Desenvolvimento de um In Vitro Ensaio para avaliar contrátil Função de células mesenquimais que a transição epitelial-mesenquimal Sofreu

Summary

Aqui, descrevemos o desenvolvimento e a aplicação de um ensaio de contração em gel para avaliar a função contrátil em células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal.

Abstract

A fibrose está frequentemente envolvida na patogênese de várias doenças crônicas progressivas, como doença pulmonar intersticial. A característica patológica é a formação de focos fibroblásticos, que está associada à gravidade da doença. Propõe-se que as células mesenquimais que consistem nos focos fibroblásticos sejam derivadas de várias fontes celulares, incluindo fibroblastos intrapulmonares originalmente residentes e fibrócitos circulantes da medula óssea. Recentemente, as células mesenquimais que sofreram transição epitelial-mesenquimal (EMT) também devem contribuir para a patogênese da fibrose. Além disso, a EMT pode ser induzida pela transformação do fator de crescimento β, e a EMT pode ser aumentada por citocinas pró-inflamatórias, como o fator de necrose tumoral α. O ensaio de contração em gel é um modelo in vitro ideal para a avaliação da contratilidade, que é uma das funções características dos fibroblastos e contribui para o reparo e fibrose de feridas. Aqui, o desenvolvimento de um ensaio de contração em gel é demonstrado para avaliar a capacidade contrátil de células mesenquimais submetidas a EMT.

Introduction

Fibrose está envolvida na patogénese de várias doenças progressivas, crónicas, tais como doença intersticial pulmonar, fibrose cardíaca, cirrose hepática, insuficiência renal terminal, esclerose sistémica, doença auto-imune e ^uma. Entre as doenças pulmonares intersticiais, fibrose pulmonar idiopática (PIF) é uma doença progressiva crónica e mostra mau prognóstico. marco patológico da FPI é o desenvolvimento de focos fibroblásticos consistindo de fibroblastos activados e miofibroblastos que estão associados com o prognóstico. As origens de tais fibroblastos pulmonares são propostos para ser derivadas de várias células mesenquimais, incluindo fibroblastos pu....

Protocol

1. Preparações e cultivo de células epiteliais do pulmão

1. As células epiteliais do pulmão humano A549 (linha de cultura de células aderentes) em Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 100 UI / ml de penicilina, e 100 ug / ml de estreptomicina.
2. Remover e descartar o meio de cultura celular a partir de placa de cultura, e lava-se uma vez com 5 - 10 ml de solução salina tamponada com fosfato (PBS). Após a lavagem, aspirar imediatamente o PBS.
3. Adicionar 2 ml de ácido Tripsina / etilenodiaminotetra-acético (EDTA) (0,05%) e incuba-se a 37 ° C e 5% de CO ₂ durante 3 min.
4. Re....

Results

Durante EMT, células epiteliais perdem marcadores epiteliais, como a E-caderina, e ganhar a expressão de marcadores mesenquimais, como vimentina e músculo α-suave agindo ^4,5. A incubação de células epiteliais do pulmão humano A549 com TGF-β1 e TNF-α induz EMT. O aparecimento de células A549 normais são de calçada como forma e forma de triângulo, que é uma característica de células epiteliais (Figura 3A), mas depois estimuladas com TGF-β1 e TNF-α, a aparência a.......

Discussion

O protocolo desenvolvido neste estudo compreende duas etapas. O primeiro passo é realizado para induzir EMT, enquanto o segundo passo é o ensaio de contracção do gel. Uma vez que é importante para confirmar que as células foram submetidos a EMT, passo 2 proporciona um excelente complemento para as alterações morfológicas e expressão de genes. Estudos anteriores mostraram que as células de EMT A549 foi induzida por apenas ²⁴ TGF-β1; No entanto, como já relatado anteriormente ^10, o tratamento TNF-α a.......

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
DMEM	sigma aldrich	11965-092	para A549 médio
FBS	GIBCO	10437
Fator de Crescimento Transformador-β 1, humano, produtos químicos recombinantes	209-16544		laboratório de Wako
TNF-&alpha humano recombinante;	R& D systems	210-TA/CF
E-Caderina (24E10) Tecnologia	de Sinalização de Células	#3195	diluição 1:3,000
Vimentina (D21H3) Tecnologia	de Sinalização de Células	#5741	diluição 1:3,000
Anti-&alfa;-Tubulina anticorpo	sigma aldrich	T9026	diluição 1:10,000
Anti-Actina Monoclonal, &alfa;-Anticorpo de Músculo Liso& nbsp;	sigma aldrich	A5228	diluição 1:10.000
Anticorpo anti-N-caderina	BD Transduction Laboratories	#610920	1:1.000 diluição
Anti-Mouse IgG, Ovino Ab Inteiro Ligado a HRP (anticorpo secundário)	GE Healthcare	NA931-100UL	Diluição 1:20.000
Anti-Rabbit IgG, Burro Ab Inteiro Ligado a HRP (anticorpo secundário)	GE Healthcare	NA934-100UL	1:20.000 reagente bloqueador de diluição
	GE Healthcare	RPN418	2% em TBS-T
6 Placa de cultura de células multipoços tratadas com TC de fundo plano transparente, com tampa	corning	#353046
100 mm Placa de cultura de células	TPP	#93100
DMEM, tecnologias	de vida em	12100-046	Para 4&vezes; DMEM
Gel de colágeno tipo 1	Gelatina Nitta	Cellmatrix tipo I-A
24 Well	AGC TECHNO GLASS	1820-024
Sistema de Documentação de Gel	ATTO	AE-6911FXN	Gerador de imagens em gel
Software de análise em gel	ATTO	Densitograph, ver. 3.00	software de análise fornecido com AE-6911FXN
Tripsina-EDTA (0,05%), tecnologias de vida útil de vermelho de fenol		25300054
placas de 24 poços, solução não tratada	IWAKI	1820-024
Trypan Blue, 0,4%	life technologies	15250-061
Kit de extração de RNA	Qiagen	74106
Tecnologias de vida	de transcriptase reversa	18080044
Sistema de PCR em tempo real	Stratagene	Mx-3000P
SYBR kit de PCR verde	Qiagen	204145
Inibidor de Protease Coquetel (100x)	life technologies	78429
Membrana	PVDFKit	de
	bio-rad	5000006JA
Gel de poliacrilamida	ATTO	2331810
Western blotting reagente de detecção	GE Healthcare	RPN2232
câmera CCD fria	ATTO	Ez-Capture MG / ST
inibidor de tripsina	sigma aldrich	T9003-100MG
Polioxietileno (20) monolaurato de sorbitano	Wako Produtos químicos de laboratório	163-11512
Éter octifenílico de polioxietileno (9)	Produtos químicos de laboratório Wako	141-08321