Artigo de método

Preparação de 3D colágeno Géis e microcanais para o estudo das interações 3D In Vivo

DOI:

10.3791/53989

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9 de maio de 2016

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1Department of Cell and Regenerative Biology, University of Wisconsin-Madison, 2Laboratory for Optical and Computational Instrumentation, University of Wisconsin-Madison, 3Department of Biomedical Engineering, University of Wisconsin-Madison, 4Morgridge Institute for Research, University of Wisconsin-Madison, 5Paul P. Carbone Comprehensive Cancer center, University of Wisconsin-Madison

Neste artigo

Resumo

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O colágeno é um componente central da ECM, e fornece pistas essenciais para diversos processos celulares que vão desde a migração para diferenciação e proliferação. Fornecidas aqui é um protocolo para a incorporação de células dentro de hidrogéis de colágeno 3D, e uma técnica mais avançada para a geração de matrizes de colágeno randomizados ou alinhadas utilizando microcanais PDMS.

Resumo

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Historicamente, a maioria dos processos celulares foi estudada em apenas 2 dimensões. Embora esses estudos tenham sido informativos sobre os mecanismos gerais de sinalização celular, eles negligenciam pistas celulares importantes recebidas das propriedades estruturais e mecânicas do microambiente local e da matriz extracelular (MEC). Para entender como as células interagem dentro de uma ECM fisiológica, é importante estudá-las no contexto de ensaios tridimensionais. A migração celular, a diferenciação celular e a proliferação celular são apenas alguns processos que demonstraram ser afetados por mudanças locais nas propriedades mecânicas de um ECM tridimensional. O colágeno I, um componente fibrilar central da MEC, é mais do que um simples elemento estrutural de um tecido. Em condições normais, pistas mecânicas da rede de colágeno direcionam a morfogênese e mantêm as estruturas celulares. Em microambientes doentes, como o microambiente tumoral, a rede de colágeno é frequentemente remodelada dramaticamente, demonstrando composição alterada, deposição aprimorada e organização alterada das fibras. No câncer de mama, o grau de alinhamento das fibras é importante, pois o aumento das fibras alinhadas perpendicularmente ao limite do tumor tem sido correlacionado a um pior prognóstico do paciente1. Matrizes de colágeno alinhadas resultam em maior disseminação de células tumorais por meio de migração persistente2,3. O seguinte é um protocolo simples para incorporar células dentro de um hidrogel de colágeno fibrilar tridimensional. Este protocolo é prontamente adaptável a muitas plataformas e pode gerar matrizes de colágeno alinhadas e aleatórias de forma reprodutível para investigação de migração celular, divisão celular e outros processos celulares em um microambiente fisiológico tridimensional ajustável.

Introdução

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Muitos processos celulares foram extensivamente estudados em 2 dimensões, formando assim um conhecimento coletivo dos mecanismos básicos de sinalização celular. Esses estudos, no entanto, negligenciam pistas celulares importantes recebidas das propriedades estruturais e mecânicas do microambiente celular local e da matriz extracelular (MEC). Para entender melhor como as células interagem dentro de um contexto fisiológico, é importante estudá-las em ensaios tridimensionais (3D). A ECM para esses ensaios 3D pode ser derivada de células ou reconstituída a partir de proteínas purificadas. Independentemente da fonte da MEC, os ensaios de matriz 3D provaram ser inestimáveis para entender como as células navegam e interagem no mundo fisiológico. Por exemplo, células cultivadas em matrizes 3D exibem modos distintos de locomoção que dependem da natureza mecânica de sua ECM circundante, que não são observados em experimentos 2D4-6. Além disso, as células cultivadas em 3D também têm menos fibras de estresse e aderências focais cada vez menos pronunciadas do que suas contrapartes cultivadas em superfícies duras, como vidro ou plástico7.

