Abstract
Under udviklingen af nye vasoaktive midler, arteriel måling af blodtryk er afgørende for at evaluere effekten af de nye foreslåede lægemidler. Faktisk forskning med fokus på opdagelsen af nye potentielle terapeutiske mål ved anvendelse af genetisk ændret mus kræver en pålidelig, langsigtet vurdering af det systemiske arterietryk variation. I øjeblikket den gyldne standard for at opnå langsigtede målinger af blodtryk hos ambulante mus bruger implanterbare radioaktive sendere, som kræver arterie kanyle. Denne teknik eliminerer behovet for tethering, fastholdende, eller bedøve dyrene, der indfører stress og artefakter under prøvetagningen data. arterielt overvågning blodtryk hos mus via kateterisation, kan dog være temmelig udfordrende på grund af den lille størrelse af arterierne. Her præsenterer vi en trin-for-trin guide til at illustrere de afgørende vigtige passager for en vellykket subkutan implantation af radioaktive sendere og halspulsåren cannulation i mus. Vi inkluderer også eksempler på langsigtede blodtryk aktivitet taget i frit bevægelige mus efter en periode med post-kirurgi opsving. Efter denne procedure vil give pålidelige direkte blodtryk optagelser fra flere dyr samtidig.
Introduction
Hypertension er en af de vigtigste risikofaktorer for hjerte-kar-sygdomme, velsagtens det er et stort problem for folkesundheden i både udviklede lande og udviklingslande 1. Adskillige dyremodeller for eksperimentel hypertension er blevet udviklet til at efterligne hypertensive reaktioner som dem observeret hos mennesker 2. Blandt andet den ambulante musen repræsenterer en fremragende model til at studere tilblivelsen og udviklingen af hypertension tillader in vivo analyse af følgerne af kronisk eksponering for hypertension.
Blodtryk (BP) overvågning i mus har hjulpet forskere til at opklare flere mekanismer involveret i fysiologi og patofysiologi af sygdomme som forhøjet blodtryk og hjertesvigt 3, 4. Faktisk manipulation af musegenomet tillod frembringelsen af transgene eller gen-målrettede modeller egnet til at studere hypertension 5, 6. Men selv blid manipulationaf bevidst mus inducerer excitements der potentielt kan indføre artefakter under dataopsamling, mens brug af sedation eller beroligende dybt påvirke blodtrykket 7. Disse aspekter er særligt vigtige og skal tages i betragtning, når de forsøger langsigtet BP overvågning.
Der er flere måder at registrere BP i mus, og en sammenligning mellem de mest almindelige teknikker øjeblikket er til rådighed har været diskuteret andetsteds 8, 9. AHA anbefalinger af BP måling konkluderede dog, at intra-arteriel måling af BP generelt foretrækkes på grund af deres evne til direkte at måle BP over en længere tidsperiode 10. Radio-telemetri kombineret med direkte måling af arterielt tryk er state-of-the-art metode til overvågning fysiologiske funktioner i vågen og frit bevægelige forsøgsdyr samtidig minimere stress og miljømæssigt tilknyttede artefakter 9, 11.Radio-telemetri giver mulighed for at automatisk indsamle blodtryk, puls, kropstemperatur og dyr aktivitet fra flere bevidste dyr.
Selv om denne metode er ved at blive meget populære i mange laboratorier, kan radio-telemetri implantation i mus være teknisk udfordrende. Her viser vi en trin-for-trin-protokol, der illustrerer, hvordan at implantere en tryktransducer i mus. Teknikken involverer subkutan indføring af sonden i musen organ, kanalisere kateteret til halsen og fremad nær aortabuen via venstre carotidarterie. Fjernt optagne data vises live på computerskærmen. Data gemmes også for "off-line" -analyse.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Etik erklæring: Alle dyreforsøg nævnt i denne video-artikel er revideret og godkendt af Animal Care og brug Udvalg (IACUC) ved University of Tennessee Health Science Center.
Bemærk: Brug sterile mikrokirurgi instrumenter i hele den kirurgiske procedure. Kirurgiske instrumenter kan steriliseres under anvendelse af en infrarød sterilisator ved en optimal steriliserende temperatur på 1.500 ° F (815,6 ° C). Afstandsmålere kan genbruges imidlertid før det sættes i dyret sørge for at sterilisere hele senderen ifølge producentens instruktioner, og at spidsen af kateteret er blevet genopfyldt med en speciel gel tilvejebragt af producenten.
1. forsøgsdyr
- Få en IACUC godkendelse til alle eksperimenter, der vil blive udført. Høring institutionel IACUC anbefales med hensyn til krav til postoperativ smertestillende brug efter denne procedure.
