em meio completo.
   3. Crescer as células de 60-70% de confluência em pratos de fibronectina com fundo de vidro revestidos num padrão incubador de _CO2 a 37 ° C durante 24 h.
2. transfecção
   1. Executar todas as transfecções transientes usando um reagente de transfecção comercial de acordo com as instruções do fabricante.
   2. Alíquota de 250 ul de meio completo em dois tubos de 1,5 ml de centrífuga estéreis separadas para cada prato de 35 mm.
   3. Adicionar 2 ug de ADN (ou pmAKAR3 pmAKAR3-TA) em um tubo e 5 ul (2,5 vezes a concentração de ADN) de reagente de transfecção em outro tubo.
   4. Incubar os tubos durante 20 min à temperatura ambiente e, em seguida, transferir o ADN diluído no tubo contendo o reagente de transfecção.
   5. Misturar bem e incubar a 37° C durante mais 30 min.
   6. Aspirar o meio fora das células e lavá-los uma vez com PBS. Adicionar 1 ml de DMEM isento de antibiótico meio F-12 contendo FBS a 10% às células.
   7. Adicionar 507 ul de conjugado de ADN-lípido com meios para as células em cada placa, misturar suavemente, e manter-se na incubadora de CO ₂ a 37 ° C durante 48 h. Use 2 ug de ADN (1 ug / ul de estoque) e 5 uL de lípido para 10,000-50,000 células em cada placa.
3. Imagens ao vivo de células
   1. Após 48 horas da transfecção, remover o meio de crescimento e lavar as células 2 vezes com solução salina equilibrada de Hank (HBSS, pré-aquecido a 37 ° C). Adicionar um volume final de 1,9 ml de HBSS para as células lavadas e montá-los em um sistema de microscópio de campo amplo invertido para imagiologia de FRET dentro de um feito por encomenda 37 ° C mantida câmara.
      Nota: Neste sistema, a luz de excitação é fornecida por uma lâmpada de 300 W Xenon atenuada com um filtro de densidade neutra com 50% de transmiss de luzíon.
   2. Use objectivo 60X. focar manualmente as células e definir um campo ideal de vista usando o microscópio. Ativar o campo de visão selecionado na tela do computador usando a opção Focus "F" no software. Para a realização de medições de fricção, selecione o conjunto adequado de filtro (filtro de CFP / YFP definido com um 430/25 nm filtro de excitação, um divisor de feixe duplo dicróicas, e dois filtros de emissão (470/30 nm para PCP e 535/30 nm para FRET) manualmente.
   3. Visualizar fluorescência, verificando primeiro na opção de canal PCP / YFP / FRET seguido clicando na guia fluor aberto. Melhorar a intensidade do sinal usando a função intensificação na guia câmera.
   4. As células que expressam selecione pmAKAR3 ou pmAKAR3-TA evitando a saturação da intensidade do sinal. Use a janela de captura para iniciar a medição de FRET.
   5. Selecione a opção de lapso de tempo e configurar um tempo-scan durante 30 min com intervalo de 30 segundos. Marque a opção FRET e definir o tempo de exposição a 100 ms. Introduza a uma etiqueta de imagemd Prima Iniciar para iniciar a medição.
   6. Depois de cinco pontos de tempo e estabelecimento de uma linha de base, adicionar 25 | iM de forscolina (5 ul de 10 mM estoque em etanol, diluiu-se com 100 ul de HBSS) para as células, sem perturbar a placa e monitorar as células para um total de 30 min.
4. Análise de dados
   Nota: Use módulo de cálculo ratiometric para análise de dados.
   1. Clique na ferramenta de seleção no lado esquerdo da janela de imagem e escolha um retângulo sólido a partir do menu drop-down. Arraste o retângulo no campo de imagem em uma área livre de células e clique direito sobre ele para defini-la como plano de fundo para o propósito de subtração de fundo.
   2. Ir para a máscara e usar 'criar uma nova máscara "opção. Vá para a ferramenta de seleção e escolha uma caneta a partir do menu drop-down para desenhar manualmente uma máscara em torno da célula para a seleccionar para uma medição. Selecione pelo menos 4-6 células por condição.
   3. Selecione a guia Máscara e realizar estatísticas de máscara.
   4. Check 'máscara inteira', expanda opção cross-channel e selecione dador FRET normalizada (N-FRET) (FRET / PCP). O valor de N-FRET é representativo da actividade de PKA na membrana plasmática.
   5. Adicionar time-stamps, olha-up mesa e barra de escala usando as anotações.

Results

Para estudar o efeito da MRP4 sobre a migração de fibroblastos, utilizou-se um ensaio de cicatrização utilizando microscopia de alto teor ^14. Feridas exactos foram feitas em monocamadas confluentes de MEFs isoladas a partir de qualquer MRP4 ^{- / -} ou MRP4 ^{+ / +} ratinhos, e as imagens foram tiradas em intervalos de 1 hora durante 24 horas. Observou-se uma taxa de migração mais elevada para MRP4 ^{- / -}

Discussion

A migração celular é um processo intrincado que desempenha papéis indispensáveis em muitos eventos fisiológicos importantes, incluindo a cicatrização de feridas^1,2. Migrações celulares aberrantes podem causar eventos catastróficos, como metástase tumoral e angiogênese^24,25. Portanto, a regulação ajustada da migração celular é necessária para manter a função normal do corpo.

Usando microscopia de alto conteúdo¹⁸, demonstramos que MEFs deficientes em MRP4 migram ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Lipofectamine 2000	Invitrogen(Carlsbad, CA)	11668-027
DMEM	Invitrogen (Carlsbad, CA)	11965-092
IncuCyte Zoom	Essen BioScience
96-well IncuCyte Image-Lock microplacas	Essen BioScience	4493
Latrunculin B	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).	L5288	Estoque em DMSO
H-89	Enzo Life Sciences (Farmingdale, NY)	BML-EI196	Estoque em pratos DMSO
com fundo de vidro de 35 mm	(Corporação MatTek; Ashland, MA)	P35G-1.5-20-C
Fibronectina	Sigma-Aldrich (St. Louis, MO).	F1141
Opti-MEM Reduced Serum Media	Invitrogen (Carlsbad, CA)	31985-088
	Microscópio invertido Olympus (IX51)
Câmera CCD	Hamamatsu, Japão	ORCA285
software SlideBook 5.5	Intelligent Imaging Innovation ( Denver, CO)
Ingenuity Pathway Analysis software	IPA, QIAGEN Redwood City,Forskolin
	Tocris (Ellisville, MO).	1099	Estoque em 100% EtOH
DMEM F-12	Invitrogen (Carlsbad, Califórnia)	11330-057
HBSS	Invitrogen (Carlsbad, CA)	14025-134
Excel	Microsoft
PBS	Invitrogen(Carlsbad, CA)	10010-023
Solução de Tripsina/EDTA (TE)	Invitrogen(Carlsbad, CA)	R-001-100
Penicilina-Estreptomicina	Invitrogen(Carlsbad, CA)	15140-122