Artigo de método

Avaliação simultânea de Cardiomyocyte DNA Síntese e Ploidia: Um Método de Assistência Quantificação dos cardiomiócitos Regeneração e volume de negócios

DOI:

10.3791/53979

⸱

23 de maio de 2016

1Institute of Genetic Medicine, International Centre for Life, Newcastle University

Neste artigo

Resumo

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A quantificação da renovação de cardiomiócitos é um desafio. O protocolo aqui descrito faz uma contribuição importante para esse desafio, permitindo a quantificação precisa e sensível da geração de núcleos de neocardiomiócitos e ploidia de núcleos.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Embora se aceite que o coração tem um limitado potencial para regenerar cardiomiócitos após a lesão e que os baixos níveis de volume de negócios de cardiomiócitos ocorrem durante o envelhecimento normal, quantificação desses eventos permanece desafiador. Isto é em parte devido à raridade do processo e o fato de que várias fontes celulares contribuem para a manutenção do miocárdio. Além disso, a duplicação do ADN dentro de cardiomiócitos muitas vezes leva a uma cardiomiócitos poliplóide e apenas raramente conduz a novos cardiomiócitos por divisão celular. A fim de quantificar com precisão o volume de negócios cardiomiócitos discriminação entre estes processos é essencial. O protocolo aqui descrito emprega rotulagem nucleósido a longo prazo de forma a marcar todos os núcleos que surgiram como resultado de núcleos de replicação de ADN e de cardiomiócitos identificados através da utilização de núcleos e subsequente isolamento de imunomarcação PCM1. Em conjunto, isto permite a identificação precisa e sensível da rotulagem do nucleósido Cardiomyocyte população de núcleos. Além disso, 4 ', rotulagem e análise de ploidia núcleos 6-diamidino-2-fenilindole, permite a discriminação de núcleos neo-cardiomiócitos de núcleos que incorporaram nucleósido durante poliploidização. Embora este método não pode controlar para binucleação cardiomiócitos, permite uma quantificação rápida e robusta de núcleos neo-cardiomiócitos, enquanto respondendo por poliploidização. Este método tem uma série de aplicações a jusante, incluindo a avaliação das terapias potenciais para melhorar cardiomiócitos regeneração ou a investigar os efeitos da doença cardíaca no volume de negócios de cardiomiócitos e ploidia. Esta técnica é também compatível com técnicas de imuno-histológicos adicionais a jusante, permitindo a quantificação de incorporação nucleósido em todos os tipos de células cardíacas.

Introdução

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Nos últimos anos tem havido um acúmulo de evidências desafiando a suposição de que o coração está, a 1,2 órgão pós-mitótico terminalmente diferenciadas. No entanto, a quantificação do volume de negócios dos cardiomiócitos e regeneração continua sendo um desafio.

As dificuldades em identificar com precisão a geração de cardiomiócitos rara utilizando técnicas de imuno-histoquímica padrão são bem relatado 3. Além disso, a fonte celular de geração de cardiomiócitos permanece incerto com evidência para as contribuições pela proliferação de cardiomiócitos, bem como por diferenciação de células estaminais 4-6. Portanto, a utilização dos modelos de rastreio de linhagem que requerem o conhecimento do fenótipo de cardiomiócitos progenitora é impossível e quantificação da proliferação de uma população única, incluindo cardiomiócitos, é inadequado. Além disso, um dos cardiomiócitos tem o potencial para endoreplication sem cariocinese (resultando em um carro poliplóidediomyocyte) ou cariocinese na ausência de citocinese (resultando numa cardiomiócitos binucleadas) 7,8. A quantificação exacta do volume de negócios cardiomiócitos depende da capacidade de distinguir entre estes eventos e verdadeiro geração neo-cardiomiócitos. Isto cria complicações únicas porque a replicação do ADN e a expressão de quinases dependentes de ciclina em cardiomiócitos não demonstram exclusivamente divisão celular verdadeiro 9,10.