- Hold dyrene iclimate-kontrollerede værelser med en omgivende temperatur på 21 ° C, 60% relativ fugtighed og en 12-timers lys-mørke-cyklus med fri adgang til foder og vand.
Bemærk: Da musen kroppen har til at rumme telemetri probe (tilnærmelsesvis 1 cm i diameter x 2 cm lang), foretrækkes det at anvende mus, der vejer 20 g eller mere.
2. Anæstesi og operative Forberedelse
- Afvejes musen ved hjælp af en præcision skala og registrere sin vægt. Sørg for at håndtere dyret forsigtigt og roligt.
- Sende dyret ind i induktion kammer og lukke den. Indstil ilt strømningshastighed på 0,5 l / min og sat isofluran koncentration 4 - 5%.
- Når musen mister bevidstheden, placere den på et organ opvarmning plade holdes på 36-37 ° C. Opretholde anæstesi via næsekegle med isofluran sæt på 2% (holde flow på 0,5 l / min).
- Forbered drifts- regioner ved at fjerne hår fra nakken og than ventrale aspekt af halsen ved at anvende hårfjerning creme.
- Behandl incisionssted med 3 anvendelser af kirurgisk krat (betadinopløsning) skiftevis med 70% isopropylalkohol.
3. Kirurgi
- Placer musen i rygleje. Check for reflekser ved at klemme foden, og juster anæstesi, indtil der ikke er noget svar. Gøres næsten 1-cm midtlinieincision under halsen af musen med en skalpel. I venstre side af snittet skabe et subkutane rum ved omhyggeligt at adskille huden fra det underliggende bindevæv.
- Flip musen, og brug en skalpel til at lave en incision i huden på ca. 1,5 cm i den dorsale venstre side bag skulderbladet. Lav en subkutan lomme langs dyrets flanke stor nok til at rumme enheden. Sæt senderen ind i lommen.
- Indsæt en lille hæmostat klemme i ryggen incision og manøvrere den subkutant mod forrestehalsåbning. Brug af det indsatte-hæmostat clamp Klem forsigtigt et ugiftigt polyethylen rør (4 cm længde x 1 mm ID).
- Træk arterieklemmen tilbage gennem tunnelen ud den laterale snit i ryggen, indtil slangen stikker ud fra både abdominal og ryg indsnit, slipper røret fra arterieklemmen. Fra bagsiden, indsætte kateteret sensoren ind i røret til tunnelen spidsen af trykfølende kateteret gennem halsen. Fra nakken anterior, træk og fjern polyethylen rør og lukke dorsale snit ved hjælp metalclips.
- Adskil forsigtigt mandiblens kirtler hjælp steril bomuld tip applikatorer og trække venstre mandibular kirtel ved hjælp af en elastisk ophold krog. Brug spids buede pincet, find halspulsåren langs venstre side af luftrøret. Hold operationsstedet sterile ved at placere og fastgøre et sterilt afdækningsstykke.
- isolere forsigtigt fartøj fra det omgivende væv og forsigtigt adskillevagus nerve (hvidlig farve), som er langs halspulsåren væk fra arterien. Pas på ikke at skære eller beskadige nerve eller arterien.
- Pass tre stykker af ikke-absorberbar sutur 7-0 nedenunder den isolerede carotisarterie sektion. Bind kraniel sutur at aflukke blodstrømmen. Træk suturen der er tættest på brystbenet til midlertidigt okkludere blodstrøm fra aorta.
- Foretag en løs knude hjælp den midterste sutur. Den bruges til at fastgøre katetret i karret. Skær et lille snit ind i arterien mellem kranie og brystbenet suturer bruger mikro-saks.
- Grab kateteret med specielle fartøj kanylering pincet, og pas på ikke at presse kateteret for at forhindre gel tab fra sonden. Forsigtigt, grab arterien med en fin spids buede pincet pincet, hente kateteret, og sæt det i beholderen gennem det lille snit.
- Spænd midterste sutur knude omkring arterien og forsigtigt videre kattenheter. frigive forsigtigt suturen, der er proximal til brystbenet og fortsætte med at fremføre kateteret mod tværgående aorta.
- Observere det mærke på kateter, der giver et omtrentligt indeks for, hvor langt kateteret skal indsættes. Når det punkt er nået, strammes forsigtigt både den nedre og den øvre sutur omkring kateteret. Kateteret er fastgjort til halspulsåren ved sutur knob.
- Luk hudincision med ikke-absorberbar sutur 5-0. Når lukket, forsegle incisionen med vævet klæbemiddel.
4. Kirurgisk Recovery og BP Målinger
- Overvåg dyr nøje for tilbagelevering af normale arbejdsstillinger og adfærd. I løbet af 24 timer efter kirurgi periode administrere analgesi som anvist af et personale dyrlæge.
