Microscopia Eletrônica de Varredura do Tecido macerado para visualizar a matriz extracelular

Summary

Mostrado aqui é um método para visualizar a ultraestrutura da matriz extracelular em tecidos cardíacos descelularizados.

Abstract

A fibrose é um componente de todas as formas de doença cardíaca, independentemente da etiologia, e embora muito progresso tenha sido feito no campo da biologia da matriz cardíaca, ainda existem grandes lacunas relacionadas a como a matriz é formada, como a remodelação fisiológica e patológica diferem e, mais importante, como a dinâmica da matriz pode ser manipulada para promover a cicatrização e inibir a fibrose. Atualmente, não há opção de tratamento para controlar, prevenir ou reverter a fibrose cardíaca. Parte do motivo é provavelmente a grande complexidade da formação de cicatrizes cardíacas, como ocorre após o infarto do miocárdio para substituir imediatamente os cardiomiócitos mortos ou moribundos. A própria matriz extracelular participa da remodelação ativando as células residentes e também ajudando a guiar as células infiltrantes para a lesão extinta. A matriz também é uma espécie de armário de armazenamento para proteínas matricelulares que são cruciais para a renovação normal da matriz, bem como para a sinalização fibrótica. Além disso, foi demonstrado que a matriz desempenha um papel eletromecânico no tecido cardíaco. A maioria das técnicas para avaliar a fibrose não é de natureza qualitativa, mas fornece resultados quantitativos que são úteis para comparar dois grupos, mas que não fornecem informações relacionadas à estrutura da matriz subjacente. Destaca-se aqui uma técnica para visualização da ultraestrutura da matriz cardíaca. A microscopia eletrônica de varredura do tecido cardíaco descelularizado revela diferenças marcantes na estrutura que, de outra forma, poderiam ser perdidas usando métodos tradicionais de pesquisa quantitativa.

Introduction

A fibrose interrompe a rede normal de colágeno miocárdico, que é crítica para as funções mecanicistas normais dos cardiomiócitos ^1,2, bem como para a comunicação intercelular, sinalização intracelular e sobrevivência celular ³. O desenvolvimento de fibrose é um dos principais determinantes da função cardíaca, e o remodelamento fibrótico do interstício cardíaco decorrente de uma variedade de etiologias leva ao aumento da rigidez ventricular esquerda e disfunção diastólica ⁴. A fibrose miocárdica também pode levar a arritmias e, seja a progressão do remodelamento fibrótico um fenômeno geral ou local, está altamente associada a um mau prognóstico em pacientes com cardiomiopatia isquêmica e não isquêmica ⁵. Da mesma forma, a ausência de fibrose miocárdica é um forte preditor de recuperação funcional ventricular e sobrevida em longo prazo ⁶.

A marca registrada da fibrose é a deposição de excesso de colágeno, que tem a resistência à tração do aço ⁷ e pode afetar adversamente a função dos cardiomiócitos em vários níveis. Forças mecânicas resultantes de uma matriz excessivamente colágena podem levar à atrofia dos cardiomiócitos ^8,9, rigidez passiva do tecido ¹⁰, rigidez miocárdica induzida pela contração tônica ^11-13 e redução do fornecimento de oxigênio para a população remanescente de cardiomiócitos. O acoplamento de cardiomiócitos e mioFbs também pode comprometer as características elétricas do coração, criando um risco maior para o desenvolvimento de arritmias ^14-16. A fibrose perivascular altera a reatividade vasomotora das artérias coronárias intramurais e arteríolas17 e contribui para o estreitamento luminal que reduz o suprimento de oxigênio e, portanto, a sobrevida dos cardiomiócitos17-22. A remodelação elétrica e fibrótica patogênica, que emana de um local inicial de lesão isquêmica ou desequilíbrio energético, inevitavelmente progride para insuficiência cardíaca.

A necrose cardiomiócita inicia a resposta fibrótica, e a subsequente remodelação fibrótica adversa pode ocorrer independentemente da etiologia. Encontrar uma maneira de controlar a fibrose cardíaca seria clinicamente benéfico para o tratamento de cardiomiopatias isquêmicas e idiopáticas, cardiopatias hipertensivas, cardiomiopatia hipertrófica, valvopatia e distrofinopatias ^23-42. Independentemente de como o processo da doença fibrótica começa, fatores profibróticos solúveis podem atravessar o espaço intersticial e provocar a ativação de fibroblastos intersticiais e adventícios em locais remotos à cicatriz fibrótica inicial, criando um efeito cascata que acaba levando à insuficiência cardíaca. O cenário ideal seria explorar o processo fibrilogênico usando uma terapêutica direcionada que pode ser aplicada durante o estágio hipertrófico compensatório da cardiomiopatia antes de progredir para insuficiência da bomba sistólica, insuficiência cardíaca diastólica ou outros resultados em estágio terminal. O objetivo final seria reverter a fibrose para que os cardiomiócitos mortos possam ser substituídos e a função cardíaca restaurada completamente.