A importância dos ensaios 3D contextuais não se limita à migração celular, no entanto. Alguns outros eventos de sinalização celular só podem ser investigados por meio do uso de ensaios 3D. Durante a diferenciação tecidual e celular, a rigidez do ambiente extracelular e da MEC fornece sinais que podem influenciar eventos morfogênicos. Por exemplo, a tubulogênese epitelial mamária ocorre apenas em matrizes 3D de baixa rigidez, mas não em matrizes rígidas nem em substratos 2D8,9. Quando cultivadas em matrizes 3D rígidas, essas mesmas células epiteliais assumem um fenótipo aberrante com aumento da proliferação e saliências da membrana celular impulsionadas por sinalização alterada de FAK e ERK10. Sabe-se que muitas outras vias de sinalização e processos celulares são afetados de forma semelhante pela rigidez do ambiente celular local, e essas cascatas de sinalização destacam a importância de investigar eventos de sinalização e fenótipo celular no contexto das propriedades mecânicas locais apropriadas de um ECM 3D.

O colágeno I é uma proteína particularmente relevante para uso em estudos in vitro, pois é o componente mais abundante da MEC e é responsável por muitas das propriedades mecânicas do microambiente celular. Embora tenha sido originalmente pensado apenas como uma proteína estrutural, seu papel agora é conhecido por ser muito mais complexo. A composição, arquitetura, orientação, densidade e rigidez da fibra de colágeno fornecem um ambiente concentrado de informações de sinalização5. Durante a progressão de certas doenças, como inflamação crônica e tumorigênese, a rede de colágeno é dramaticamente remodelada2,11. Mais especificamente nos cânceres de mama, o aumento da deposição de colágeno e a rigidez tecidual acompanham e provavelmente contribuem para a progressão do tumor. Nesses tumores iniciais, a rede de colágeno enrijecida parece tensa e mais alinhada, de modo que a maioria das fibras encapsula o tumor em crescimento2. À medida que o tumor progride, o colágeno continua a se reorganizar e regiões da rede fibrilar tornam-se orientadas perpendicularmente ao limite do tumor2,12. O alinhamento perpendicular serve como um biomarcador prognóstico onde esses pacientes têm uma pior progressão livre da doença e sobrevida global1. Uma explicação para essa correlação é que os resultados ruins são consequência do aumento da disseminação de células tumorais por meio da migração celular persistente em redes de colágeno alinhadas3.

Para entender como as células respondem especificamente ao alinhamento e organização observados na progressão do tumor, é necessário gerar matrizes de colágeno 3D aleatórias e alinhadas para experimentação. Existem três metodologias básicas para induzir o alinhamento dentro das redes fibrilares. A primeira técnica utiliza um dispositivo indutor de tensão onde o colágeno entre dois pontos é contraído ou esticado para gerar alinhamento. As fibras paralelas ao eixo de força são esticadas, enquanto as fibras perpendiculares ao eixo são comprimidas e dobradas. Embora as técnicas induzidas por deformação normalmente ofereçam excelente alinhamento, essa abordagem requer equipamentos volumosos que não são facilmente adaptáveis a muitas plataformas3,13. Alternativamente, a tensão induzida por células pode ser criada colocando tampões localizados de células que subsequentemente contraem e alinham o colágeno13. Este método tem o problema de ser variável, pois muitos parâmetros podem estar sujeitos a alterações. O segundo método utiliza esferas magnéticas e um campo magnético durante a polimerização para induzir o alinhamento do colágeno13,14. Bons resultados podem ser obtidos com esse método com equipamentos pouco sofisticados, mas requer o uso de anticorpos ou algum outro método para magnetizar o polímero. Portanto, pode ser um pouco caro de usar, e a rigidez do gel de colágeno é potencialmente modificada pelo aumento das conexões na rede. Além disso, as esferas magnéticas usadas neste processo são frequentemente autofluorescentes, o que é problemático para experimentos de imagem. Por fim, o alinhamento pode ser gerado por canais microfluídicos PDMS3,15,16. Neste método, o alinhamento do colágeno é obtido fluindo o colágeno polimerizado através de pequenos canais microfluídicos. Esses canais microfluídicos podem ser feitos em uma infinidade de designs e são facilmente adaptáveis a muitas plataformas. Além disso, eles são muito econômicos, pois quantidades muito pequenas de colágeno e outros reagentes são usadas devido aos seus tamanhos diminutos.

