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Artigo de método

As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos

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DOI:

10.3791/53995

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20 de setembro de 2016

 ,  ,  , 
1Department of Biological Sciences, University of Quebec in Montreal, 2Department of Pharmacology and Therapeutics, McGill University, 3Department of Clinical Sciences, University of Montreal

Neste artigo

Resumo

Este protocolo descreve um método para eficazmente transfectar siARN em citotrofoblastos vilosidades humanos isolados de fresco utilizando formação de microporos e identificação de complexos de ADN-proteína nestas células. As células transfectadas pode ser monitorado por análises Western blot e EMSA durante o tempo de cultura de 4 dias.

Resumo

Os citotrofoblastos vilosos primários humanos são uma fonte muito útil de células primárias para estudar as funções placentárias e os mecanismos regulatórios e para compreender doenças relacionadas à gravidez. Neste protocolo, citotrofoblastos vilosos primários humanos recém-isolados de placentas por meio de um protocolo padrão de DNase / tripsina são microporados com pequeno RNA interferente (siRNA). Essa abordagem proporcionou maior eficiência para a transfecção de siRNA quando comparada a um método baseado em lipofecção. As células transfectadas podem ser posteriormente analisadas por Western blot padrão dentro de um período de 3-4 dias após a transfecção. Além disso, usando citotrofoblastos vilosos primários cultivados, a análise do Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética (EMSA) foi otimizada e realizada em extratos dos dias 1 a 4. O uso dessas células primárias cultivadas e o protocolo descrito permitem uma avaliação da implicação de genes específicos e fatores de transcrição no processo de diferenciação do citotrofoblasto viloso em uma camada celular semelhante ao sinciciotrofoblasto. No entanto, o período de tempo limitado permitido na cultura impede o uso de métodos que requerem mais tempo, como a geração de uma população de células estável. Portanto, o teste dessa população de células requer protocolos de transferência de genes altamente otimizados.

Introdução

A disfunção placentária humana está associada ao desenvolvimento de várias doenças associadas à gravidez, como pré-eclâmpsia e restrição de crescimento intrauterino 1. Um importante constituinte celular da placenta são os trofoblastos, que podem ser classificados como citotrofoblastos extravilosos ou vilosos. Após a fusão, os citotrofoblastos vilosos se diferenciam ainda mais na camada sinciciotrofoblástica, uma estrutura celular multinuclear com um papel importante na troca feto-materna e na produção de hormônios 2. Os citotrofoblastos vilosos primários humanos e suas contrapartes diferenciadas representam importantes amostras biológicas e permitem que os pesquisadores estudem vários processos relacionados à placenta, como a fusão celular, em cultura. Além disso, esforços substanciais estão em andamento para identificar marcadores que facilitem o manejo adequado e melhorem as terapias preventivas específicas para doenças relacionadas à gravidez. Os laboratórios isolam rotineiramente citotrofoblastos vilosos humanos primários de placentas frescas, usando um procedimento de isolamento padrão baseado na digestão por tripsina das vilosidades placentárias 3. À medida que os citotrofoblastos cultivados perdem sua capacidade de proliferar e se diferenciar rapidamente em uma camada semelhante a sinciciotrofoblastos após a cultura 4, são necessários métodos de transfecção muito eficientes e abordagens de análise otimizadas. Estudos anteriores determinaram condições ótimas de transfecção desses citotrofoblastos primários 5. Aqui, é apresentado um método diferente de transfecção de siRNA, que foi previamente testado neste tipo de célula 6. Em comparação com uma abordagem baseada em lipofecção, este método de microporação melhora a transfecção, conforme avaliado pela extensão do silenciamento de genes específicos.

Estudos de promotor e expressão gênica também fornecem uma melhor compreensão da função placentária. Embora mais difícil de usar devido ao curto período de tempo para o qual os citotrofoblastos vilosos primários podem ser cultivados, as análises de promotores usando protocolos padrão podem ser abordadas, conforme publicado anteriormente 7. O Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética (EMSA) é um desses métodos in vitro comumente usados, permitindo o monitoramento rápido e fácil das interações DNA-proteína. Extratos nucleares desses trofoblastos primários foram usados para testar uma região do promotor da Sincitina-2 para interações específicas. Os resultados revelaram que os fatores de ligação podem ser detectados em diferentes momentos da cultura e de maneira específica e reprodutível.