A importância da matriz é amplamente compreendida, mas os métodos para estudar a matriz são limitados principalmente a medições quantitativas dos principais componentes estruturais, particularmente colágeno, e níveis relativos de diferentes matrizes e proteínas matricelulares. Este protocolo destaca uma técnica raramente utilizada e útil para avaliar diferenças qualitativas na matriz cardíaca. Essa técnica foi recentemente usada para comparar e contrastar diferenças fundamentais em matrizes cardíacas de diferentes etiologias de doenças cardíacas (em explantes humanos), examinar corações de porcos pós-infartados tratados com a isoforma do fator de crescimento glial (GGF) da neuregulina-1β, em relação a animais não tratados ⁴³, e sondar diferenças nas matrizes de tecidos cardíacos de mdx camundongos (um modelo animal comumente usado de Distrofia Muscular de Duchenne) em diferentes idades e em comparação com controles do tipo selvagem. Essa técnica foi introduzida pela primeira vez pelos Drs. Caulfield e Borg em 1979 ⁴⁴, mas poucos estudos empregaram essa poderosa técnica ^45-47, reintroduzida aqui com apenas uma ligeira modificação. Essa metodologia é uma ferramenta de pesquisa valiosa, pois fornece informações qualitativas sobre a ultraestrutura da matriz extracelular que, de outra forma, poderiam ser negligenciadas ao medir simplesmente o conteúdo do componente da matriz e/ou o nível de fibrose.

Protocol

Declaração de Ética: Os protocolos para lidar com os animais foram aprovados pelo Institutional Animal Care Vanderbilt e Comitê de Uso (IACUC, protocolos número M / 10/117 (suína) e M / 10/219 (ratos) e conduzida de acordo com padrões AAALAC-internacionais. o uso de tecidos cardíacos humano de banco foi aprovado pela Vanderbilt University Medical Center IRB (protocolo número 100.887).

1. Amostra Coleta e Armazenamento

1. Adicione fresco de glutaraldeido a 4% em solução tampão de fosfato 0,1 M (PB).
   CUIDADO: O glutaraldeído é tóxico, usar luvas e trabalhar em um exaustor.
   1. Adicione uma solução de estoque 0,2 M de PB, pH 7,4 utilizando 21,8 g de Na ₂ HPO ₄ e 6,4 g de NaH ₂ PO _4. Quantum satis (Qs) a 1000 ml de dH ₂ O.
   2. Adicionar 400 ul de 50% de glutaraldeído e 2,5 ml da solução de PB e 2,1 ml de dH ₂ O.
2. Mergulhe um pedaço (não maior que 2 cm ²⁾ de tecido em solução de glutaraldeido a 4%. Nota: pedaços menores também podem ser usados ​​mas deve ser de tamanho suficiente (não menor do que 5 mm ²⁾ para ser facilmente visualizada por olho, a fim de facilitar as etapas posteriores do protocolo.
3. Incubar à temperatura ambiente durante 1 h, em seguida, armazenar indefinidamente a 4 ° C.

2. Decelularização of Heart Tissue

1. Adicione uma solução aquosa a 10% de NaOH fresco utilizando 10 g de pastilhas de NaOH / 100 ml de dH ₂ O.
   CUIDADO: soluções de NaOH são corrosivos e podem causar alcalinos-queimaduras, usar luvas.
2. Lavar o tecido em dH ₂ O.
3. Incubar em solução de NaOH a 10% à temperatura ambiente durante 6 - 10 dias (até que as mudanças de tecido de castanho-avermelhado para fora-branco ou branco).
4. Enxágüe em _dH2O até que o tecido torna-se transparente.
5. Imergir tecido em ácido tânico 1% durante 4 horas à temperatura ambiente. Use solução de 1 ml de 5% por 4 ml de dH ₂ O.
   CUIDADO: O ácido tânicoé um irritante forte, usar luvas.
6. Enxágüe em _dH2O durante a noite.

