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Artigo de método

In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas

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DOI:

10.3791/54016

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10 de junho de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1Diabetes and Metabolism Research Institute, Beckman Research Institute of City of Hope, 2Irell & Manella Graduate School of Biological Sciences, Beckman Research Institute of City of Hope, 3Division of Chemistry and Chemical Engineering, California Institute of Technology

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.

Resumo

Stem e células progenitoras do pâncreas adultos poderia ser uma fonte potencial de células beta como terapêuticos para o tratamento de pacientes com diabetes do tipo 1. No entanto, ainda é desconhecido se existem células estaminais e progenitoras no pâncreas adulto. estratégias de pesquisa usando cre-lox linhagem-tracing em ratos adultos têm rendido resultados que apoiar ou refutar a ideia de que as células beta podem ser gerados a partir dos dutos, a localização presumida quando adultas progenitoras pancreáticas podem residir. Estes métodos de rastreamento de linhagem in vivo cre-lox, no entanto, não pode responder às perguntas de auto-renovação e multi-linhagem de diferenciação e dois critérios necessários para definir uma célula-tronco. Para começar a abordar esta lacuna técnica, eu inventei ensaios de colónias 3-dimensionais para progenitores pancreáticas. Logo após a publicação inicial, outros laboratórios desenvolveram independentemente um semelhante, mas não idêntico, método chamado o ensaio organ�de. Em comparação com o ensaio de organ�de, o nosso método empregametilcelulose, que forma soluções viscosas que permitem a inclusão de proteínas de matriz extracelular em baixas concentrações. Os ensaios de metilcelulose contendo permitir a detecção e análise das células progenitoras para o nível de uma única célula, que são críticos quando progenitoras constituem uma pequena sub-população mais fácil, como é o caso de muitas células estaminais adultas de órgãos. Juntos, os resultados de vários laboratórios demonstrar in vitro de auto-renovação e multi-linhagem diferenciação de células progenitoras semelhante pancreáticas de ratos. Os protocolos atuais descrevem dois ensaios de colónias à base de metilcelulose para caracterizar progenitores rato pancreáticas; um contém uma preparação comercial de proteínas da matriz extracelular de murino e o outro uma proteína da matriz extracelular artificial conhecido como um hidrogel laminina. As técnicas aqui descritas são: 1) dissociação do pâncreas e triagem de CD133 + Sox9 / eGFP + ductais de ratos adultos, 2) manipulação de uma única célula das scélulas orted, 3) analisa única colônia usando 4) dissociação de colónias primárias em uma única célula suspensões e re-plaqueamento microfluídico qRT-PCR e montagem-toda a imunocoloração, e em ensaios de colónias secundárias para avaliar a auto-renovação ou diferenciação.

Introdução

O pâncreas é composto por três grandes linhagens celulares; células acinares secretam enzimas digestivas, dutos segregam mucina para se defender de agentes patogénicos e transportar enzimas digestivas para o intestino, e células endócrinas secretam hormônios, incluindo a insulina e glucagon, que mantêm a homeostase da glicose. Durante o desenvolvimento embrionário do pâncreas, as células ductais primeiros são a fonte das células progenitoras tri-potentes, capazes de dar origem às três linhagens no pâncreas dos animais adultos 1,2. Como as células estaminais e progenitoras adultas, tais como células estaminais da medula óssea, são já utilizados com sucesso no tratamento de várias doenças 3, existe grande interesse em encontrar as células estaminais e progenitoras no pâncreas adulto. Se o isolamento e manipulação de células estaminais e progenitoras adultas pancreáticos eram possíveis, estas células podem ser usadas para o tratamento de doenças tais como diabetes do tipo 1, em que as células secretoras de insulina são destruídas por auto-imunidade.

Se as células progenitoras tri-potente ainda existem em ductos pancreáticos adultos após a conclusão do desenvolvimento embrionário é uma pergunta que é fortemente debatida na comunidade científica. Neste debate, e usando in vivo cre-lox-linhagem rastreamento técnicas, Inada e colaboradores mostraram que as células do ducto murino adulto marcadas com um marcador, anidrase carbônica II, poderia dar origem a todos os três linhagens pancreáticas 4. No entanto, o uso de outros marcadores, tais como ductais HNF1B 5 e 2 Sox9, concluiu-se que as células ductais não são a principal fonte de células beta em ratos adultos.

