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Artigo de método

Desenvolvimento de um

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DOI:

10.3791/53974

⸱

10 de junho de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Clinical Laboratory, The University of Tokyo Hospital, 2Department of Respiratory Medicine, The University of Tokyo Hospital

Neste artigo

Resumo

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e a aplicação de um ensaio de contração em gel para avaliar a função contrátil em células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal.

Resumo

A fibrose está frequentemente envolvida na patogênese de várias doenças crônicas progressivas, como doença pulmonar intersticial. A característica patológica é a formação de focos fibroblásticos, que está associada à gravidade da doença. Propõe-se que as células mesenquimais que consistem nos focos fibroblásticos sejam derivadas de várias fontes celulares, incluindo fibroblastos intrapulmonares originalmente residentes e fibrócitos circulantes da medula óssea. Recentemente, as células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal (EMT) também devem contribuir para a patogênese da fibrose. Além disso, a EMT pode ser induzida pela transformação do fator de crescimento β, e a EMT pode ser aumentada por citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral α. O ensaio de contração em gel é um modelo in vitro ideal para a avaliação da contratilidade, que é uma das funções características dos fibroblastos e contribui para o reparo e fibrose de feridas. Aqui, o desenvolvimento de um ensaio de contração em gel é demonstrado para avaliar a capacidade contrátil de células mesenquimais submetidas a EMT.

Introdução

Fibrose está envolvida na patogénese de várias doenças progressivas, crónicas, tais como doença intersticial pulmonar, fibrose cardíaca, cirrose hepática, insuficiência renal terminal, esclerose sistémica, doença auto-imune e uma. Entre as doenças pulmonares intersticiais, fibrose pulmonar idiopática (PIF) é uma doença progressiva crónica e mostra mau prognóstico. marco patológico da FPI é o desenvolvimento de focos fibroblásticos consistindo de fibroblastos activados e miofibroblastos que estão associados com o prognóstico. As origens de tais fibroblastos pulmonares são propostos para ser derivadas de várias células mesenquimais, incluindo fibroblastos pulmonares originalmente residentes e fibrócitos que circulam a partir de medula óssea. Recentemente, tem sido proposto transição epitelial-mesenquimal (EMT) para ser associada com a formação de células mesenquimais 2, e para contribuir para a patogénese de doenças fibróticas.

Pensa-se que o EMT desempenha um papel importante no processo de desenvolvimento fetal, a cicatrização de feridas, e progressão do cancro, incluindo a invasão do tumor e metástases 3. Seguindo o processo de EMT, células epiteliais obter a capacidade das células mesenquimais por perda de marcadores epiteliais, tais como E-caderina, e através da expressão de marcadores de mesenquimais, tais como, a vimentina e α-actina de músculo liso (SMA) 4,5. Estudos anteriores demonstraram a evidência de que EMT processo tem sido associada com o desenvolvimento de tecido fibroso no rim e pulmão 6 7. Além disso, a inflamação crónica promove doença fibrótica 8; Além disso, tais citocinas inflamatórias como o factor de necrose tumoral membro da superfamília 14 (TNFSF14; LUZ), -α factor de necrose tumoral (TNF) e interleucina-1β, têm sido mostrados para melhorar EMT 9-12.

ensaio de contracção de gel de colagénio, um ensaio de contracção celular à base de colagénio, em que os fibroblastos são incorporados no tipo Igel de colagénio tridimensional, é um modelo in vitro ideal para a avaliação da contractilidade. Contractilidade é uma das funções características de fibroblastos e contribui para a reparação de feridas normal e fibrose 13. Neste ensaio, pensa-se que a fixação de fibroblastos ao colágeno tipo I através de mecanismos dependentes de integrina é suposto para produzir tensão mecânica sob certas condições, e, consequentemente, levar à contração do tecido.

Aqui, o desenvolvimento do ensaio de contracção de gel é referido como sendo adaptado para avaliar a aquisição da função contráctil nas células que foram submetidos a EMT. Este relatório demonstra que este ensaio modificado é adequado para avaliar a contratilidade em células mesenquimais que foram submetidos a EMT.