3. Osmication e desidratação do coração Tissue (em Fume Hood Segurança)

1. Adicione uma solução de estoque 0,2 M de tampão de cacodilato de sódio utilizando 21,4 g de cacodilato de sódio, 10,0 g de cloreto de cálcio e 450 ml de dH ₂ O. Mistura, em seguida, adiciona-se ácido clorídrico como necessário para ajustar o pH para 7,4. Qs para 500 mL com _dH2O
   CUIDADO: cacodilato de sódio e ácido clorídrico são tóxicos, usar luvas e trabalhar em um exaustor.
2. Adicione solução estoque aquoso a 2% de tetróxido de ósmio no exaustor de fumos para a segurança através da dissolução de 1 g de tetróxido de ósmio cristal em 50 ml _dH2O
   CUIDADO: tetróxido de ósmio é um perigo por inalação grave; fixação de vapor de membranas mucosas ou olhos é possível, portanto, lidar apenas no exaustor com luvas. A proteção contra respingos é recomendado.
3. Lavar o tecido em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (solução estoque mistura 1: 1 com dH _{2 O) por 5 min em rotador (ou agitação suave).}
4. Repita o passo anterior por duas vezes, para um total de três lavagens de buffer.
5. Imergir tecido em 1% de tetróxido de ósmio em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M (mistura de cacodilato de sódio e da lingua de tetróxido de ósmio 1: 1) em rotador durante 1 h.
6. Lavar o tecido em tampão de cacodilato de sódio 0,1 M, 3 vezes durante 5 min cada em rotador.
7. Lavar o tecido utilizando concentrações crescentes de etanol (30%, 50%, 75%, 85%, 95%, e, finalmente, 100%) durante 15 min cada em rotador.

4. Preparação de Superfície Corte Transversal para SEM

1. Transferir o tecido em etanol a 100% a um prato raso de Petri contendo também 100% de etanol.
2. Segurar duas lâminas muito afiadas de tal modo que os planos dos lados estão em contacto uma com a outra e as arestas de corte transversal de modo a formar dois lados de um triângulo equilátero de cima do espécime. Para conseguir isso, usar a mão esquerda para colocar um pino no lado mais à direita da amostra ecorte para a esquerda. Ao mesmo tempo, usar a mão direita para colocar a segunda lâmina na extrema esquerda da amostra e fatia direita. Assim, as pás irão deslizar uma contra a outra a partir de direcções opostas para fazer um único corte liso.
3. Deslize os lados lâmina plana umas contra as outras para fazer um corte muito limpo do espécime com a mínima distorção ou rasgar força, de preferência tão grande expondo uma área de superfície possível, sem danificar a amostra.
4. Repita o procedimento para cada espécime para expor as mais limpas possíveis superfícies de seção transversal para exame na SEM.

5. Pontos Críticos de secagem (CPD) do Coração Tissue

1. Usar uma espátula ou uma pinça para transferir o tecido para o suporte de amostras do secador de ponto crítico (CPD), assegurando que o tecido permanece em etanol a 100% em todos os momentos. Certifique-se de que o suporte é imerso em etanol e de que a transferência é conseguido com o tecido exposto ao ar durante não mais do que alguns segundos.
2. Operar CPD por nósmanual do er para completar 3 purga-e-fill ciclos para substituir o etanol com dióxido de carbono líquido.
3. Operar CPD per manual do usuário para alcançar a secagem ponto crítico das amostras e devolvê-los à pressão atmosférica com ventilação controlada de CO _2.

6. Montagem de Amostras coração de tecido para SEM

1. Prepara-se uma amostra de topo SEM para cada espécime, aderindo uma aba adesiva de carbono para a superfície de topo do topo de alumínio.
2. Com o auxílio de um microscópio estereoscópico, o espécime cuidadosamente aderir à aba adesiva com a superfície de secção transversal de interesse virado para cima (afastado do separador, visível), e tão perto quanto possível em paralelo com o plano da superfície da amostra topo. Não sondar ou toque na superfície de interesse.
3. Quebrar uma vara aplicador de madeira para alcançar uma escova cônico, ideal para aplicação da tinta. Aplicar prata ou tinta de carbono na base e os lados do espécime, para melhorar a adesão ao topo.
4. Estender uma linha muito fina de prata ou de carbono pintar-se a uma aresta da superfície de interesse, para fornecer um caminho de carga a partir da superfície de interesse para o solo.
5. Aplicar 2 ou 3 pequenas salpicos de tinta de prata ou de carbono em torno do perímetro da guia de carbono, para proporcionar um caminho condutor da superfície de guia de carbono para o topo de metal e, assim, para o solo.
6. Permite que a tinta condutora de secar durante duas horas.
7. Operar revestidor por crepitação per manual do usuário para aplicar um revestimento relativamente pesado (intervalo alvo de 30 - 40 nm) de liga de ouro-paládio ou ouro. Bombear câmara de amostra para aproximadamente 0,1 mbar; definido Temporizador de 40 segundos. Abrir Set válvula para a posição 08:00 (fluxo moderado de gás argônio). Press Start para iniciar revestimento por pulverização em 30 mA. descarga luminescente roxo deve ser visível na câmara de amostra.