Para auxiliar na quantificação da produção de neo-cardiomiócito, que se combinaram uma técnica de isolamento de núcleos estabelecida, e rotulagem imunológica de material pericentriolar 1 (PCM1) para identificação núcleos dos cardiomiócitos como descrito por Bergmann et ai. 7,11 com novos métodos de longo prazo de marcação de ADN e análise de ploidia. PCM-1 é uma proteína que se acumula centrossoma na superfície nuclear de miócitos diferenciados, sem o ciclo. Estudos anteriores demonstraram que os anticorpos contraPCM-1 rotular especificamente núcleos dos cardiomiócitos 7,11 e como tal PCM1 tem sido usado por um certo número de grupos independentes para identificar cardiomiócitos 1,12,13. Além disso, nós demonstramos que a expressão PCM1 mapeia para os núcleos dos cardiomiócitos geneticamente marcados no modelo de TNT-cre rato transgénico 14 (Recurso Figura 1).

O protocolo aqui descrito permite a identificação precisa e sensível de geração de cardiomiócitos núcleos neo no coração de rato, independentemente das origens celulares (Figura 1A e B), enquanto, simultaneamente, excluindo rotulagem nucleósido devido a poliploidização a partir da análise (Figura 1C e D). Embora este método não pode controlar para binucleação cardiomiócitos, permite uma quantificação rápida e robusta de núcleos neo-cardiomiócitos que é necessário para a quantificação exacta do volume de negócios dos cardiomiócitos. Além disso,ele fornece uma ferramenta de triagem rápida de avaliar potenciais mudanças na dinâmica de geração de cardiomiócitos.

Enquanto marcação de ADN geralmente envolve 5-bromo-2'-desoxiuridina (BrdU) como o análogo da timidina, o protocolo descrito aqui utiliza um ensaio de 5-etinil-2'-desoxiuridina (EdU) com base, uma vez que requer menos passos de processamento para um mais rápido através colocar-e não requer a desnaturação do DNA para detecção de imuno-, que o torna compatível com outros protocolos de imunocoloração e aumentando assim os potenciais aplicações a jusante do método.

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Figura 1: pulsação contínua com EdU etiquetas neo-cardiomiócitos, independentemente de seus progenitores. (A) EdU está incorporado no ADN de cardiomiócitos durante a divisão celular. Proliferação na população de cardiomiócitos vai Result em um aumento no, ou a substituição de cardiomiócitos e é, por conseguinte, a síntese de ADN produtiva (contribui para a manutenção e reparação de tecidos). (B) EdU está incorporado no ADN de células progenitoras cardíacas durante a divisão celular. Isto irá ser retido na célula durante a diferenciação para a linhagem de cardiomiócitos. Esta diferenciação de células estaminais também vai resultar num aumento do número de cardiomiócitos e, por conseguinte, contribui para a manutenção e a reparação dos tecidos. (C) Os cardiomiócitos têm o potencial para sofrer replicação de ADN "não produtiva" resultando em aumento da ploidia cardiomiócito, que está associado com hipertrofia de cardiomiócitos e remodelação do miocárdio, mas não substitui cardiomiócitos perdidos. O processo de poliploidização difere binucleação, que resulta em um dos cardiomiócitos com um único núcleo, que contém quatro ou mais conjuntos de dois cromossomas homólogos (> 2 N). (D) Na sequência de um núcleo contínuo pulse, este protocolo descreve o isolamento de núcleos e identificação dos núcleos dos cardiomiócitos por expressão PCM1 para permitir a quantificação de ambos ploidy cardiomiócitos e Edu incorporação. Expressão PCM1 e incorporação EdU detectada por citometria de fluxo. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Protocolo

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trabalho animal foi autorizado e aprovado pelo conselho de revisão Newcastle Ética da Universidade. Todos os procedimentos com animais foram realizados em conformidade com as diretrizes da Directiva 2010/63 / UE do Parlamento Europeu sobre a protecção dos animais utilizados para fins científicos.