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Protocolo

1. Preparações e cultivo de células epiteliais do pulmão

  1. As células epiteliais do pulmão humano A549 (linha de cultura de células aderentes) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.
  2. Remover e descartar o meio de cultura celular a partir de placa de cultura, e lava-se uma vez com 5 - 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após a lavagem, aspirar imediatamente o PBS.
  3. Adicionar 2 ml de ácido Tripsina / etilenodiaminotetra-acético (EDTA) (0,05%) e incuba-se a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 min.
  4. Recolher as células isoladas em tubos de centrífuga contendo meio de cultura de células, os tubos de centrifugação à TA durante 4 minutos a 150 x g.
  5. Ressuspender as células sedimentar em 2 ml de meio de cultura celular e remover uma amostra para contagem de células. Contar o número de células utilizando um hemocitómetro com Trypan mancha azul para verificar a viabilidade das células.
  6. As células A549 semente sobre10 cm placas de poliestireno com uma densidade de 0,5 - 1,0 x 10 6 células / prato com 10 ml de meio para o ensaio de contracção do gel. Semear as células em placas de 6 cavidades de poliestireno com uma densidade de 0,5 - 1,0 x 10 5 células / poço com 2 ml de meio de confirmação EMT. Incubar as células a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 24 horas.

2. EMT Procedimento

  1. Adicionar 10 ul de TGF-β1 (5 ug / ml) e 10 ul de TNF-α (10 ug / ml) para a placa de ensaio de contracção de gel semeada na etapa 1.6. Adicionar 2 mL de TGF-β1 (5 ug / ml) e 2 ul de TNF-α (10 ug / ml) à placa a confirmação EMT semeadas no passo 1.6. Incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 48 horas.

3. Confirmação de EMT Procedimento por PCR e Western Blotting

  1. Confirmar alteração na morfologia (a partir de pedra-como remendar a fuso forma) das células tratadas por meio de microscopia de contraste de fase.
    Nota: NormaAs células A549 al têm aparência godo tipo pedra e triangulares, que é uma característica das células epiteliais, mas após estimulação com TGF-β1 e TNF-α, as células aparecem longo e em forma de fuso que é semelhante às células mesenquimais 14,15.
  2. Avaliar a expressão de um marcador epitelial, tal como E-caderina, e marcadores de mesenquimais, tais como N-caderina, vimentina, actina de músculo liso-α usando PCR ou transferência de Western.
    1. Extrair o ARN total a partir das células utilizando o kit de extracção de ARN 16 e sintetizar ADNc, utilizando transcriptase reversa 17 de acordo com o protocolo do fabricante.
    2. Medir a expressão dos níveis de ARNm utilizando PCR em tempo real do sistema 18 e corante de cianina monomérico Kit de PCR de acordo com as instruções dos fabricantes. Os iniciadores específicos para GAPDH (gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase), ACTA2 (alfa-actina-2), CDH1 (caderina-1; E-caderina), e VIM (vimentina) são mostrados na Tabela 1 .
    3. Lisar as células, utilizando um tampão de lise (Tabela 2), contendo 1% de cocktail inibidor de protease. Medir todas as concentrações de proteína de amostra utilizando um kit de ensaio de proteína 19,20, e aplicar as mesmas quantidades de proteína para um gel de poliacrilamida.
      1. Realizar SDS-gel de electroforese e transferência semi-seco das proteínas para uma membrana de PVDF 21. Incubar a membrana com anticorpos primários em tampão de bloqueio durante 1 - 2 h. Após a incubação, lavar duas vezes a membrana com tampão de lavagem e incubar a membrana 1 h com segundos anticorpos.
        Nota: Veja a Tabela de materiais / equipamentos para detecção de anticorpos e diluições utilizadas nestes estudos. Ver Tabela 2 para os componentes do tampão de bloqueio.
      2. Lava-se a membrana com tampão de lavagem por duas vezes. Tire fotos da membrana com o kit de detecção de Western blot 22 usando um CCD frio câmera 11,23.