7. SEM análise de amostras do tecido cardíaco

1. Execute microscopia eletrônica de varredura na relativamente baixa tensão de aceleração para minimizar a imagem pROBLEMAS associados à má dissipação da carga na amostra (carga). condição de imagem inicial sugerida são: 5 kV tensão de aceleração, distância de trabalho de 10 mm.
2. Com a ajuda de um operador experiente, empregam aumento da distância trabalhando para estender a profundidade de campo em condições de imagens que requerem foco de fibras em vários planos focais, ou fibras que se estendem para o comprimento considerável na dimensão z.
   1. Para o microscópio usado aqui (ver Tabela de Materiais), no acesso à interface de usuário na guia de navegação na parte superior direita.
   2. Acesse a aba coordenadas a partir do menu Stage. Para aumentar a distância de trabalho, digite um valor maior em milímetros para a coordenada Z, em seguida, clique no Go To Tab para mover o estágio da amostra à distância de trabalho entrou.
3. Com a ajuda de um operador experiente, empregam espécime inclinação e rotação para posicionar a superfície de interesse ortogonal em relação ao feixe de electrões. inclinação adicional de 10 a 30 DEGRees a partir desta posição pode melhorar a observação e documentação da estrutura da matriz.
   1. Para o microscópio usado aqui (ver Tabela de Materiais), na interface do usuário, clique e segure o botão direito do mouse, em seguida, deslize para a esquerda ou para a direita para focar a amostra perto da periferia do avião superfície preparada de interesse, notando a distância de trabalho focado .
   2. Navegar com o Manual joystick User Interface para mover perto da borda oposta do foco de superfície e de repetição. Se a distância de trabalho não é aproximadamente igual à primeira posição, espécime inclinação para alcançar um acordo aproximado em ambos os locais usando a guia Coordenadas do menu Stage (ver 7.2) e digite um valor de inclinação na T coordenadas.
   3. Gire espécime noventa graus (inserir o valor em R campo de coordenadas) e repita o processo até que todas as posições estão focados em aproximadamente a mesma distância de trabalho.
      Nota: SEM de pressão variável pode ser empregue para melhorar a dissipação de cargasse disponível. Alto vácuo é o modo de operação padrão para microscopia eletrônica de varredura.

Results

A técnica realçada foi aplicada aos tecidos cardíacos de um doador de transplante de coração humano não utilizado (Figura 1), tecidos explantados de pacientes receptores de transplante, corações de tipo selvagem e ratinhos distróficos (Figura 3), e em amostras de coração pós-enfarte do miocárdio de um suíno modelo de lesão cardíaca (Figura 2). Como mostrado na Figura 1, a matriz cardíaco humano é um complexo de proteínas...

Discussion

preparação seção superfície Cruz é o passo mais crítico durante o protocolo. Para preservar a estrutura fina, as amostras desidratadas devem permanecer em etanol 100% em todos os momentos, até introduzido para o processo de secagem de ponto crítico. Portanto, o corte dos espécimes para alcançar superfícies para exame EM deve ser feito enquanto espécimes estão submersos em etanol em um prato raso. É também fundamental que a superfície exposta não é tocado ou sondado durante o manuseamento subsequente. Sem grandes modific...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Microscopia Eletrônica	Cloreto de Cálcio	12340	100 g
Adesivo de Carbono	Microscopia Eletrônica Sciences	12664	30 g
Abas Adesivas de Carbono	Microscopia Eletrônica Sciences	77825	para caber em pontas Lâminas
Barbear de Dupla Face em Aço Inoxidável	Ted Pella, Inc	121-6	250/pkg
Etanol	Electron Microscopy Sciences	15055	450 ml
de gluteraldeído, solução a 50%	Microscopia eletrônica Sciences	16310	grau EM, purificação por destilação
Microscopia eletrônica	de ácido clorídrico	16760 ou 16770	100 ml
de fosfato monossódico NaH2PO4	Sigma-Aldrich	S9251-250G	250 g
de ósmio	Microscopia Eletrônica	19100	1 g
Adesivo Condutivo de Prata	Microscopia Eletrônica Sciences	12686-15	15 g
Hidróxido de sódio (NaOH)	Sigma-Aldrich	S8045-1KG	1 kg
Fosfato de Sódio Dibásico (Na2HPO4)	Sigma-Aldrich	S3264-500G	500 g
Ácido Tânico, 5% Aquoso	Electron Microscopy Sciences	21702-5	500 ml
Trihydrate Sodium Cacodylate	Microscopy Sciences	12300	100 g
Gold-palladium Alloy or Gold	Refining Systems, Inc.	varia	específico para a marca e modelo do revestidor por pulverização catódica
Secador de Ponto Crítico	Microscopia Eletrônica Sciences	850
Aplicadores de Madeira Lisa	Fisher Scientific	23-400-102
Quanta 250 SEM Ambiental	FEI	Q250 SEM
Sputter Coater	Cressington Scientific Instruments Ltd.	Modelo 108
Alluminum SEM Amostra Stubs	Microscopia Eletrônica Ciências	75220-12	específicas para o miscroscópio