1. Administração EdU

  1. Dissolver EdU em solução salina estéril (0,9% w / v) a uma concentração final de 12,5 mg / ml.
    1. Aquece-se a solução para 40 ° C e agitar com vortex para dissolver completamente. Armazenar o suficiente EdU / solução salina a 4 ° C para injectar todos os ratinhos no estudo permitindo 6 injecções diárias.
      Nota: Tipicamente mais de 6 ratinhos são necessários para cada grupo experimental. No entanto, cálculos de potência deve ser realizada para estudos independentes.
  2. Pesar ratinhos individuais. Calcular o volume requerido para administrar 100 ug / g de solução / solução salina EdU para cada ratinho (8 ul de solução de reserva por EdU g).
  3. Desenhe o volum apropriadae de Edu / salina nos seringa de insulina com uma agulha 25 G.
  4. Execute intraperitoneal (ip) injeções durante o manuseio de ratos utilizando técnicas Home Office aprovados.
    1. Coloque um rato na tampa gaiola. Gentilmente puxar para trás na base da cauda e segure o mouse pela nuca.
    2. Expor o abdómen para injecção, segurando o mouse com o dedo indicador eo polegar perto da base da cabeça e inclinando a cabeça do animal para trás em direção ao chão.
    3. Limpe o abdômen com solução de álcool 70%. Localize linha média do animal e quadrante inferior direito. Injectar a solução EdU / Saline no animal para o quadrante inferior direito.
    4. Injetar ratos com uma solução / solução salina EdU e registrar a hora do dia.
  5. Repita os passos de 1,2 a 1,4 ao mesmo tempo do dia, durante 6 dias consecutivos.
    Nota: Como um controle EdU negativo é necessário para definir o gating para análise de citometria de fluxo, injetar uma idade adicional, sexo e experimentalmente corresponderrato ed com um volume equivalente de solução salina sem EdU. Isto irá fornecer o controle necessário (sem controlo da UDE). Este controlo deve ser incluída para cada estudo para permitir variações em lotes de reagentes e citómetro de configurar.

2. Corações Colhendo

  1. Às 24 h após a injeção EdU 6º, sacrificar ratos usando deslocamento cervical (ou de um esquema alternativo 1 Home Office aprovado método).
  2. Coloque o animal sacrificado em decúbito dorsal e fazer incisão na pele a partir de meados do abdômen para o diafragma com uma tesoura cirúrgica.
  3. Cortar o diafragma, e segurando o esterno afastado da cavidade do corpo, corta bilateralmente para expor o coração.
  4. Levante o coração um pouco e cortar os vasos sanguíneos principais da via de saída para dissecar o coração fora da cavidade torácica.
  5. Colocar imediatamente cada coração para um tubo de centrífuga de 15 ml individuais contendo 10 ml de PBS arrefecido a 4 ° C.
  6. Transferir corações para separate 10 cm placas de Petri, utilizando um bisturi cortar cada coração em dois numa orientação sagital e lavar o coração apertando suavemente com uma pinça. Em seguida substituir o PBS para remover o máximo de sangue possível. Repita esta etapa duas vezes.
  7. Coloque as duas partes de cada coração para o mesmo indivíduo 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
  8. Continue até a etapa 3 ou alternativamente espécimes armazenar -80 ° C, conforme detalhado nas etapas 2.9 e 2.10.
  9. Usando uma agulha G 25, faça um pequeno orifício na tampa do tubo de microcentrífuga para impedir que a tampa da abertura, devido à expansão dos gases quando o coração é processada.
  10. Rotular cada tubo de microcentrífuga e colocar em um recipiente de nitrogênio líquido para congelar.

3. Núcleos dissociação e Cardiomyocyte Núcleos Labeling

Nota: Este núcleos rotulagem de dissociação e cardiomiócitos núcleos é uma adaptação do que de Bergmann et al 11 Execute este procedimento em todas as amostras injetadas.com o Edu e soro fisiológico injetado (sem controlo da UDE) controle negativo. Ver Tabela 1 para a receita de soluções necessárias para executar estes passos.