- Når dyrene har genvundet (5 - 7 dage efter kirurgi), huse dem individuelt i en almindelig mus bur placeret på toppen af den telemetri-modtageren plade.
- Drej implanterede transmitters "på" og "off" ved hjælp af en magnetisk indretning kortvarigt placeret tæt ved dyret fra kanten af buret.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
Data kan erhverves eksternt ved en modtager; spor er visualiseret på en computerskærm for kvalitetskontrol (figur 1a). Detaljer som animalsk ID, diastolisk blodtryk og det systoliske blodtryk er også vist (figur 1b). Arteriel BP kan optages kontinuerligt (24/7), eller for korte programmerede intervaller (dvs. 60 sek erhvervelse hver time). Data kan automatisk opbevares i en harddisk til senere analyse. Gennemsnit BP data fra en 3-dages kontinuerlig registrering er vist (figur 2), er det muligt at sætte pris døgnrytmen variation mellem mørke og lys cyklus. Gennemsnit af trykvariation og hjertefrekvens blev beregnet og afbildet mod tiden.
Figur 1. Typiske blodtryk tracings af 4 forskellige mus implanteret med Telemetrisk Device. (A) kurver viser realtid arterielt blod trykændringer (mmHg) over en 5 min interval. Data er erhvervet samtidig fra fire forskellige voksne mus 5 dage efter implantation. (B) Sporing ved højere tidsmæssig opløsning udvundet fra A, er det muligt at sætte pris på blodtrykket diastoliske og systoliske værdier, BP cyklus varighed, og puls. Klik her for at se en større version af dette tal.
Figur 2. Langsigtet arterieblodtryk Viser døgnrytme variation. Gennemsnitlige trykdata illustrerer værdierne for (A) systolisk tryk (SP), (B) diastolisk tryk (DP), (C) gennemsnitligt arterielt tryk (MAP), og (D) hjerte rate udtrykt i slag / min. Data blev udvundet fra kontinuerlige optagelser taget i løbet af dagen (lys cyklus, L) eller nat (mørke cyklus, D). Optagelse begyndte 7 dage efter kirurgi. Alle data er udtrykt som middelværdi ± SEM (n = 4 mus). Klik her for at se en større version af dette tal.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Implanterbar radio-telemetri er forbedret betydeligt i de sidste ti år; mindre sonde størrelse gør implantatet mindre traumatisk for dyret, forlænget batterilevetid er med til at reducere omkostningerne, og uafhængige Telemeter frekvenser eliminere krydstale mellem modtagere. Telemetri betragtes som den state-of-the-art-metoden til indsamling af en bred vifte af fysiologiske parametre i frit bevægelige dyr uden artefakter forbundet med brugen af tilbageholdenhed, menneskelig interaktion, eller bedøvelse, der kræves af andre teknikker 8,9.
Imidlertid har nogle af ulemperne ved hans teknik er forbundet med de oprindelige omkostninger til instrumentet og software. Senderne er skrøbelige og modtagelige for skader, og batteriet til sidst ikke løber tør for strøm og skal udskiftes. Selv om virksomheden tilbyder at renovere de beskadigede sonder til en lavere pris, kan omkostningerne være stadig uoverkommelige for nogle laboratorier.Endvidere kan denne procedure være teknisk udfordrende og praksis er nødvendig for at opnå pålidelige BP måling. Endelig er der nogle post-kirurgi associeret dødelighed, som i vore hænder er omkring 5%. Dette kan dramatisk øge hvis en bestemt behandling skal testes, eller hvis en genetisk manipulation kompromitterer musen sundhed.
