Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Resumo

Mostrado aqui é um método para visualizar a ultraestrutura da matriz extracelular em tecidos cardíacos descelularizados.

Resumo

A fibrose é um componente de todas as formas de doença cardíaca, independentemente da etiologia, e embora muito progresso tenha sido feito no campo da biologia da matriz cardíaca, ainda existem grandes lacunas relacionadas a como a matriz é formada, como a remodelação fisiológica e patológica diferem e, mais importante, como a dinâmica da matriz pode ser manipulada para promover a cicatrização e inibir a fibrose. Atualmente, não há opção de tratamento para controlar, prevenir ou reverter a fibrose cardíaca. Parte do motivo é provavelmente a grande complexidade da formação de cicatrizes cardíacas, como ocorre após o infarto do miocárdio para substituir imediatamente os cardiomiócitos mortos ou moribundos. A própria matriz extracelular participa da remodelação ativando as células residentes e também ajudando a guiar as células infiltrantes para a lesão extinta. A matriz também é uma espécie de armário de armazenamento para proteínas matricelulares que são cruciais para a renovação normal da matriz, bem como para a sinalização fibrótica. Além disso, foi demonstrado que a matriz desempenha um papel eletromecânico no tecido cardíaco. A maioria das técnicas para avaliar a fibrose não é de natureza qualitativa, mas fornece resultados quantitativos que são úteis para comparar dois grupos, mas que não fornecem informações relacionadas à estrutura da matriz subjacente. Destaca-se aqui uma técnica para visualização da ultraestrutura da matriz cardíaca. A microscopia eletrônica de varredura do tecido cardíaco descelularizado revela diferenças marcantes na estrutura que, de outra forma, poderiam ser perdidas usando métodos tradicionais de pesquisa quantitativa.

Introdução

A fibrose interrompe a rede normal de colágeno miocárdico, que é crítica para as funções mecanicistas normais dos cardiomiócitos ^1,2, bem como para a comunicação intercelular, sinalização intracelular e sobrevivência celular ³. O desenvolvimento de fibrose é um dos principais determinantes da função cardíaca, e o remodelamento fibrótico do interstício cardíaco decorrente de uma variedade de etiologias leva ao aumento da rigidez ventricular esquerda e disfunção diastólica ⁴. A fibrose miocárdica também pode levar a arritmias e, seja a progressão do remodelamento fibrótico um fenômeno geral ou local, está altamente associada a um mau pro....

Protocolo

Declaração de Ética: Os protocolos para lidar com os animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care Vanderbilt e Comitê de Uso (IACUC, protocolos número M / 10/117 (suína) e M / 10/219 (ratos) e conduzida de acordo com padrões AAALAC-internacionais. o uso de tecidos cardíacos humano de banco foi aprovado pela Vanderbilt University Medical Center IRB (protocolo número 100.887).

1. Amostra Coleta e Armazenamento

1. Adicione fresco de glutaraldeido a 4% em solução tampão de fosfato 0,1 M (PB).
   CUIDADO: O glutaraldeído é tóxico, usar luvas e trabalhar em um exaustor.
   1. Adicione uma solução de est....

Resultados

A técnica realçada foi aplicada aos tecidos cardíacos de um doador de transplante de coração humano não utilizado (Figura 1), tecidos explantados de pacientes receptores de transplante, corações de tipo selvagem e ratinhos distróficos (Figura 3), e em amostras de coração pós-enfarte do miocárdio de um suíno modelo de lesão cardíaca (Figura 2). Como mostrado na Figura 1, a matriz cardíaco humano é um complexo de proteínas.......

Discussão

preparação seção superfície Cruz é o passo mais crítico durante o protocolo. Para preservar a estrutura fina, as amostras desidratadas devem permanecer em etanol 100% em todos os momentos, até introduzido para o processo de secagem de ponto crítico. Portanto, o corte dos espécimes para alcançar superfícies para exame EM deve ser feito enquanto espécimes estão submersos em etanol em um prato raso. É também fundamental que a superfície exposta não é tocado ou sondado durante o manuseamento subsequente. Sem grandes modific.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Microscopia Eletrônica	Cloreto de Cálcio	12340	100 g
Adesivo de Carbono	Microscopia Eletrônica Sciences	12664	30 g
Abas Adesivas de Carbono	Microscopia Eletrônica Sciences	77825	para caber em pontas Lâminas
Barbear de Dupla Face em Aço Inoxidável	Ted Pella, Inc	121-6	250/pkg
Etanol	Electron Microscopy Sciences	15055	450 ml
de gluteraldeído, solução a 50%	Microscopia eletrônica Sciences	16310	grau EM, purificação por destilação
Microscopia eletrônica	de ácido clorídrico	16760 ou 16770	100 ml
de fosfato monossódico NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250 g
de ósmio	Microscopia Eletrônica	19100	1 g
Adesivo Condutivo de Prata	Microscopia Eletrônica Sciences	12686-15	15 g
Hidróxido de sódio (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 kg
Fosfato de Sódio Dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500 g
Ácido Tânico, 5% Aquoso	Electron Microscopy Sciences	21702-5	500 ml
Trihydrate Sodium Cacodylate	Microscopy Sciences	12300	100 g
Gold-palladium Alloy or Gold	Refining Systems, Inc.	varia	específico para a marca e modelo do revestidor por pulverização catódica
Secador de Ponto Crítico	Microscopia Eletrônica Sciences	850
Aplicadores de Madeira Lisa	Fisher Scientific	23-400-102
Quanta 250 SEM Ambiental	FEI	Q250 SEM
Sputter Coater	Cressington Scientific Instruments Ltd.	Modelo 108
Alluminum SEM Amostra Stubs	Microscopia Eletrônica Ciências	75220-12	específicas para o miscroscópio

de Sciences de Sciences Tetroxide Sciences