  1. Para cada coração a ser analisado, colocar 36 ml de BSA a 1% / solução de PBS para um tubo de ultracentrífuga, incubar durante 30 minutos, rejeitar a solução e em seguida deixar secar ao ar.
    Nota: Este tubo é usado no passo 3.6.
  2. Coloque corações congelados individuais em um prato de 10 mm no gelo e tritura utilizando um bisturi permitindo que os corações para descongelar durante o processo de trituração.
  3. Coloque corações picadas em 15 ml de tampão de lise celular num tubo de centrífuga de 50 ml e homogeneizar com um homogeneizador de sonda durante 15 segundos a 25.000 rpm, à temperatura ambiente.
  4. Adicionar mais 15 ml de Tampão de Lise Celular para o tubo de centrífuga e transferir para um Dounce de 40 ml com uma grande folga pilão. Execute 10 cursos com o pilão e filtrar através de 100 mm, em seguida, 40 coador mm de células em um tubo de centrífuga de 50 ml.
  5. Centrifugar durante 10 minutos, umat 700 xg, a 4 ° C e remover o sobrenadante.
  6. Ressuspender o sedimento nuclear em 25 ml de sacarose Solução de gradiente e a camada de núcleos de células que contêm a solução no topo de 10 ml de solução de gradiente de sacarose fresca no tubo de ultracentrífuga preparado em 3.1.
  7. Centrifuga-se a 13000 xg durante 1 h a 4 ° C utilizando um rotor de balanço do tubo para fora.
  8. Após a centrifugação, desprezar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de núcleos em 1300 ul de tampão de armazenagem os núcleos num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e rótulo PCM1.
  9. Retirar 300 ul da suspensão para um novo tubo de microcentrifugação e adicionar aos 700 ul de tampão de armazenamento núcleos fresco. Rotular este tubo como controle ISO.
  10. Adicionar anti-PCM1 a uma concentração final de 8 ug / ml para o tubo de microcentrífuga rotulado PCM1 e adicionar anticorpo de controlo de isotipo IgG de coelho a uma concentração de 8 ug / ml para o tubo de microcentrífuga rotulado controlo ISO.
  11. Incubar durante a noite a 4 ° C. Seguindo incubção, centrifugar a 700 xg durante 10 min, descartar o sobrenadante, substitua com 1 ml de tampão de armazenamento núcleos fresco, ressuspender e centrifugar de novo durante 10 min a 700 x g. Descartar o sobrenadante e substituir com 1 ml de tampão de armazenamento núcleos fresco.
  12. Adicionar 1 ml de F (ab ') 2 de cabra anti-coelho IgG (H + L) anticorpo (FITC ou corante verde-fluorescente equivalente) para obter uma concentração final de 2 ug / ml.
    Nota: O uso de um F (ab ') 2 um fragmento de anticorpo diminui o potencial para a marcação não-específica das células imunitárias, incluindo macrófagos e células B.
  13. tubos Envoltório em folha de alumínio para proteger da luz e incubar durante 1 hora a 4 ° C.

4. Detecção de Edu Incorporação

  1. Diluído 10x concentrada EdU tampão de reacção de 1:10 com água deionizada.
  2. Centrifugar o PCM-1 e ISO controlo núcleos marcados suspensões a 700 xg durante 10 min, descartar o sobrenadante e ressuspender o sedimento de núcleos em 1 ml deBSA a 1% / solução de PBS. Lava-se a pelete duas vezes núcleos.
  3. Após a lavagem final, descartar o sobrenadante e substituir com 100 ul de EdU fixador.
  4. Enrole tubos em folha de alumínio para proteger da luz e incubar à temperatura ambiente durante 15 min.
  5. Lavam-se as amostras duas vezes com 1 ml de BSA a 1% / solução de PBS, centrifugação a 700 xg e incubar com uma solução de permeabilização à base de saponina 1x à temperatura ambiente durante 15 min.
  6. Prepare 1x cocktail rotulagem EdU (Tabela 2). Um mínimo de 2 reacções serão obrigados a incluir o controlo não EdU.
  7. Adicionar 500 ul de 1x cocktail EdU rotulagem directamente a cada amostra já contendo núcleos em 100 ul de solução de permeabilização à base de saponina 1x e incubar à temperatura ambiente protegida da luz durante 30 min.
  8. Centrifuga-se a 700 x g e ressuspender em 1 ml de 1% de BSA / PBS e repetir este passo mais duas vezes.
  9. Centrifugar a 700 xg, elimine o sobrenadante e substituir por 400 ml de solução de coloração de ADN (ver Tabela de Materiais).
Nome do reagente
1. Tampão de Lise Celular
0,32 M de sacarose
mM de Tris-HCl a 10 (pH = 8)
5 mM de CaCl2
acetato de magnésio 5 mM
EDTA 2,0 mM
0,5 mM de EGTA
1 mM de DTT
2.Sucrose Solution Gradiente
2.1 M de sacarose
mM de Tris-HCl a 10 (pH = 8)
acetato de magnésio 5 mM
1 mM de DTT
3. O tampão de armazenamento Núcleos (NSB)
0,44 M de sacarose
mM de Tris-HCl a 10 (pH = 7,2)
KCl 70 mM
10 mM de MgCl2
espermina 1,5 mM

Tabela 1: Núcleos ingredientes tampão isolamento Receita para todos os buffers usados ​​na seção de protocolo 3 (Núcleos dissociação e núcleos de cardiomiócitos rotulagem)..