Vários anos atrás, foi proposto que a causa da discussão acima mencionado pode ser devido à falta, na área 6,7, de ferramentas analíticas adequadas que podem ser utilizadas para medir a auto-renovação e multi-linhagem diferenciação dois critérios necessário definir uma célula estaminal. O vivo técnica de rastreamento de linhagem em cre-lox mencionadoacima pode fornecer evidência para a relação progenitor-descendência em um nível populacional. No entanto, esta técnica traçar a linhagem é limitado em seu poder para discernir se as células progenitoras individuais podem auto-renovar e diferenciar em várias linhagens. análise de uma única célula é importante porque se vários progenitores mono-potente, cada um com um potencial de linhagem diferente, foram analisados ​​em conjunto, eles podem aparecer em conjunto para ter capacidades de diferenciação multi-linhagem. Além disso, as células estaminais são normalmente uma população menor de um órgão adulto. As actividades de uma população de células menor pode ser mascarado pela maior população. Portanto, um resultado negativo de um estudo populacional não indica necessariamente a ausência de células-tronco. Finalmente, cre-lox linhagem rastreamento atualmente não permite a medição de auto-renovação.

Para começar a abordar a lacuna técnica no campo da biologia de células progenitoras do pâncreas, colônia 7-11 ou 12-15 organ�de ensaios utilizando sistemas de cultura 3D foram concebidos. Dois ensaios de colónias de progenitores pancreáticos foram desenvolvidos no nosso laboratório: uma contém uma preparação comercial de proteínas murinas da matriz extracelular (ECM) (ver Tabela Métodos e do equipamento), e o outro contém hidrogel laminina, uma proteína da MEC artificial definido 7-11. As células progenitoras são misturados em meio semi-sólido contendo metilcelulose. A metilcelulose é um material biologicamente inerte e viscosa preparada a partir de fibras de madeira, e tem sido utilizada rotineiramente em ensaios de colónias hematopoiéticas 16. O meio semi-sólido contendo metilcelulose-restringe o movimento das células progenitoras individuais de modo que não pode voltar a agregado. No entanto, a forma é suficientemente mole para permitir que uma célula progenitora para crescer e se diferenciam em células de uma colónia no espaço 3D. Seguindo a tradição dos hematologistas, uma célula progenitora pancreático que foi capaz de dar origem a uma colônia de células foi named uma unidade de formação de colónias do pâncreas (PCFU). PCFUs, quando cultivada no ensaio colónia contendo ECM murino, dão origem a colônias císticos que são nomeados "anel" colônias 7. Após a adição de um agonista de Wnt, R-spondin1, na cultura contendo ECM murino, algumas colónias anel transformar em colónias "densas" 7. Neste artigo, estes dois tipos de colônias crescidas em cultura ECM murino são colectivamente referidos como colônias "anel / densas". Quando anel / colônias densas são dissociados em suspensão única célula e re-banhado em culturas que contêm laminina hidrogel, colônias "Endocrine / acinares" são formadas 7.

Usando única colônia análises, verificou-se que a maioria das colônias Anel / densas e Endócrino / acinares, quer a partir de adultos (2-4 meses de idade) 7,11 ou jovens (1 semana de idade) 9 pâncreas murino, expressar todos os três marcadores de linhagem. Isto sugere que a maioria dos PCFUs originárias são tri-potente. No ensaio colónia contendo ECM murino, adulto PCFUs murino robustamente auto-renovar e expandir cerca de 500.000 vezes mais de 11 semanas em cultura 7. ECM murino preferencialmente apoia a diferenciação de células ductais mais endócrinas e acinares linhagens, ao passo que na presença de hidrogel laminina, PCFUs murino são encorajados a diferenciar-se preferencialmente em células endócrinas e acinares e menos para a linhagem ductal 7,9,11. Importante, Insulina Glucagon + - células mono-hormonal são geradas na cultura hidrogel laminina e segregam insulina em resposta à glicose estimulação in vitro de 7,9, sugerindo a maturidade funcional. A diferenciação tri-linhagem potencial de 7,9 e auto-renovação 11 de PCFUs individuais são confirmados por micromanipulação de uma única célula, ou seja, a cultura de uma célula por poço para a formação de colónias. Juntos, estes resultados fornecem evidências de que há auto-renovação, tri-potent, células progenitoras-like no pâncreas murino pós-natal que mostram actividades na cultura 3D.