Os dados apresentados neste protocolo confirmam que nossa abordagem de transfecção e o protocolo EMSA podem ser usados para citotrofoblastos vilosos primários isolados e serão de grande utilidade para estudar as diversas funções dos citotrofoblastos vilosos em condições normais ou patológicas.

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Protocolo

O comitê de ética UQAM aprovou estes protocolos, que estão em conformidade com as orientações do comitê de ética de St-Luc Hospital do Centre Hospitalier Universitaire de Montreal (Montreal, Canadá). Os participantes assinaram um termo de consentimento informado.

1. Médio Preparação e Isolamento de primárias das vilosidades citotrofoblastos

  1. Prepare meio de cultura para citotrofoblastos vilosidades primárias humanas, completando meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), com HEPES 25 mM, 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar o meio preparado por meio estéril filtro de 0,22 um e armazenar em um congelador a -20 ° C em alíquotas de 50 ml.
  2. Isolar citotrofoblastos vilosidades primárias de placentas frescos seguintes protocolos padrão 3.
    1. Utilizando um alicate, retire a membrana fetal a partir do tecido delicadamente riscar-lo, tomando cuidado para não remover o tecido das vilosidades. Corte oremanescente vilosidades da placenta em cubos de cerca de 3 x 3 cm usando bisturi e tesoura. Lavar exaustivamente com água contendo NaCl 0,9% para remover o sangue materno.
      1. Segurando cada cubo com um alicate, remova cuidadosamente o tecido das vilosidades dos vasos remanescentes e tecidos fibrosos usando uma tesoura.
      2. Para 15 a 30 mg de tecido das vilosidades, digerir quatro vezes em solução salina equilibrada de Hank (HBSS) contendo tripsina (de 9,6 x 10 5-1,8 x 10 6 L; concentração final 1.2 mg / ml) e desoxirribonuclease I (ADNase I) ( concentração final de 200 ug / ml) durante 30 min a 37 ° C num banho de água com agitação contínua.
        Nota: Use 150 ml de volume total para a primeira digestão, 100 ml para a segunda digestão e 75 ml para as duas digestões remanescentes.
    2. Recolhe-se o sobrenadante contendo as células dispersas e centrifugar a 1250 xg durante 15 min sem travão. Remover o sobrenadante e ressuspender as células em 1 ml de DMEM contendo pré-aquecido1% de penicilina / estreptomicina.
    3. A camada de células dispersas no topo de uma descontínua 5% - 70% gradiente de silica revestida com polivinilpirrolidona (ver Tabela 1 para a preparação de gradiente) e centrifuga-se durante 23 min a 507 x g sem travão. Remover a camada de densidade entre 1,017-1,033 por aspiração e recolher as camadas entre 40% e 50% do gradiente com uma pipeta nova. Lave as células exaustivamente com 10 ml de DMEM pré-aquecido contendo 1% de penicilina / estreptomicina.
      Nota: A fracção recolhida corresponde a densidades entre 1.048 e 1.062, que abriga trofoblastos.
    4. Contar as células usando um hemocitômetro. Resumidamente, células de misturar e adicionar 10 ul num tubo de microcentrífuga novo. Adicionar 10 ml de azul de tripano e misture delicadamente novamente. Elaborar a suspensão de células e preencher as câmaras hemocitômetro. Contar as células sob objetiva de 10X.
    5. Coloque 1 x 10 6 e 4,5 x 10 6 células em tubos separados para uso em seções 1.3 e 2, respectivaly. Semear as restantes células a uma densidade de 1,5 X 10 6 células / poço em meio de cultura DMEM suplementado e a 37 ° C e 5% de CO 2 durante um máximo de 4 dias para outras experiências.
  3. Avaliação da pureza do isolado citotrofoblastos vilosidades primárias
    1. Spin 1 x 10 6 dos citotrofoblastos recentemente isoladas em microtubos a 300 x g. Descartar o sobrenadante e adicionar 1 ml de solução salina tamponada com fosfato de pré-aquecida (PBS). células centrifugar a 300 xg e remover PBS por aspiração.
    2. Adicionar 1 ml de metanol frio para as células e incuba-se à temperatura de -20 ° C durante 20 min. células centrifugar a 300 xg durante 5 min e remover o metanol por aspiração.
      Cuidado: Use máscara canister, óculos de segurança e luvas de borracha ao manusear metanol.
    3. Adicionar 1 ml de PBS à temperatura ambiente para re-hidratar as células, centrifugação a 300 xg e remover por aspiração PBS.
    4. Incubar as células em PBS contendo FBS (01:50 [v / v] de diluição) e um FcRreagente de bloqueio (01:10) durante 45 min à temperatura ambiente para eliminar a ligação não específica.
    5. Lavar duas vezes com 500 ul de PBS temperatura ambiente, centrifugar células a 300 xg durante 5 min e remover por aspiração PBS. Ressuspender as células em 100 ul temperatura ambiente PBS.
    6. Incubar as células com um isotiocianato de monoclonal de rato fluoresceína (FITC) -conjugated LP5K anti-humana de clone de anticorpo citoqueratina-7 (1: 200) ou um controlo de isotipo-emparelhado não específica de anticorpos em PBS contendo 0,2% de BSA durante 45 min à temperatura ambiente em o escuro. Lave as células em PBS.
    7. Analisar as células por citometria de fluxo 3. Use preparações de células, que demonstram um mínimo de células CK-7-positivos a 96% em citometria de fluxo para outras experiências.