5. análise citométrica de fluxo

Nota: Executar A citometria de fluxo em núcleos isolados como descrito anteriormente 7,11,15.

  1. Em primeiro lugar, criar um gráfico descrevendo Forward Scatter (FSC) e Dispersão Lateral (SSC) para permitir a discriminação de núcleos de detritos (Figura 2A).
  2. Criar um plano para discriminar núcleos individuais de agregados (Figura 2B) traçando 4 ', 6-diamidino-2-phenylindole) DAPI) área ((3-405 / 450/50-A) versus altura (33-405 / 450 / 50-H). Certifique-that da-A 50 de sinal 3-405 / 450 / é recolhido na escala linear para permitir a correta determinação do teor de DNA.
  3. Crie um gráfico descrevendo 488/535/30-A (PCM-1) vs SSC e exibir apenas os eventos a partir do portão singlet criado em 5.2, a fim de avaliar PCM-1 expressão na população singlet.
  4. Executar a amostra de controlo de isotipo, de modo a estabelecer um portão positivo PCM-1 (Figura 2C). Executar uma pequena quantidade de PCM1 marcado amostra para verificar o PCM1 expressando a posição da população e gating.
  5. Crie um gráfico descrevendo SSC-A vs 405/450/50-A (para detectar DAPI). Neste enredo, exibição somente singlet PCM1 núcleos expressando, usando as portas criadas em 5.3. Utilize este enredo para criar um portão hierárquica adicional que contém apenas 2N núcleos (Figura 2D).
  6. Criar uma trama que descreve 488/535 / 30-A vs 1-633 / 660/20-A para permitir a identificação de rotulagem EdU do PCM1 expressar população de cardiomiócitos. Exibir apenas núcleos que são singlet, P CM1 + 2N e usando o gating acima.
  7. Amostra coração executado a partir de qualquer controlo EdU para definir o portão positivo EdU (Figura 2E). Criar o portão apropriado para células Edu +.
  8. Record e quantificar singlet,, núcleos 2N PCM-1 expressando que incorporaram EdU.
  9. Calcule esta população como uma percentagem do total de camisola, PCM1 + núcleos. Isto irá fornecer a taxa de geração de núcleos neo-cardiomiócito, durante o período de impulso EdU 7 dias, como uma percentagem do total dos núcleos dos cardiomiócitos.
    Observação: Como DAPI ligação ao ADN é estequiométrica a intensidade de fluorescência é proporcional à quantidade de DNA. Determinar ploidia com base na intensidade do / 450/50 Um sinal 405, como descrito anteriormente 7.
  10. Para avaliar a ploidia dentro da população total de cardiomiócitos utilizar a trama estabelecida em 5,5 e uma estratégia de propagação com base na concentração de ADN 7.

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Figura 2:. Gating estratégia para quantificar cardiomiócitos EdU incorporação e ploidia (A) Núcleos são discriminados de detritos com base na dispersão para a frente (FSC) e dispersão lateral (SSC). (B) Um portão linear é criada e a população de núcleos singuleto é identificado com base na rotulagem DAPI e a altura 405/450/50 vs sinal área. (C) gating fluorescente permite a separação de núcleos de cardiomiócitos núcleos (PCM-1-positivo) e não-cardiomiócitos (PCM-1-negativas) a partir de tecido do coração. (D) A intensidade de sinal de DAPI é usado para determinar a concentração de ADN e, assim, os núcleos de ploidia da população de cardiomiócitos PCM1 +. No rato> 80% dos núcleos dos cardiomiócitos são diplóides (2n). (E) gating fluorescente permite a separação de 2N, os núcleos dos cardiomiócitos que incorporaram EdU (PCM + / + EDU = 0,9%) a partir de 2N, cardiomiócitos que não foram incorporados EdU (PCM + educação). Todos os passos são detalhados no protocolo 5.0. Exemplo mostrado de MDX -. / Mice y no fundo C57 / BL10 Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Resultados