Fornecido aqui está um protocolo simples para incorporar células dentro de um hidrogel de colágeno fibrilar tridimensional. Além disso, também é fornecida uma técnica mais avançada, na qual os canais microfluídicos PDMS são usados para controlar a organização e o alinhamento da matriz de colágeno. Este protocolo é facilmente adaptável a muitas plataformas e pode gerar matrizes de colágeno alinhadas e aleatórias de forma reprodutível para investigação da migração celular, divisão celular e outros processos celulares em um microambiente fisiológico tridimensional.

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Protocolo

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1. A neutralização, diluição e Polimerização de colágeno Soluções de Investigação 3D e celulares contração Ensaios

  1. No gelo no exaustor de cultura de tecidos estéreis, neutralizar colagénio (1: 1) com estéril, 100 mM de HEPES arrefecido com gelo em 2X PBS, pH 7,4, num tubo de 15 ml. Misture bem com uma pipeta de plástico até que a solução é homogénea e redemoinhos de mistura não são mais visíveis. Tenha cuidado para não introduzir bolhas de ar durante o processo de mistura. Armazenar brevemente em gelo.
  2. Diluir colagénio neutralizado para a concentração adequada com meio celular (tal como meio RPMI, DMEM, etc).
    1. Para calcular a quantidade de colagénio neutralizado necessária para compensar a concentração de colagénio desejado, utilizar a equação N = (D * V) / (S / 2), em que N é quantidade de colagénio neutralizado necessário, D é a concentração de colagénio desejado, V seja o volume final da concentração de colagénio desejado, e S é tele a partir da concentração de colágeno estoque.
    2. Levar-se a quantidade de colagénio neutralizado para o volume através da adição de uma solução de meio celular de células e. Misture bem e guarde em gelo até estar pronto para lançar.
      1. Exemplo: Para a 2 mg / ml de gel num volume de gel de 1 ml (volume típico para um molde de gel em 6 de placa bem ou 50 milímetros prato de vidro de fundo), em primeiro lugar multiplicar a concentração desejada (2 mg / ml) pelo volume final desejado (1 ml). Tome este número (2 mg) e dividi-lo pela metade da concentração de ações listadas na garrafa (9,49 mg / ml). Neste caso, a 0,42 ml de colagénio neutralizado são diluídas com 0,58 ml de mistura / célula meios.
  3. Pipete o colagénio / célula / mistura meios gelada em qualquer uma cultura não-tecido tratado placa de 6 poços de 50 mm ou prato de vidro de fundo. Use ponta da pipeta para espalhar uniformemente a solução.
    NOTA: É importante a utilização de uma cultura não-tecido placa tratada para minimizar a fixação ou o crescimento das células fora do collagen gel.
  4. Deixa-se polimerizar à temperatura ambiente durante cerca de 10 - 15 min. Os géis deve virar opaco após polimerização.
  5. Depois ele se transformou opaco, mover prato ou prato para 37 ° C durante mais 45 - 60 min para terminar a polimerização.
  6. Após 45 - 60 min, adicionar 2 - 3 ml de meio e solte géis de paredes do poço, executando uma dica p200 pipeta em torno do perímetro de bem ou prato. prato redemoinho delicadamente para soltar o gel. O gel de colágeno deve estar flutuando na mídia.