4. Gel Contração Ensaio de Avaliação EMT

  1. Aspirar o meio condicionado a partir do recipiente de cultura de células, e lava-se bem com 5 - 10 ml de PBS para remover as células mortas. Após a lavagem, aspirar imediatamente o PBS.
  2. Adicionar 2 ml de 0,05% de tripsina / EDTA e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 min.
  3. Recolher as células isoladas em tubos de centrífuga contendo DMEM suplementado com inibidor de tripsina (1 mg / ml), centrifugar os tubos à temperatura ambiente durante 4 minutos a 150 x g.
  4. Misture tipo gel de colagénio 1 com água destilada, e 4 × DMEM concentrado para ajustar o volume para se atingir uma concentração de colagénio de 1,75 mg / ml, e 1 x concentração de DMEM. Certifique-se de manter o meio de gel em gelo durante esta etapa.
    Nota: Para efectuar a 6 ml de meio de gel, misturar bem 3,5 ml de gel de colagénio de tipo 1 (3 mg / ml), 1,5 ml de 4 × DMEM concentrada, e 1 ml de água destilada.
  5. Ressuspender o sedimento celular em 500 ul de PBS e remover uma amostra para contagem de células. Contagemo número de células utilizando um hemocitómetro com corante azul de tripano para verificar a viabilidade das células.
  6. Adicionar a forma de gel para ajustar os volumes para atingir uma densidade celular de 3,0 x 10 5 células / poço (6,0 x 10 5 células / ml) e cuidadosamente mas rapidamente misturá-lo por pipetagem sem gelificação.
  7. Pipetar 0,5 mL da mistura em cada cavidade de uma placa de 24 poços não-tratada de forma rápida e cuidadosamente para ter a forma cilíndrica pura. Tenha cuidado para não permitir que as bolhas de ar para contaminar os géis (Figura 1A).
    Nota: O meio de gel que contém as células é viscoso e pode facilmente gel e forma forma crescente no poço.
  8. Incubar a placa durante 15 minutos numa incubadora celular a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade para gelificar completamente.
  9. Retire a placa de géis sem quebrar, movendo uma espátula esterilizada de forma a tirar uma circunferência numa direcção. Com uma espátula, transferir cuidadosamente os géis para pratos de cultura de tecidos de 60 mmcontendo 5 ml de DMEM / FBS a 1%, com ou sem TGF-β1 (5 ng / ml) e TNF-α (10 ng / ml).
  10. Agite suavemente os pratos para garantir géis estão flutuando no meio. Incubar numa incubadora celular a 37 ° C, 5% de CO 2 e 95% de humidade.

5. Medição de Gel Tamanho

  1. Medir o tamanho do gel de colagénio após 0, 24, 48, e 72 h usando um sistema de análise de imagem.
    1. Ligue o sistema de documentação do gel (Figura 2A), e colocar pratos no armário de blindagem leve. Em seguida, retire a tampa de pratos no armário.
    2. Abra o software de análise de gel relacionado. Clique no botão "aquisição de imagem" no menu do bar para mostrar a imagem dos géis no gabinete. Em seguida, clique em "adquirir" na barra de menu para tirar fotos dos géis (Figura 2B).
    3. Clique no botão "detecção" na barra de menu (Figura 2C) e ajustar a região de medição (círculo i amarelon Figura 2C), arrastando o mouse. Em seguida, clique no botão "auto-detectar" na barra de menu (veja o botão na Figura 2D). O software detecta automaticamente os geles que mostram um mapa térmico (Figura 2D).
    4. Clique em "OK" para extrair o contorno dos géis de processamento de imagem e calcular áreas cercadas pelo contorno (Figura 2E). Depois que a área é calculada, a área calculada é exibida na janela pop-up separada.
      Nota: Se os géis sobrepõem uns aos outros durante a imagem, mova géis suavemente com uma ponta de pipeta estéril.

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Resultados

Durante EMT, células epiteliais perdem marcadores epiteliais, como a E-caderina, e ganhar a expressão de marcadores mesenquimais, como vimentina e músculo α-suave agindo 4,5. A incubação de células epiteliais do pulmão humano A549 com TGF-β1 e TNF-α induz EMT. O aparecimento de células A549 normais são de calçada como forma e forma de triângulo, que é uma característica de células epiteliais (Figura 3A), mas depois estimuladas com TGF-β1 e TNF-α, a aparência a...