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Este método permite a quantificação do aumento da incorporação de EdU devido à divisão dos núcleos dos cardiomiócitos enquanto controla o aumento da poliploidização. Usando um ensaio baseado em BrdU, demonstramos anteriormente que o coração de mamíferos responde à perda crônica de cardiomiócitos, no modelo de camundongo mdx de distrofia muscular de Duchenne, com a regeneração de novos cardiomiócitos. Usamos os métodos descritos aqui para validar ainda mais nossas descobertas publicadas e demonstrar a utilidade do protocolo. De acordo com o protocolo descrito; camundongos adultos (12 semanas de idade) MDX e controle BL10 foram pulsados com uma injeção diária de EdU por 7 dias, relatada anteriormente para permitir a análise estatística entre os grupos experimentais5,13. A análise imuno-histológica de corações pulsados demonstra a presença de cardiomiócitos expressores de PCM1 que incorporaram EdU (Figura 3A). No entanto, os dados obtidos por métodos imunohistológicos podem ser mal interpretados, pois outros tipos celulares que incorporaram EdU podem ser erroneamente identificados como cardiomiócitos. Um exemplo disso é demonstrado nas Figuras Suplementares 1A e B. Além disso, os métodos imuno-histológicos não distinguem a poliploidização da divisão nuclear. A análise de citometria de fluxo detalhada neste protocolo permite a rápida quantificação da divisão nuclear de cardiomiócitos em camundongos mdx e controle, excluindo células que incorporaram EdU devido à poliploidização. Semelhante aos dados publicados anteriormente13, a análise revelou um aumento nas taxas de geração de núcleos de neocardiomiócitos nos corações de camundongos mdx em comparação com controles pareados por idade (1,2% versus 0,17%; Figura 3B e C).

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Figura 3: Quantificação de cardiomiócitos marcados com EdU em corações selvagens e mdx. (A) Imagem de projeções de pilha Z tiradas de seções de 40 μm de espessura de corações mdx. PCM-1 expressando núcleos de cardiomiócitos (verde) que incorporou EdU (vermelho). A seta amarela indica cardiomiócitos marcados com EdU. i e ii indicam cardiomiócitos individuais marcados com EdU mostrados no plano Z. Núcleos marcados com DAPI (azul) (B e C) Citometria de fluxo de núcleos isolados mostrando gráficos representativos de camundongos selvagens de 12 a 13 semanas de idade (C57 / BL10) e mdx (mdx- / y no fundo C57 / BL10). (B) Histograma mostrando a intensidade DAPI e a discriminação entre os núcleos 2N e >2N. (C) Gráficos mostrando a incorporação de EdU na população de núcleos de cardiomiócitos 2N quando analisados conforme detalhado neste protocolo. Para todos os ratinhos, Edu foi administrado durante 1 semana a partir das 12 semanas de idade. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Suplementar Figura 1: PCM-1 é um marcador específico para núcleos de cardiomiócitos. Usando o protocolo descrito, os núcleos foram isolados do camundongo transgênico duplo produzido pelo cruzamento de camundongos TNT-cre14 com a linha repórter sensível ROSAnT / nGcre16. No camundongo resultante, a ativação do cre sob o controle do promotor da troponina T (TNT) leva à expressão irreversível de GFP com está localizada nos núcleos. Núcleos marcados com controle de isotipo (Iso) demonstram a capacidade de identificar a população de núcleos de cardiomiócitos que expressam GFP (488/530/30-A). A marcação de núcleos com anti-PCM1 (anticorpo secundário detectado por 633-660/20-A) demonstra a correlação da expressão de PCM1 com a população de núcleos de cardiomiócitos que expressam GFP. Neste exemplo, 98,8% dos núcleos de cardiomiócitos, identificados pela atividade do promotor de TNT, são marcados pelo anticorpo PCM1. Clique aqui para fazer o download da Figura Suplementar 1.

Suplementar Figura 2: Desafios para quantificar a renovação de cardiomiócitos por técnicas imuno-histológicas. (A) A imagem 2D mostra dois núcleos de cardiomiócitos que expressam PCM-1 (verde) que parecem também estar marcados para EdU (vermelho). As setas amarelas indicam o que parecem ser cardiomiócitos que incorporaram EdU. Isso se deve à aparente co-localização da expressão de PCM1 e marcação de EdU quando visualizada usando imagens 2dimensionais. (B) Uma projeção tridimensional desta imagem identifica que as células marcadas com EdU não são cardiomiócitos, mas são células não cardiomiócitos sobrepostas a núcleos de cardiomiócitos que expressam PCM1. Camundongos C57/BL10 com 12 semanas de idade utilizados para experimentos. Clique aqui para baixar a Figura Suplementar 2A. Clique aqui para baixar a Figura Suplementar 2B.