2. siRNA transfecção de primárias Humanos das vilosidades citotrofoblastos

  1. A transfecção de citotrofoblastos vilosidades primárias humanas utilizando um dispositivo de formação de microporos
    1. Prepare placas de 6 poços contendo2 ml de meio DMEM suplementado para a incubação de células microporated.
    2. Após o isolamento de citotrofoblastos primários (ver secção 1.2), tomar uma alíquota de células em suspensão e determinar o número de células usando um hemocitômetro.
    3. Transferir 1,5 x 10 6 células para um tubo de microcentrífuga e as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente. Lavam-se as células com 1 ml de PBS de Dulbecco (DPBS) (Mg 2+, Ca 2 + livre) e peletizar as células por centrifugação a 300 xg durante 5 min à temperatura ambiente.
    4. Remover o sobrenadante e ressuspender as células suavemente em 100 ul de tampão de ressuspensão.
      Nota: Evitar mantendo suspensão de células durante mais de 15-30 min à temperatura ambiente, para maximizar a viabilidade das células e a eficiência de transfecção.
    5. Adicionar 300 ng de Syncytin-2 siRNA (ou mexidos-ARNsi de controlo) para o tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e aspirar a mistura de células-siRNA transfecção utilizando uma pipeta de 100 uL. Inserira pipeta na estação (veja Lista de Materiais) e submeter as células a um 1.300 V pulso único de 30 ms.
    6. Imediatamente transferir as células para placas de 6 poços (preparado no passo 2.1.1) contendo meio suplementado 37 ° C pré-aquecido para evitar danos nas células.
    7. Repita os passos 2.1.5 e 2.1.6 para as amostras restantes.
    8. Agite suavemente a placa durante 30 segundos para assegurar uma distribuição das células. Incubar a placa a 37 ° C numa atmosfera humidificada de CO 2 incubadora durante 24 a 48 h. Refrescar o meio de cultura 24 h após a transfecção.
    9. Avaliar a eficiência de transfecção por análise de Western blot (veja as etapas 3 a 6).
  2. A lipofecção de siRNA em citotrofoblastos primários humanos
    1. Após o isolamento dos citotrofoblastos vilosidades, semear as células a uma densidade de 1,5 x 10 6 culas por po em placas de 6 poços em 2 ml de meio de cultura e incuba-se durante 18 h.
    2. Diluir 300 ng de Syncytin-2-específica siRNA (ou Control-mexidossiARN) e 5 ul de reagente de transfecção à base de lípidos em separadas tubos de 1,5 ml em um volume total de 10 ul de forma a antibióticos e isento de soro. Incubar durante 5 min.
    3. Misturar os reagentes diluídos e incubar durante mais 20 min à temperatura ambiente para formar o complexo de transfecção. Adicionar 90 uL de meio aos antibióticos e sem soro à mistura até um volume final de 100 ul.
    4. Remover o meio de cultura das placas de 6 poços (passo 2.2.1). Adicionar 2 ml de meio fresco e a mistura de transfecção 100 ul a cada poço. Incubar as células a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 durante 24 a 48 h. Refrescar o meio de cultura 24 h após a transfecção.
    5. Avaliar a eficiência de transfecção por análise de Western blot (veja as etapas 3 a 6).