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Discussão

O protocolo desenvolvido neste estudo compreende duas etapas. O primeiro passo é realizado para induzir EMT, enquanto o segundo passo é o ensaio de contracção do gel. Uma vez que é importante para confirmar que as células foram submetidos a EMT, passo 2 proporciona um excelente complemento para as alterações morfológicas e expressão de genes. Estudos anteriores mostraram que as células de EMT A549 foi induzida por apenas 24 TGF-β1; No entanto, como já relatado anteriormente 10, o tratamento TNF-α a...

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Divulgações

Os autores não têm conflitos de interesse para divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos ao Dr. Tadashi Koyama pela ajuda técnica. Este trabalho foi apoiado em parte pelos números de concessão JSPS KAKENHI 23249045, 15K09211, 15K19172; uma bolsa para o Grupo de Pesquisa em Insuficiência Respiratória do Ministério da Saúde, Trabalho e Bem-Estar, Japão; uma bolsa para pesquisa em doenças alérgicas e imunologia, Japão.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEMsigma aldrich11965-092para A549 médio
FBSGIBCO10437
Fator de Crescimento Transformador-β 1, humano, produtos químicos recombinantes209-16544laboratório de Wako
TNF-&alpha humano recombinante;R& D systems210-TA/CF
E-Caderina (24E10) Tecnologiade Sinalização de Células#3195diluição 1:3,000
Vimentina (D21H3) Tecnologiade Sinalização de Células#5741diluição 1:3,000
Anti-&alfa;-Tubulina anticorposigma aldrichT9026diluição 1:10,000
Anti-Actina Monoclonal, &alfa;-Anticorpo de Músculo Liso& nbsp;sigma aldrichA5228diluição 1:10.000
Anticorpo anti-N-caderinaBD Transduction Laboratories#6109201:1.000 diluição
Anti-Mouse IgG, Ovino Ab Inteiro Ligado a HRP (anticorpo secundário)GE HealthcareNA931-100ULDiluição 1:20.000
Anti-Rabbit IgG, Burro Ab Inteiro Ligado a HRP (anticorpo secundário)GE HealthcareNA934-100UL1:20.000 reagente bloqueador de diluição
GE HealthcareRPN4182% em TBS-T
6 Placa de cultura de células multipoços tratadas com TC de fundo plano transparente, com tampacorning#353046
100 mm Placa de cultura de célulasTPP#93100
DMEM, tecnologiasde vida em12100-046Para 4&vezes; DMEM
Gel de colágeno tipo 1Gelatina NittaCellmatrix tipo I-A
24 WellAGC TECHNO GLASS1820-024
Sistema de Documentação de Gel ATTOAE-6911FXNGerador de imagens em gel
Software de análise em gelATTODensitograph, ver. 3.00software de análise fornecido com AE-6911FXN
Tripsina-EDTA (0,05%), tecnologias de vida útil de vermelho de fenol25300054
placas de 24 poços, solução não tratadaIWAKI1820-024
Trypan Blue, 0,4%life technologies15250-061
Kit de extração de RNAQiagen74106
Tecnologias de vidade transcriptase reversa18080044
Sistema de PCR em tempo realStratageneMx-3000P
SYBR kit de PCR verdeQiagen204145
Inibidor de Protease Coquetel (100x)life technologies78429
MembranaPVDFKitde
bio-rad5000006JA 
Gel de poliacrilamidaATTO2331810
Western blotting reagente de detecçãoGE HealthcareRPN2232
câmera CCD friaATTOEz-Capture MG / ST
inibidor de tripsinasigma aldrichT9003-100MG
Polioxietileno (20) monolaurato de sorbitanoWako Produtos químicos de laboratório163-11512
Éter octifenílico de polioxietileno (9)Produtos químicos de laboratório Wako141-08321
do mAb de Coelho mAb de Coelho pó Placa de cultura de células ensaio de proteína ATTO 2392390

Referências

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