Følgende kritiske faktorer er afgørende for en vellykket gennemførelse af proceduren: opretholde vævshydrering med sterilt saltvand under hele proceduren. Altid håndtere transmitteren med stor omhu; undgå at holde det ved trykføleren da dette kan medføre gelen til at sive ud eller beskadige senderen. Når du indsætter kateteret, binde den centrale sutur med en dobbelt knude, som modsat fald vil resultere i kateteret forlader fartøjet. Den nødvendige længde af kateteret, der skal indsættes i carotis kan ændres afhængig af musestamme og vægt anvendes på denne particular undersøgelse. Derfor er det stærkt anbefales at køre nogle indledende eksperiment for at bestemme, hvor dybt kateteret skal indsættes for at undgå okklusion af aorta. Endelig overvåge dyret dagligt og sørg for, at huden over senderen ikke strækkes eller nekrotisk. Hvis der opstår udvidet nekrose eller infektion, aflive dyrene efter institutionel politik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Small animal anesthesia system | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | low-flow small animal anesthesia system | |
| Pad warmer and mouse termometer | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | allows monitoring body temperature, and homeothermic control in small animals | |
| Binocular Microscope | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | KSCXTS-1121 | binocular body with boom stand pole and top LED |
| Hemostat Forceps | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750451 | used to clamp blood vessels or tag sutures |
| Small metal Clips, 7 mm, Stainless Steel | Kent Scientific Corp, Torrington, Connecticut, USA | INS750344 | used for skin closure |
| Betadine solution | Purdue Products L.P., Stamford, CT, USA | NDC-67618-150-01 | 10% povidone iodine topical solution |
| Normal saline solution | Abott Laboratories | 04930-04-10 | needed for preventing tissue from drying. |
| Nair (Hair remover lotion) | needed for fur removal from the site of incision/surgery | ||
| Braide silk suture | Teleflex Medical OEM, Coventry, Connecticut, USA | Size 5.0, 6.0, 7.0 | |
| Ethanol | 2716 | 70% ethanol for disinfection | |
| Spring scissors | Fine Science Tool | 15000-10 | for minor dissection |
| Scissors (angled to side) | Fine Science Tool | 14063-011 | No. 3 handle |
| Scalpel blade | 2976-0 | No. 10 | |
| Forceps (curved) | Fine Science Tool | 11150-10 | for holding tissue |
| Forceps (straight) | Fine Science Tool | 11151-10 | for holding tissue |
| Needle holder | Fine Science Tool | 12002-12 | for suturing |
| Fine needle nose Forceps | Fine Science Tool | ||
| Isoflurane | Henry Schein Animal Health, Melville, New York, USA | a general inhalation anesthetic agent | |
| Sterilizer | Benchmark Scientific, 116 Corporate Blvd, South Plainfield, NJ, USA | B1000 | sterilize surgical tools in 5-10 seconds using infrared heating |
| Gauze Pads | Johnson & Johnson, New Brunswick, NJ, USA | JJ8513 | to use for wound cleaning, prepping, scrubbing or dressing |
| Telemetry Device | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | DSI-PA-C10 | to record blood pressure in freely moving mice |
| Telemetry receiver system coumpled with a PC | Data Sciences International, St. Paul, MN, USA | ||
| Tubing | Instech Laboratories, Plymouth Meeting, PA USA | BTPE-90 | |
| Vessel Cannulation Forceps, 13 cm, 0.5 mm OD | World Precision Instruments | 503374 | special vessel cannulation forceps |
| Tissue adhesive | 3M Animal Care Products, St. Paul, MN, USA | NAC No.: 11380041 | use to close minor wounds, often eliminating the need for sutures and/or bandages |
| Weighing scale | BB300 | precision analytical laboratory balance |
References
- Danaei, G., et al. The preventable causes of death in the United States: comparative risk assessment of dietary, lifestyle, and metabolic risk factors. PLoS Med. 6 (4), e1000058 (2009).
- Dornas, W. C., Silva, M. E. Animal models for the study of arterial hypertension. J Biosci. 36 (4), 731-737 (2011).
- Henze, M., et al. Persistent alterations in heart rate variability, baroreflex sensitivity, and anxiety-like behaviors during development of heart failure in the rat. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 295 (1), H29-H38 (2008).
- Hoffmann, D. S., et al. Chronic tempol prevents hypertension, proteinuria, and poor feto-placental outcomes in BPH/5 mouse model of preeclampsia. Hypertension. 51 (4), 1058-1065 (2008).
- Lerman, L. O., Chade, A. R., Sica, V., Napoli, C. Animal models of hypertension: an overview. J Lab Clin Med. 146 (3), 160-173 (2005).
- Johns, C., Gavras, I., Handy, D. E., Salomao, A., Gavras, H.
- Vatner, S. F., Braunwald, E. Cardiovascular control mechanisms in the conscious state. N Engl J Med. 293 (19), 970-976 (1975).
- Zhao, X., et al.
- Whitesall, S. E., Hoff, J. B., Vollmer, A. P., D'Alecy, L. G. Comparison of simultaneous measurement of mouse systolic arterial blood pressure by radiotelemetry and tail-cuff methods. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 286 (6), H2408-H2415 (2004).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in humans and experimental animals. Part 2: Blood pressure measurement in experimental animals: a statement for professionals from the subcommittee of professional and public education of the American Heart Association council on high blood pressure research. Hypertension. 45 (2), 299-310 (2005).
- Kurtz, T. W., et al. Recommendations for blood pressure measurement in animals: summary of an AHA scientific statement from the Council on High Blood Pressure Research, Professional and Public Education Subcommittee. Arterioscler Thromb Vasc Biol. 25 (3), 478-479 (2005).