3. Preparação de lisados ​​de células inteiras a partir de cultura

  1. Remova a mídia e lavar cada poço (de passos 2.1.8 e 2.2.4), utilizando DPBS pré-aquecido (Mg 2+, Ca 2+ livre). Aspirar o DPBS e adicionar 500 mL de 0,25% de ácido tripsina / etilenodiaminotetracético (EDTA). Incubar durante 1-3 min a 37 ° C em uma incubadora de CO 2. Pare de tratamento com tripsina, adicionando 500 mL de meio de crescimento contendo soro.
    Nota: Use volume de mídia apropriadas de acordo com o tipo de frasco / prato: 1 ml por 10 7 células / 100 milímetros prato / 150 cm 2 frasco; 0,5 ml por 5 X 10 6 células / placa de 60 mm / 75 cm 2 balão.
  2. Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, as células por centrifugação a 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Lavam-se as células com DPBS (Mg 2+, Ca 2 + livre) e as células por centrifugação a 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente.
  3. Remova cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o sedimento. Colocar o tubo em gelo. Ressuspender o sedimento em 50-200 Radio-imunoprecipitação de Ensaio (RIPA) de tampão gelado ul (ver Quadro 2 para a composição do tampão) contendo recém adicionarEd protease e inibidores de fosfatase a uma concentração final de 1x. Resumidamente, vortex do tubo e deixar em gelo durante 30 min.
  4. Centrifugação a 16000 xg durante 20 min a 4 ° C. Com cuidado, coloque o tubo em gelo. Usando uma pipeta, transferir o sobrenadante para um tubo de microcentrífuga fresco pré-arrefecida mantido em gelo. Descartar o sedimento.

4. Preparação de Extratos nucleares de células em cultura

  1. Para cada poço (passo 1.2.5), lavar citotrofoblastos cultivadas duas vezes com 1 ml de DPBS pré-aquecido (Mg2 +, Ca2 + livre). Aspirar DPBS e adicionar 500 mL de 0,25% tripsina / EDTA. Incubar durante 1-3 min a 37 ° C em uma incubadora de CO 2 e parar o tratamento de tripsina por adição de 500 ul de meio de crescimento contendo soro.
  2. Transferir as células para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, as células por centrifugação a 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Lavam-se as células com DPBS (Mg 2+, Ca 2 + livre) e as células por centrifugaçãoa 300 xg durante 2 min à temperatura ambiente. Retire com cuidado todas sobrenadante sem perturbar o sedimento e colocar o tubo no gelo.
  3. Extracto de proteína nuclear de acordo com as instruções do fabricante. Determinar a concentração de proteína de cada amostra utilizando o ensaio de quantificação de proteínas (Bradford ou ensaio de ácido bicincon�ico (BCA)).

5. Preparação de amostras e Electroforese

  1. Determinar a concentração de proteína para cada extracto celular utilizando um ensaio de quantificação de proteína (por exemplo, Bradford 8 ou 9 BCA).
  2. De acordo com as instruções do fabricante (se os anticorpos poderiam ser utilizados em condições de redução e desnaturação), adicionar um volume igual de 2x tampão de amostra de Laemmli (Tabela 2) a 20-30 ug de proteína total.
  3. Os lisados ​​celulares em ebulição a 100 ° C durante 5 min. Aliquota 50-100 ul de lisado para evitar ciclos de congelamento / descongelamento repetidos e armazenar os restantes tubos a -20 ° C para uso futuro.
  4. Enquanto as amostras são aquecimento, preparar 1 L de 1x tampão de corrida (Tabela 2).
  5. Rodar as amostras a 16.000 xg durante alguns segundos e colocá-los em gelo.
  6. Carga igual quantidade de proteína em cada poço de um gel SDS-PAGE a 12% (ver Quadro 2 para a composição de gel), juntamente com um marcador de peso molecular. Submeter o gel durante 1 a 2 horas a 100 V.

6. Transferir a proteína a partir do gel para a membrana

  1. Activa membrana de fluoreto de polivinilideno (PVDF) com metanol durante 1 min e lavar com solução de tampão / metanol a 10% a transferência de 1x. De acordo com as instruções do fabricante, transferir durante 30 min a 1 hora, dependendo do tamanho da proteína.
    Nota: eficiência de transferência pode ser avaliada utilizando a coloração de Ponceau Red antes do passo de bloqueamento.