Os ensaios PCFU murino descritas neste artigo são derivados a partir de um ensaio de colónias antes concebido para células progenitoras diferenciadas a partir de células estaminais embrionárias de murídeo (17) mESCs. Esse protocolo está documentada em detalhes em outra publicação JoVE 18. Os componentes e as técnicas necessárias para realizar o ensaio de colónias contendo ECM murino para adultos PCFUs cultura são os mesmos que para os progenitores derivados MESC-17,18. Portanto, estes aspectos do ensaio não será repetido aqui; em vez disso, ser dirigida os seguintes procedimentos: 1) dissociação do pâncreas adulto e triagem + células CD133 + Sox9 / EGFP ductais, que enriquecem PCFUs a partir de ratinhos adultos 7, 2) manipulação de uma única célula das células separadas, 3) uma única colónia análises usando 4) dissociação do colonie microfluídico qRT-PCR e montagem-toda a imunocoloração, es em suspensão de uma única célula e re-plaqueamento em ECM murino ou laminina ensaios hidrogel colônia.

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Protocolo

Declaração de Ética: Nós aderir aos padrões éticos amplamente aceitas na realização de pesquisas para garantir a qualidade ea integridade dos resultados. A experimentação animal é conduzido de acordo com protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da City of Hope.

1. Prepare suspensão de célula individual desde Adulto Murino pancreata

NOTA: Em publicações anteriores 7,11, foram utilizados ratos CD-1 ou fundo B6; ambos os fundos obtiveram resultados semelhantes. Uma linha de rato transgénico (designado Sox9 / EGFP) com reforçada proteína verde fluorescente conduzido por Sox9 loci 19,20, foi criado no CD-1 de fundo.