2. Western Blot, Cell Morfogênese e Gel Gontractility Assay

  1. Para avaliar os níveis de proteína, morfologia ou contratilidade celular em relação ao ECM rigidez, começar por despejando géis de colagénio, de acordo com 1,1-1,6, semeado com células para a 7 - ensaio de 10 dias. Determine cada taxa de semeadura linha celular empiricamente dependendo da taxa de crescimento e de confluência. Para um ensaio de 10 dias, a densidade de sementeira pode variar de 20.000 - 100.000 células / gel.
  2. Medircontractilidade celular, medir o diâmetro gel usando uma régua ou de uma câmara a cada 24 h ou no intervalo de tempo apropriado.
    Nota: Para além disso, as imagens correspondentes recolhidos a partir de um microscópio pode ser analisada para características morfológicas características da linha de células semeadas no gel, tal como estruturas do tipo acini, túbulos epiteliais, saliências celulares, e lameliapodia.
  3. Para avaliar os níveis de proteína, lisar os géis em tampão RIPA, e processo para a análise Western blot de proteínas de interesse, como descrito em Wozniak et al. 17 e Gallagher et ai. 18.
    1. IMPORTANTE: Em comparações de contractilidade entre as linhas celulares, para normalizar a contractilidade do ADN total, o que pode ser extraída a partir dos géis, conforme descrito por Lui, et al, 19, ou para um imutáveis, proteínas (histonas arrumação, GAPDH, etc.) por Ocidental. análise de mancha, tal como descrito em Wozniak et al. 17 e Gallagher et ai. 18. Se a contagem de células dentro do gel usando um hemocitômetro, certifique-se para normalizar o número de células de área total gel como o gel de contratação vai se concentrar células.
  4. géis alimentar a cada 3 - 4 dias, removendo 1 ml de meio e substitui-lo com 1 ml de meio fresco. Certifique-se de alimentar géis após a medição é tida como a adição de nova media / soro vai causar um aumento da contratilidade.

3. Geração de PDMS microcanais para o alinhamento de fibra de colagénio

Nota: Para gerar matrizes de colagénio alinhados, um molde para PDMS microcanais (Figura 2A) requer um mestre de silício SU-8 feita através de litografia suave-15.

  1. Para tornar canais PDMS, misture PDMS completamente em um copo descartável com um palito de sorvete. Para um mestre de silicone 6 polegadas, misturar 20 g de base de elastómero com 2 g de agente de cura.
  2. De gás-se a mistura de PDMS, colocando o copo descartável numa câmara de vácuo sob uma pressão de vácuo de550 milímetros de Hg. De-gás para o 1 - 1,5 h.
  3. Enquanto de-gasificação do PDMS, prepare o mestre de silicone para derramar. Prepare colocando uma folha de filme de transparência sobre uma placa de aquecimento seguido pelo mestre silicone. Certifique-se de que o molde de microcanais voltado para cima.
    NOTA: Durante a fundição PDMS e cura, o mestre de silicone será imprensado entre duas folhas de filme de transparência.
  4. Após 1-1,5 horas, remover os PDMS desgaseificado a partir da câmara de vácuo, e, lentamente, despeje sobre o mestre silicone.
    IMPORTANTE: Evite bolhas de ar. Continuam a despejar no centro de mestre, e permitir que a gravidade espalhe uniformemente.
    NOTA: A queda de PDMS não precisa de estender-se até a borda do mestre.
  5. Depois de PDMS foi vertida para o mestre, aplicar uma segunda folha de película de transparência no topo do mestre de silicone e PDMS. Cuidadosamente, rolar a segunda folha de transparência para baixo na parte superior do mestre PDMS / silicone para evitar bolhas de ar. Não se apresse. PDMS devem ser agora espalhar uniformemente omestre ver.
  6. Com cuidado, colocar uma folha de borracha no topo da transparência, seguido de uma "folha de acrílico 1/8.
  7. Adicionar três 10 lb pesos no topo da folha de acrílico. Inicialmente, os pesos serão "flutuar". Permita-lhes para resolver e estabilizar antes de prosseguir.
  8. Ajuste a temperatura placa de 70 C e cura PDMS durante 4 h. Deixe esfriar por mínimo de 1 hora adicional antes de perturbar.
  9. Retire cuidadosamente folha superior de filme de transparência do wafer, e remover os canais com uma pinça.
  10. Loja no prato livre de poeira até que esteja pronto para uso.