7. Anticorpo de coloração

  1. Bloquear a membrana durante 1 hora à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C utilizando uma solução de bloqueamento de 5%.
  2. Incubar a membrana com anticorpos anti-Syncytin-2 (4 ng / ml; 1: 5000) 6 ou com anti-gliceraldeído-3-fosfato desidrogenase (GAPDH; 0,4 ug / ml; 1: 500) em solução de bloqueio 5% durante a noite a 4 ° C (anti-Syncytin-2) ou durante 45 min à temperatura ambiente. Lava-se a membrana três vezes em solução salina tamponada com Tris Tween (TBST; ver Quadro 2 para a composição do tampão) durante 5 min.
  3. Incubar a membrana com peroxidase de rábano apropriado (HRP) -conjugated anti-coelho ou anti-ratinho (1: 10000) em 5% de tampão em TBST bloqueio à temperatura ambiente durante 1 h. Lava-se a membrana três vezes em TBST durante 5 minutos e depois enxaguar em TBS. Detectar sinais utilizando o substrato blotting à base de quimioluminescência.

8. A marcação radioactiva de cadeia simples Oligonucle�ido

  1. reacção de fosforilação
    1. Num tubo de microcentrífuga, adicionar 50 ng de um oligonucleótido para a frente juntamente com T4 polinucleótido quinase 1x tampão, 1 LT4 polinucleótido-quinase e 20 uCi (γ- 32 P) ATP e perfazer o volume de reacção para 20 l com água livre de nuclease.
    2. Incubar a 37 ° C durante 30 min. Parar a reacção por adição de 5 ul de EDTA 0,5 M. Perfazer o volume de 50 ul com água livre de nuclease.
  2. A remoção dos nucleótidos não incorporados a partir de oligonucleótidos
    1. Prepara-se uma coluna G-25 equilibrada com tampão TE (Tabela 2) seguindo as instruções do fabricante. Colocar a coluna em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml de DNase-livre fresco.
    2. Lentamente, adicionar 50 ul de sonda (a partir do passo 8.1.2) sobre a resina, tendo o cuidado de não perturbar o leito de resina. Rotação durante 2 minutos a 350 x g para recolher a amostra purificada no tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Lava-se a coluna G-25 com 36 ul de água isenta de nuclease e centrifugação durante 2 minutos a 350 xg para recolhê-lo no tubo de microcentrífuga.
  3. A hibridação com a cadeia complementar oligonucleotide
    1. Transferir a sonda marcada radioactivamente (86 ul) para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml e adicionar 200 ng do oligonucleótido reverso e 1 x de tampão de recozimento (Tabela 2). Aquecer 5 min a 95 ° C e deixar durante a noite à temperatura ambiente para arrefecimento.
    2. Prepare não radioactivos oligonucleótidos de cadeia dupla pela adição de 50 ng de não marcado para a frente e oligonucleótidos e 1x de tampão de recozimento reversa num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml. Perfazer o volume de 100 ml com água livre de nuclease. Calor e manter a temperatura ambiente como descrito no passo 8.3.1.

9. Preparação de um gel de poliacrilamida não desnaturante para EMSA

  1. Preparar um gel nativo a 4% (10 x 12 cm), com um espaço de pente 1,5 mm (ver Quadro 2 para a composição de gel). Limpe todas as placas de vidro com água destilada.
    Nota: É fundamental que as placas de ser completamente livre de detergente iónico, como SDS.
  2. imediatamente pa solução de acrilamida entre as placas e permitir a polimerização se realizasse (aproximadamente 30 min).
  3. Montar o aparelho de eletroforese e encher o tanque com TBE 0,5x. Pré-correr o gel durante 30 min a 1 h a 150 V antes do carregamento da amostra.

10. ADN de ligação Reacção

  1. Em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, adicionar 10 mg de extrato nuclear (passo 4.3) em tampão de Deslocamento da Encadernação 1x Gel (Tabela 2) e completar o volume final para 10 ml com água livre de nuclease. Como um controlo, preparar um tubo sem o extracto nuclear. Para a reacção de competição, adicionar 1 ul de oligonucleótido de cadeia dupla frio não específica ou específica (passo 8.3.2).
  2. Adicionar 1 ml de sonda radioactiva a partir do passo 8.3.1 a cada reacção. Incubar a reacção a temperatura ambiente durante 20 min. Adicionar 1 ml de tampão de carregamento de gel 10x por reação e carregar cada amostra no gel preparada na secção 9.
  3. Submeter o gel durante 1 1/2 a 2 horas a 150 V. Após a migração, enrole o gel eo vidro em um filme plástico e posição em uma cassete de exposição abaixo uma tela de fósforo. Deixar cassete a 4 ° C durante 24 h.
  4. Remova a tela a partir da cassete de exposição e inserir no dispositivo de imagem de fósforo para digitalização.