  1. Eutanásia 3 a 5 ratos adultos, usando CO 2 do gás para 1-2 min ou até que a respiração pára. Em seguida, executar deslocamento cervical em cada rato.
  2. Dissecar e Preparar o pâncreas.
    NOTA: dissecar os ratinhos, logo que possível após a eutanásia. Isto é importante para evitar a auto-digestão no pâncreas devidoàs mudanças post-mortem.
    1. Adicione uma incisão vertical na linha média da parede abdominal do rato utilizando tesouras e abrir a cavidade abdominal. Encontre o baço e utilize uma pinça para levantá-lo delicadamente. Corte o tecido conjuntivo entre o baço e o lobo do baço do pâncreas com uma tesoura.
      1. Repita esta prática para os lobos duodenais e gástricas do pâncreas. Colocar os tecidos pancreáticos num prato de Petri contendo solução em gelo frio de Dulbecco modificado de tampão fosfato (DPBS), 0,1% de albumina de soro bovino (BSA), e penicilina e estreptomicina (P / S; solução completa designada como PBS / BSA).
    2. Remover tecidos gordos do pâncreas sob um microscópio de dissecação com a pinça de ponta fina.
      NOTA: Este é crítico para a saúde das células pancreáticas dissociados nos seguintes passos.
      1. (Opcional) Marque a pancreata para fluorescência verde sob o estereomicroscópio de fluorescência usando 488-509 nm de excitação para garantirexpressão EGFP.
    3. Em uma capa de cultura de tecidos, lavar o tecido três vezes consecutivamente em três pratos de 100 milímetros de Petri contendo 10 ml de frio PBS / BSA.
  3. Gerar pequenos pedaços de tecidos.
    1. Transferir o pâncreas dissecada para uma placa de Petri estéril e seco para remover o máximo de PBS / BSA como possível, e transferi-los para uma outra placa de Petri sobre gelo seco.
    2. Prepare de PBS / BSA contendo ADNase I por adição de 2 ul de ADNase I solução de reserva (1 milhão de unidades [MU] / mL) por 1 ml de PBS / BSA.
      NOTA: esta solução é designado PBS / BSA / ADNase I. ~ Adicione 200 ml desta solução ao mesmo tempo, que vai cobrir uma experiência de triagem.
    3. Picar o pancreata usando uma tesoura primavera por 2-3 min ou até que o tecido está em pedaços finos. Adicionar 2-3 ml de PBS frio / BSA / ADNase I para os pedaços de tecido na placa de Petri a suspendê-las.
    4. Transferir os pedaços de tecido para um tubo cónico de 50 mL em gelo com uma pipeta de 10 mL. Levar o volume total a 10 ml com PBS / BSA l / DNase após recuperar o máximo de tecido possível.
  4. Digerir o pâncreas Pieces em células Principalmente individuais.
    1. Adicionar colagenase B (100 mg / ml de caldo) em 350-450 ul / 10 ml para os pedaços de tecido e o tecido incubar a 37 ° C num banho de água durante 8 min, agitando a cada 3-4 minutos. Use uma seringa de 10 ml com uma agulha de 16 ½ G a elaborar e, posteriormente, pulverizar a solução de tecido para baixo a parede do tubo de 50 ml à temperatura ambiente. Repita isso sete vezes.
      NOTA: Use força suficiente para quebrar os aglomerados de células, mas evitar a geração de bolhas que podem matar as células.
    2. Retorno do tubo para o banho de água a 37 ° C durante 8 minutos e misture agitando a cada 3-4 min. Seringa o tecido cima e para baixo sete vezes, conforme mencionado acima, e colocar uma amostra (10 ul) da solução de tecidos em uma caixa de Petri seco. Observe a solução tecido sob um, de contraste de fase invertido, microscópio óptico com uma lente objetiva de 10X. Esperar células individuais e alguns de pequeno porte cclusters de ell para estar presente.
    3. Lidar com as células no gelo a partir deste ponto para retardar ou parar a atividade de colagenase. Ajustar o volume para 50 ml usando frio PBS / BSA / ADNase I. Centrifugar as células a 400 xg durante 5 min a 4 ° C, e ressuspender em 5 ml de PBS frio / BSA / ADNase I usando um pipetador P1000.
  5. Filtro para produzir suspensões de células individuais e lavar.
    1. Filtrar as células através de um copo do filtro de malha de nylon de 70 ^ m e, em seguida, através de um copo do filtro de malha de nylon de 40? M.
    2. Ressuspender as células em 5 ml de PBS frio / BSA / ADNase I e contar as células.
      NOTA: Para 2-4 meses de idade B6 ou camundongos CD-1, cada um pâncreas pode produzir ~ 5 ou 10 milhões de células, respectivamente. Estes números podem variar entre diferentes experimentalistas. Se os detritos celulares excessiva é encontrada na contagem, levar o volume até 50 ml com PBS frio / BSA / ADNase I e centrifugar as células a 400 xg durante 5 min a 4 ° C.
    3. Ajustar o volume da suspensão de células a uma concentração de 2 x 107 células / ml, utilizando solução PBS frio / BSA / ADNase I.

2. Organizar os Cells para enriquecer pancreáticas Progenitores Colony formadoras

NOTA: A partir de ratinhos B6, CD133 +, mas não CD133 - células são enriquecidos para PCFUs 7,9,11. Células CD133 + ~ representam 13% do total dissociado células pancreáticas depois de todos os parâmetros de propagação são aplicados 11. A partir de ratinhos CD-1, CD133 + Sox9-EGFP + células normalmente representam ~ 4% de células pancreáticas no total, e essa população celular é enriquecido para PCFUs 7. Triagem dos CD133 + células / EGFP + Sox9 é descrito aqui.