4. PDMS microcanais preparando para Uso

  1. Coloque canais de cabeça para baixo em filme de transparência novo, limpo. Limpe todas as portas (Figura 2b), utilizando movimentos circulares com uma pinça afiada. Remova todos os fragmentos de PDMS.
  2. canais limpo, usando um pedaço de fita adesiva como um pano de aderência. Aplique a fita para a superfície da bancada (lado adesivo para cima), e em seguida, definir o canaln superior. Pressione para baixo em canais com fim rodada de pinça para garantir um bom contacto. Retire e repetir em ambos os lados até que os restos visíveis é removido.
  3. Transferência limpo, preparado canais PDMS em uma cónico de 50 ml com 70% de EtOH. Vortex à velocidade máxima durante 30 segundos. Descarte EtOH e substituir com frescos EtOH 70%. Loja em 70% EtOH até estar pronto para usar.
  4. No tecido capa de cultura e usando técnicas assépticas, transferir os canais de PDMS para uma tampa de vidro limpo e estéril ou pratos com fundo de vidro. Coloque o canal lateral para cima e UV deleite até EtOH tenha evaporado.
  5. Depois de seco, vire as PDMS para que os canais estão virados para baixo em direção a lamela. Pressione o canal de PDMS para baixo no vidro para fazer uma boa vedação. Adicionar um pedaço de PDMS estéreis para cobrir / fechar a porta do Center (porta B, Figura 2b). Deixe secar completamente antes de prosseguir.
  6. Pré-revestimento no interior do canal com 10 ug de colagénio / ml em água esterilizada. Para revestimento, colocar uma gota 100 uL no topo de um eláel, e desenhar através de vácuo. Após 1 h a 37 ° C, encheram-se com os canais de transferência de solução de revestimento de colagénio a um frigorífico. Frio durante cerca de 15 - 30 min.
  7. Remover solução de revestimento de colágeno com aspirador ou pipeta, e começar a preparação de colágeno.

5. Preparação de colágeno para uso em microcanais

  1. Em gelo, neutralizar o colagénio (1: 1) com mM de HEPES arrefecido com gelo 100 em 2X PBS, pH 7,4. Misture bem até ficar homogénea (Para mais detalhes, consulte a secção 1.1).
  2. Diluir colágeno neutralizado com as concentrações adequadas com a mídia celular (Para mais detalhes, consulte a secção 1.2). Incubar durante 15 min em gelo.
  3. Ao mesmo tempo, frio canais em gelo montado.
    NOTA: O objetivo é ter todos os componentes para o processo de canal a 4 ° C ou abaixo. O colagénio temperatura e tempo de nucleação são parâmetros importantes para o processo de polimerização, e pode ser o ponto de partida para a optimização adicional, se necessário.
  4. CounAs células T com um hemacitómetro e ressuspender na densidade de sementeira adequado neste momento. Para facilidade de cálculo, ressuspender, 1 - 3 milhões de células / ml. (Para mais detalhes, veja também a secção 2.1).
  5. Uma vez que as células foram contadas e 15 min passaram, proceda ao colágeno vazamento.

6. Verter alinhados e aleatória de colágeno microcanais

  1. Antes de desenhar colágeno através de canais, ajustar e definir a pressão de vácuo com um regulador de vácuo em linha. A pressão de vácuo fornece a força para induzir e controlar a taxa de fluxo de colagénio, que determina o grau de alinhamento.
    1. Para matrizes aleatórias ou não alinhadas, usar um canal de largura (3 mm de largura x 200 um de altura) com uma pressão de vácuo de 10 mm Hg ou menos.
    2. Para matrizes alinhadas, utilizar o canal estreito (1 mm de largura x 200 um de altura) com uma pressão de vácuo de 60 mm Hg ou superior.
  2. Remover canal montado a partir de gelo e coloque em superfície limpa e higienizada de fluxo laminar hood.
  3. Trabalhe rapidamente e carregar 120 - 150 l de colágeno neutralizado na porta A (Figura 2b).
  4. Desenhar colagénio através do canal, colocando uma pipeta de 25 ml ligado à linha de vácuo através da porta c (Figura 2b). Desenhe colágeno através de um único movimento, uniforme. IMPORTANTE: Para matrizes aleatórias ou não alinhados, desenhar colágeno lentamente através do canal (cerca de 0,5-1 mm por segundo), e parar uma vez que atinge o fim. Para matrizes alinhados, desenhe o colágeno em mais rapidamente, mas tome cuidado para evitar bolhas de ar.
  5. Retirar cuidadosamente o excesso de colágeno da região do porto com Pipetman p200 ou aspirador.
  6. Coloque PDMS manchas estéreis sobre ambos os portos A e C. Todas as portas devem agora ser cobertas.
  7. Após 2 - 3 minutos, retire o centro remendo PDMS (porta B) e adicione 2 - 3 mL de células (5 - 10 mil células) na porta de centro. Permitir que a polimerizar parcialmente (girar opaco) à temperatura ambiente durante mais 10 - 15 min.
  8. após 10- 15 min, a transferência para 37 ° C durante mais 15 - 30 minutos para terminar a polimerização. Remover as tampas de PDMS e adicionar mídia para cobrir completamente as células de canal e de cultura, conforme necessário. As células podem ser alimentados através da remoção de um ml da velha mídia, e substituí-lo com um ml de novas mídias.

