Este protocolo descreve um método para eficazmente transfectar siARN em citotrofoblastos vilosidades humanos isolados de fresco utilizando formação de microporos e identificação de complexos de ADN-proteína nestas células. As células transfectadas pode ser monitorado por análises Western blot e EMSA durante o tempo de cultura de 4 dias.
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Artigo de método
As análises siRNA transfecção e EMSA sobre recentemente isolados das vilosidades citotrofoblastos Humanos
Neste artigo
Resumo
Resumo
Os citotrofoblastos vilosos primários humanos são uma fonte muito útil de células primárias para estudar as funções placentárias e os mecanismos regulatórios e para compreender doenças relacionadas à gravidez. Neste protocolo, citotrofoblastos vilosos primários humanos recém-isolados de placentas por meio de um protocolo padrão de DNase / tripsina são microporados com pequeno RNA interferente (siRNA). Essa abordagem proporcionou maior eficiência para a transfecção de siRNA quando comparada a um método baseado em lipofecção. As células transfectadas podem ser posteriormente analisadas por Western blot padrão dentro de um período de 3-4 dias após a transfecção. Além disso, usando citotrofoblastos vilosos primários cultivados, a análise do Ensaio de Deslocamento de Mobilidade Eletroforética (EMSA) foi otimizada e realizada em extratos dos dias 1 a 4. O uso dessas células primárias cultivadas e o protocolo descrito permitem uma avaliação da implicação de genes específicos e fatores de transcrição no processo de diferenciação do citotrofoblasto viloso em uma camada celular semelhante ao sinciciotrofoblasto. No entanto, o período de tempo limitado permitido na cultura impede o uso de métodos que requerem mais tempo, como a geração de uma população de células estável. Portanto, o teste dessa população de células requer protocolos de transferência de genes altamente otimizados.
Introdução
A disfunção placentária humana está associada ao desenvolvimento de várias doenças associadas à gravidez, como pré-eclâmpsia e restrição de crescimento intrauterino 1. Um importante constituinte celular da placenta são os trofoblastos, que podem ser classificados como citotrofoblastos extravilosos ou vilosos. Após a fusão, os citotrofoblastos vilosos se diferenciam ainda mais na camada sinciciotrofoblástica, uma estrutura celular multinuclear com um papel importante na troca feto-materna e na produção de hormônios 2. Os citotrofoblastos vilosos primários humanos e suas contrapartes diferenciadas representam importantes amostras biológicas e permi....
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Protocolo
O comitê de ética UQAM aprovou estes protocolos, que estão em conformidade com as orientações do comitê de ética de St-Luc Hospital do Centre Hospitalier Universitaire de Montreal (Montreal, Canadá). Os participantes assinaram um termo de consentimento informado.
1. Médio Preparação e Isolamento de primárias das vilosidades citotrofoblastos
- Prepare meio de cultura para citotrofoblastos vilosidades primárias humanas, completando meio de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM), com HEPES 25 mM, 10% de Soro Fetal Bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina. Filtrar o meio preparado por meio estéril filtro de 0,22 um e armazenar em um congelado....
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Resultados
placentas frescos de gestação a termo foram usados para isolar citotrofoblastos vilosidades primárias humanos para conduzir o conjunto de experimentos apresentados na seção Protocolo. Seguindo o seu isolamento, analisou-se primeiro a pureza de citotrofoblastos através da utilização do marcador citoqueratina-7 (Figura 1). Preparações celulares foram assim coradas utilizando um anticorpo monoclonal anti-citoqueratina-7. A Figura 1 representa os resultado.......
