Métodos para estudar MRP4 contendo Complexos Macromoleculares no regulamento de Fibroblasto Migração

Chandrima Sinha; Kavisha Arora; Anjaparavanda P. Naren

doi:10.3791/53973

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Artigo de método

Métodos para estudar MRP4 contendo Complexos Macromoleculares no regulamento de Fibroblasto Migração

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DOI:

10.3791/53973

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19 de maio de 2016

Chandrima Sinha^*¹^,² , Kavisha Arora^*¹ , Anjaparavanda P. Naren¹^,²

¹Division of Pulmonary Medicine, Department of Pediatrics, Cincinnati Children’s Hospital Medical Center, ²Department of Physiology, University of Tennessee Health Science Center

^* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

MRP4 regula vários eventos de sinalização dependentes de nucleótidos cíclicos, incluindo um papel recentemente elucidados na migração de células. Nós descrevemos uma abordagem direta, mas multifacetada para desvendar os alvos moleculares jusante de MRP4 resultando em identificação de um interactome MRP4 única que desempenha um papel-chave na regulação afinado da migração de fibroblastos.

Resumo

Multidrug proteína de resistência 4 (MRP4) é um membro da família de cassete de ligação de ATP dos transportadores de membrana e é um transportador de efluxo endógena de nucleótidos cíclicos. Modulando concentração de nucleótido cíclico intracelular, MRP4 pode regular vários eventos celulares dependentes de nucleotídeos cíclicos, incluindo a migração celular. Anteriormente, foi demonstrado que na ausência de MRP4, células de fibroblasto de conter níveis mais elevados de nucleótidos cíclicos intracelulares e pode migrar rapidamente. Para entender os mecanismos subjacentes a este achado, adotamos uma abordagem direta ainda multifacetada. Em primeiro lugar, foram isoladas potenciais complexos de proteínas interactuantes de MRP4 a partir de um sistema de célula de MRP4 sobre-expressão usando imunoprecipitação seguida por espectrometria de massa. Após a identificação de proteínas específicas no interactoma MRP4, utilizou Engenho Pathway Analysis (IPA) para explorar o papel destas interacções proteína-proteína no âmbito da transdução de sinal. Nós elucidou o potencial papel do complexo de proteína de MRP4 na migração celular e identificado F-actina como um importante mediador do efeito de MRP4 sobre a migração celular. Este estudo também enfatizou o papel da cAMP e cGMP como jogadores-chave nos fenómenos migratórios. Utilizando microscopia de elevado teor, realizamos ensaios de migração celular e observou-se que o efeito de MRP4 sobre a migração de fibroblastos é completamente abolida por disrupção do citoesqueleto de actina ou a inibição da cinase A dependente de AMPc (PKA). Para visualizar sinalização modulações numa célula migrar em tempo real, que utilizado um sensor baseado em TERF para medir a actividade de PKA e encontrado, a presença de actividade de PKA mais polarizada perto do bordo de ataque da migração de MRP4 ^{- / -} de fibroblastos, em comparação com MRP4 ^{+ / +} fibroblastos. Este por sua vez, o aumento na formação de actina cortical aumentada e o processo de migração. A nossa abordagem permite a identificação das proteínas que actuam a jusante para MRP4 e fornece-nos com um excessovista do mecanismo envolvido na regulação dependente de MRP4 da migração de fibroblastos.

Introdução

A migração celular é um processo multi-passo complicado. Estudos têm demonstrado que durante a células de migração são polarizada em bordos de ataque e de fuga. Ao aderir à matriz extracelular, o bordo de ataque fornece a força necessária para o corpo da célula para se mover para a frente. Finalmente, os acessórios traseiros de arrasto lançamentos de ponta e completa o ciclo de ^1,2 a migração.

polarização celular para a migração celular eficiente é regulada pela segregação espacial de sinalização intracelular. Segundos mensageiros celulares, tais como cAMP, mediar a compartimentalização dos eventos de sinalização requeridos par....