Componentes de reaçãoNúmero de reações
algarismo5
Pbs875 μl2,19 ml
Protetor de cobre 20 μl50 μl
Corante fluorescente azida de picolil 5 μl12,5 μl
Tampão de reacção diluído preparado em 4.1 100 μl250 μl
Volume total de reação1 ml2,5 ml

Tabela 2: Ingredientes do coquetel EdU. Receita para coquetel de rotulagem EdU exigida na seção 4 do protocolo (Detecção de incorporação de EdU).

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Para quantificar com precisão a renovação e regeneração dos cardiomiócitos, os ensaios devem distinguir entre a verdadeira geração de cardiomiócitos e a divisão não produtiva do DNA. Muitos estudos continuam simplesmente ignorando esses eventos não produtivos, quantificando a proliferação de cardiomiócitos apenas por meio da expressão de cinesia de ciclina e marcadores do ciclo celular. Até o momento, um único método que permite a quantificação precisa da renovação de cardiomiócitos enquanto controla esses eventos não produtivos permanece alusivo. Em particular, continua sendo difícil explicar a poliploidização dos cardiomiócitos, que contribui com até ~ 65% da replicação do DNA dos cardiomiócitos13. Portanto, para auxiliar na quantificação precisa da geração de cardiomiócitos, desenvolvemos um protocolo que permite a quantificação robusta das taxas de núcleos de neocardiomiócitos, excluindo a replicação do DNA que resulta em aumento da ploidia. Embora este protocolo não possa discriminar entre a geração de neocardiomiócitos e a binucleação de cardiomiócitos, ele pode ser usado para calcular com rapidez e precisão o limite superior (contabilizando a ploidia) da geração de cardiomiócitos. Este protocolo, portanto, fornece uma ferramenta de triagem para avaliar possíveis mudanças nas taxas de geração de cardiomiócitos e poliploidização em modelos de doenças ou para avaliar a eficiência potencial da terapêutica. Uma vez identificadas alterações na taxa de geração de núcleos de neocardiomiócitos usando este protocolo, estudos subsequentes podem ser usados para verificar se isso se deve a alterações na geração de cardiomiócitos do número de nucleação de cardiomiócitos, conforme descrito anteriormente2,13,17,18. Isso inclui o uso de quantificação histológica, dinâmica de nucleação de cardiomiócitos durante o período de pulso ou análises de cortes de tecido obtidos de animais pulsados por EdU para comparar a incorporação de EdU nas populações de cardiomiócitos mononucleados e multinucleados.

Devido aos baixos níveis de renovação de cardiomiócitos, este protocolo usa várias injeções de EdU durante um período de 7 dias. Isso também permite a "perseguição" de todas as fontes celulares potenciais de geração de cardiomiócitos e permite a quantificação da geração cumulativa de núcleos de cardiomiócitos durante esse período de tempo. Dependendo do estudo, esse período de tempo pode ser ajustado para se adequar aos níveis previstos de geração de cardiomiócitos. Para a quantificação precisa da incorporação de EdU em núcleos de cardiomiócitos, é imperativo que não haja marcação não específica dos núcleos com o anticorpo secundário usado para detectar a reatividade do PCM-1. Portanto, seria prudente realizar experimentos adicionais de titulação de anticorpos secundários para otimizar esse aspecto do protocolo, principalmente se um anticorpo secundário diferente do sugerido neste protocolo for usado. O protocolo aqui descrito usa a expressão de PCM-1 para identificar núcleos de cardiomiócitos. Embora este seja um marcador de cardiomiócitos estabelecido, marcadores alternativos podem ser usados para validar os dados; estes incluem anticorpos específicos para a troponina T cardíaca, que foi identificada como parcialmente localizada nos núcleos1 dos cardiomiócitos. Da mesma forma, proteínas localizadas nucleares alternativas podem ser usadas para identificar e quantificar a incorporação de EdU em populações de núcleos diferentes da dos cardiomiócitos. É importante que todos os núcleos de cardiomiócitos que estão ativamente passando por mitose sejam excluídos da análise, pois o destino dessa síntese de DNA é desconhecido e pode resultar em divisão celular ou aumento da ploidia. O PCM1 é desmontado durante a fase M do ciclo celular, portanto, os cardiomiócitos submetidos à mitose não serão identificados pela expressão de PCM1. Além disso, todos os núcleos na fase s do ciclo celular devem ser excluídos da análise subsequente. Isso pode ser alcançado fechando todos os núcleos com intensidade DAPI acima da população 2N, incluindo aqueles com intensidade DAPI entre as populações 2N e 4N.