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Resultados

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Embora ensaios 3D pode ser feito no interior da mesma rigidez do gel de colagénio, variando a rigidez de gel pode ser utilizado para determinar como as células respondem a alterações mecânicas no seu microambiente celular. Um hidrogel colagénio duro é definido como um gel em que as células são incapazes de embutidos localmente contrair o colagénio circundante. A contractilidade intrínseca de diferentes tipos de células é único, e portanto, é melhor começar com uma curva de contractilidad...

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Discussão

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géis de colágeno 3D são uma adição valiosa para a nossa caixa de ferramentas para compreender como as células interpretam e respondem ao seu microambiente local. Este manuscrito proporcionou um protocolo muito básico para a incorporação de células dentro de uma matriz de colagénio 3D, e reprodutível para gerar matrizes de fibras de colagénio aleatórios ou alinhadas. Ambos os protocolos funcionar como plataformas adaptáveis ​​em que diferentes isoformas de colagénio, agentes de ligação cruzada, ou de outras proteínas de ...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para revelar

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores gostariam de reconhecer os números de concessão UO1CA143069, R01CA142833, R01CA114462, RO1CA179556, T32-AG000213-24 e T32-GM008692-18 pelo financiamento deste trabalho. Também reconhecemos Jeremy Bredfelt e Yuming Liu de loci para o desenvolvimento e assistência com a análise CT-fogo.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
elastômero
cauda de rato de alta concentração
FisherBP366Para tampão de neutralização HEPES
KH2< / sub>PO4< / sub>FisherBP362Para tampão de neutralização HEPES
Na2< / sub>HPO4< / sub>FisherS374Para tampão de neutralização HEPES
NaClFisherBP358Para tampão de neutralização HEPES
Levy Hemacitômetro Neubauer MelhoradoFisher15170-208de células
poços não placa de cultura de tecidos Corning351146
prato de fundo de vidro de 50 mmMatTekP50g-1.5-30-f
Bel-Art Dessecador a vácuo de plásticoBel-ArtCâmaradesgaseificação para
filme de transparência PDMS 3Mpp2950Filme plástico para despejar canais pdms
ThermoScientific CimaRecThermoScientific HP141925Placa quente para cura de microcanais PDMS
Regulador de vácuoPrecision MedicalPM3100Regulador de vácuo para microcanais de colágeno
8" x 8" folha de borrachaAmazon - Rubber-CalSilicone - Folha de borracha 60Apara vazamento de microcanais PDMS
8" x 8" x 0,125" folha de acrílicoAmazonFolhas de plexiglasspara vazamento de microcanais PDMS
Pesos de 10 lbAmazonCAP Barbellpara despejar microcanais PDMS
Tubos cônicos de 15 mlFisher352097
Tubos cônicos de 50 mlPipetasde plástico Fisher 352098
Dot Scientific229202B, 229206B e 667225B2  ml, 5  ml e 25  ml
70% EtOHFisherNC9663244
Kit de Corning 354249 SylGard184 de colágeno de Elastômero NC9285739 Corning para canais PDMS HEPES Fisher BP310 Para tampão de neutralização HEPES KCl  contagem 6 de

Referências

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