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Discussão
Estudos sobre a função da placenta humana e desenvolvimento têm sido muito melhorada através de protocolos destinados a optimizar o isolamento de várias populações de células da placenta. Um dos melhores população de células da placenta estudado continua a ser o citotrofoblastos vilosidades, o estudo de que muito tem beneficiado de protocolos otimizados que permitem o isolamento eficiente e confiável. Isto permitiu ainda um certo número de experiências, tais como estudos de transfecção e promotor. Usando um protocolo pr.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado por uma bolsa do Conselho Nacional de Ciências e Pesquisa de Engenharia do Canadá (NSERC) (# 298527) (BB). CT foi apoiado por uma bolsa FARE institucional. AV foi apoiado por um Ph.D. NSERC Graham Bell Bolsa. BB realizou uma Research Chair Canadá em Retrovirology Humano (Tier 2). Graças a Beatrix Beisner para ajudar na revisão do texto.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| HBSS sem Ca2+, Mg2+ | Sigma | #H2387 | |
| HBSS (10x) | Sigma | # 14060-057 | |
| DMEM Alta Glicose sem Hepes | Gibco | # 12100-061 | |
| Hepes (1 M) | Gibco | # 15630-080 | |
| Penicilina-Estreptomicina-Neomicina (100x) | Gibco | # 15640-055 | |
| Anfotericina B | Sigma | #A2411 | |
| CaCl2 | Sigma | #C4901 | |
| MgSO4.7H2O | Sigma | #M | |
| Soro fetal bovino | Gibco | #16170-078 | |
| Percoll | Sigma | #P-1644 | Para tecnologias de gradiente de densidade |
| Syncytin-2 siRNA | Ambion Life | #AM16708 | |
| SiRNA embaralhado | Qiagen | # SI03650318 | |
| DNase I | Sigma-Aldrich | #D5025 | |
| Tripsina, tipo I | Sigma | #T8003 | |
| DharmaFECT Lipotransfecção reagentes | GEhealthcare | # T-2001-01 | |
| Trypsin/EDTA | Life technologies | #25300-062 | |
| Inibidor de Protease Cocktail | Roche Diagnostic | #11873580001 | |
| Pierce BCA Protein Assay Kit | Thermo Scientific | #23225 | |
| BSA | Sigma | #A7906 | |
| TWEEN 20 | Sigma | #P9416 | |
| IgG anti-coelho, anticorpo ligado a HRP | Sinalização Celular | #7074 | |
| BM Quimioluminescência Western Blotting Substrate (POD) | Roche Diagnostic | #11500708001 | |
| DPBS | Life technologies | #14287-080 | |
| T4 Polinucleotídeo Quinase | NEB | #M0201S | |
| ATP, [γ-32P] | Perkin Elmer | #BLU002A100UC | |
| Acrylmide | Sigma | ||
| TEMED | Life technologies | #17919 | |
| Persulfato de Amônio | Sigma | ||
| Anti-citoqueratina-7 anti-humano clone LP5K, FITC conjugado | Millipore | CBL194F | Diluição 1:200 |
| FcR reagente bloqueador | Miltenyi Biotec | 130- 059-901 | Diluição 1:10 |
| Citômetro de Fluxo BD Sistema Acuri | Aparelho Becton Dickinson | ||
| Microporator MP-100 | Tampão de Ressuspensão Digital Bio | ||
| R (Sistema de Transfecção Neon 100 µ l Kit) | Tecnologias de vida | MPK10096 | |
| membrana PVDF | Millipore | IPVH00010 | Ativar com metanol |
| Anticorpo anti-GAPDH humano | Santa Cruz Biotechnology | sc-137179 | 1:500 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugado anti-coelho anti-coelho anticorpo ou anti-camundongo | Sinalização Celular | #7074 | 1:10,000 |
| HorseRadish Peroxidase (HRP)-conjugado anti-rato de cabra anti-mouse | Sinalização Celular | #7076 | 1:10.000 |
| Reagente de Extração Nuclear e Citoplasmática NE-PER | Thermo Scientific | #78833 | |
| G-25 coluna | GE Healthcare | #27-5325-01 | |
| Dispositivo de imagem de quimioluminescência e fluorescência | Montré al Biotech | Fusion FX5 | |
| 4% gel nativo | PBS | ||
| em casa | 1x | ||
| Sistema de Imageador Molecular Pessoal (PMI) | BioRad |
Referências
- Huppertz, B. Placental origins of preeclampsia: challenging the current hypothesis. Hypertension. 51, 970-975 (2008).
- Huppertz, B. IFPA Award in Placentology Lecture: Biology of the placental syncytiotrophoblast--myths and facts. Placenta....
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Reimpressões e permissões