Embora seja cada vez mais aceito que o coração tem a capacidade de substituir cardiomiócitos durante o envelhecimento normal e após lesão aguda, a fonte e o grau desse potencial permanecem controversos. Além disso, taxas díspares de renovação de cardiomiócitos foram relatadas1,7,20-22. Isso pode ser em parte devido às dificuldades em identificar e quantificar com precisão a geração de neocardiomiócitos19. Até o momento, a maioria dos estudos se baseou apenas no uso de análise histológica e na identificação de cardiomiócitos por meio da expressão de proteínas citoplasmáticas, incluindo proteínas do sarcômero, para a quantificação do turnover e renovação de cardiomiócitos2,4,23,24. O uso desses métodos para detectar a expressão de marcadores de proliferação ou, como demonstrado aqui, a incorporação de análogos da timidina pode facilmente resultar na identificação incorreta de outros tipos de células cardíacas como cardiomiócitos. Embora o uso de imagens confocais 3D possa ajudar a aliviar esses problemas, esses métodos são caros e demorados. Curiosamente, o protocolo descrito aqui demonstra que a geração de núcleos de neocardiomiócitos ocorre a uma taxa de 0,17% por semana. Isso é consistente com outros estudos baseados em citometria de fluxo que demonstram taxas de rotatividade semanais de até 0,13%5. Embora seja tentador extrapolar as taxas de rotatividade anual com base nesses dados, como em estudos anteriores2,5,25,26, isso é inadequado, pois as taxas de rotatividade são dinâmicas durante a vida de um animal13.

Este método tem uma série de aplicações potenciais, incluindo a avaliação da terapêutica potencial para melhorar a regeneração de cardiomiócitos ou investigar os efeitos de doenças cardíacas na renovação de cardiomiócitos e nas taxas de poliploidização de cardiomiócitos.

Divulgações

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Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

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Este trabalho foi apoiado pela British Heart Foundation, concessão do projeto PG/13/69/30454.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
0,32 M sacaroseSigma84100
10 mM Tris-HCl (pH = 8)SigmaT3253
5 mM CaCl2Sigmac5086
5 mM acetato de magnésiosigmaM-5661
2,0 mM EDTASigmaE5134
0,5 mM EGTASigma63779
1 mM DTTSigmaD0632
70 mM KClSigmaP9541
10 mM MgCl2SigmaM8266
1,5 mM esperminaSigma85590
Isotipo coelho IgG- ChIP Grauabcamabc7415
Coelho anti-PCM-1 anticorpoSigmaHPA023374
Alexa Fluor 488 F(ab')2 Fragmento de Anticorpo Anti-Coelho IgG (H+L) de Cabra FiltrosLife technologies A-11070
  70 μ m e 100 μ m Fisher scientific11597522, 11517532
Glass dounce (40 ml) e pilão grande folgaSigmaD9188-1SET
EdU (5-etinil-2'-desoxiuridina)Life technologiesA10044
Click-iT Plus EdU Alexa Fluor 647 Kit de Ensaio de Citometria de FluxoLife technologiesC10634Este kit inclui  reagentes necessários para seção, tampão de reação EdU,  Fixador EdU, solução de permeabilização à base de saponina e os reagentes necessários para o coquetel de rotulagem EdU.
Kit de 2 passos CyStain DNA,Sysmex Partec05 5005Este kit inclui  reagentes necessários para a marcação DAPI (solução de coloração de DNA)
Homogeneizador de sonda, e.g., TissueRuptorQiagen9001273
Sondas Descartáveis TissueRuptorQiagen990890
ultracentrífugaSorvall 
Facscanto IIBD Biosciences
, Thinwall, Polipropileno. 38,5 ml, 25 x 89 mmBeckman Coulter326823
Albumina de soro bovino SigmaA2153
de células Tubo de Ultracentrífuga

Referências

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