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Resultados

placentas frescos de gestação a termo foram usados ​​para isolar citotrofoblastos vilosidades primárias humanos para conduzir o conjunto de experimentos apresentados na seção Protocolo. Seguindo o seu isolamento, analisou-se primeiro a pureza de citotrofoblastos através da utilização do marcador citoqueratina-7 (Figura 1). Preparações celulares foram assim coradas utilizando um anticorpo monoclonal anti-citoqueratina-7. A Figura 1 representa os resultado...

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Discussão

Estudos sobre a função da placenta humana e desenvolvimento têm sido muito melhorada através de protocolos destinados a optimizar o isolamento de várias populações de células da placenta. Um dos melhores população de células da placenta estudado continua a ser o citotrofoblastos vilosidades, o estudo de que muito tem beneficiado de protocolos otimizados que permitem o isolamento eficiente e confiável. Isto permitiu ainda um certo número de experiências, tais como estudos de transfecção e promotor. Usando um protocolo pr...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciências e Pesquisa de Engenharia do Canadá (NSERC) (# 298527) (BB). CT foi apoiado por uma bolsa FARE institucional. AV foi apoiado por um Ph.D. NSERC Graham Bell Bolsa. BB realizou uma Research Chair Canadá em Retrovirology Humano (Tier 2). Graças a Beatrix Beisner para ajudar na revisão do texto.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
HBSS sem  Ca2+, Mg2+ Sigma#H2387
HBSS (10x)Sigma# 14060-057
DMEM Alta Glicose sem HepesGibco# 12100-061
Hepes (1 M)Gibco# 15630-080
Penicilina-Estreptomicina-Neomicina (100x)Gibco# 15640-055
Anfotericina B Sigma#A2411
CaCl2Sigma#C4901
MgSO4.7H2O Sigma#M
Soro fetal bovinoGibco#16170-078 
Percoll Sigma#P-1644Para tecnologias de gradiente de densidade
Syncytin-2 siRNAAmbion Life#AM16708
SiRNA embaralhadoQiagen# SI03650318
DNase ISigma-Aldrich#D5025
Tripsina, tipo I Sigma#T8003
DharmaFECT Lipotransfecção reagentes GEhealthcare# T-2001-01
Trypsin/EDTALife technologies#25300-062
Inibidor de Protease CocktailRoche Diagnostic#11873580001
Pierce BCA Protein Assay KitThermo Scientific#23225
BSASigma#A7906
TWEEN 20Sigma#P9416 
IgG anti-coelho, anticorpo ligado a HRP Sinalização Celular#7074
BM Quimioluminescência Western Blotting Substrate (POD)Roche Diagnostic#11500708001
DPBS Life technologies#14287-080
T4 Polinucleotídeo QuinaseNEB#M0201S
ATP, [γ-32P]Perkin Elmer#BLU002A100UC
AcrylmideSigma 
TEMEDLife technologies#17919
Persulfato de AmônioSigma 
Anti-citoqueratina-7 anti-humano clone LP5K, FITC conjugadoMilliporeCBL194FDiluição 1:200
FcR reagente bloqueador Miltenyi Biotec130- 059-901Diluição 1:10
Citômetro de Fluxo BD Sistema AcuriAparelho Becton Dickinson
Microporator MP-100 Tampão de Ressuspensão Digital Bio
R (Sistema de Transfecção Neon 100  µ l Kit)Tecnologias de vidaMPK10096
membrana PVDF MilliporeIPVH00010 Ativar com metanol
Anticorpo anti-GAPDH humanoSanta Cruz Biotechnologysc-1371791:500
HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugado anti-coelho anti-coelho anticorpo ou anti-camundongoSinalização Celular#70741:10,000
HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugado anti-rato de cabra anti-mouseSinalização Celular#7076 1:10.000
Reagente de Extração Nuclear e Citoplasmática NE-PERThermo Scientific#78833
G-25 coluna GE Healthcare#27-5325-01
Dispositivo de imagem de quimioluminescência e fluorescênciaMontré al BiotechFusion FX5
4% gel nativoPBS
em casa1x
Sistema de Imageador Molecular Pessoal (PMI)BioRad
#A9099#A3678caseiro Feito

Referências

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