  1. Corar as células dissociadas de pâncreas.
    1. Bloquear toda a suspensão de uma única célula pancreática para reduzir a ligação não específica através da incubação da suspensão de uma única célula com anti-rato de CD16 / 32 a 10 ug / ml de concentração final durante 5 min em gelo.
    2. Remove-se uma alíquota de 1 x 10 6 células (50 &# 181; l) para corar com o anticorpo de controlo do isotipo, IgG1 de rato conjugado com biotina a 5 ug / ml de concentração final, durante 20 min em gelo, agitando a cada 5-7 minutos.
    3. Remove-se uma alíquota de 1 x 10 6 células (50 uL) e manter em gelo como um controlo não corado.
    4. Manchar o restante das células com um anticorpo primário anti-rato conjugado com biotina CD133, a 5 ug / ml de concentração final, durante 20 min em gelo, agitando a cada 5-7 minutos.
  2. Células de lavagem.
    1. Lavar o controlo de isotipo e as amostras marcadas com o anticorpo primário por trazer o volume para 1 ml com PBS / BSA / ADNase I e centrifugar a 400 xg durante 5 min a 4 ° C. Repita este passo de lavagem.
    2. Ressuspender o controlo de isotipo e as amostras marcadas com o anticorpo primário em PBS / BSA / ADNase I, de modo que a concentração final é de 2 x 10 7 células / ml.
  3. Manchar o controlo do isotipo e amostras marcadas com o anticorpo primário com estreptavidina (STV) aloficocianina marcado com (APC) a 2 & #181; g / ml de concentração final. Incubar durante 15 min em gelo, agitando a cada 5-7 minutos.
  4. Lavar as células e ', 6-diamidino-2-fenilindole coloração 4 (DAPI).
    1. Lavar o controlo de isotipo e as amostras marcadas com o anticorpo primário por duas vezes com PBS / BSA / ADNase I, tal como no passo 2.2. Ressuspender as células em PBS / BSA / ADNase I com DAPI (0,2 ug / ml de concentração final). O volume final da amostra de controlo de isotipo deve ser de 0,5 ml.
      NOTA: Certifique-se que a densidade final da amostra manchada de anticorpo primário é apropriado para o classificador a ser utilizado. Uma concentração de 5 X 10 6 células / ml é utilizada rotineiramente para a classificação.
    2. Ajustar o volume das células não coradas para 0,5 ml com PBS / BSA / PS / ADNase I. Filtrar todas as células através de uma malha de 20 um antes da separação e manter as células em gelo, no escuro.
  5. Triagem de células.
    1. Use um de 80 mm ou maior do bocal para a classificação.
      NOTA: células endócrinas pancreáticas murino são propensas ao estresse físico. HoWever, PCFUs murino não parecem ser afetados pelo estresse causado pela passagem através de um classificador 7.
    2. Adquirem eventos celulares e parâmetros de análise no separador. Portão as células para a frente e áreas de dispersão lateral para excluir restos de células 7. Portão de dispersão frontal e lateral larguras de excluir dobletes celulares. Portão de excluir + células mortas DAPI 7. Escolha gating parâmetros para os sinais de EGFP e CD133-APC com base nos valores das células de controlo de isotipo (Figura 1).
    3. Recolher as células separadas em 5 ml de tubos de poliestireno que contêm 1,5 ml de meio DMEM / F12 suplementado com soro de vitelo fetal a 5% (FCS). Centrifugar as populações classificadas a 400 xg durante 5 min e ressuspender em um pequeno volume (~ 200 mL), quer de meio DMEM / F12 ou PBS / BSA / ADNase I suplementado com 5% de FCS. Manter as células em gelo até à sua utilização.
  6. Contar o número de células CD133 + Sox9-EGFP + obtidos a partir do classificador. Dê uma10 ul de amostra de células e contagem das células com um hemacitómetro para determinar a densidade celular.
    NOTA: O uso hemocitômetro é recomendado porque contagens de máquina do classificador são pouco confiáveis.

3. Placa as células classificadas para a colônia de ensaio contendo murino ECM Proteínas

NOTA: Por favor, consulte os protocolos detalhados para o chapeamento de células para o ensaio colónia contendo ECM murino em outra publicação JoVE 18.

  1. Prepare Meios de Cultura.
    1. Preparar um meio de cultura contendo meio DMEM / F12, 1% (p / v) de metilcelulose, 5% (v / v) proteínas de ECM de murino, 50% (v / v) de meio condicionado a partir de células pancreáticas como MESC-derivados, 5% (v / v) de FCS, 10 mmol / L de nicotinamida, 10 ng / ml de activina B recombinante humana, de 0,1 nmol / L de exendina-4, e 1 ng / ml de factor de crescimento endotelial vascular-A. Métodos para gerar o meio condicionado são detalhados em outros lugares 18.
    2. Adicionar 750 ng / mL de RSPO-1 ao meio deSe é desejada a formação de colónias densas.
    3. Incubar a cultura da proteína de murino ECM a 37 ° C e 5% de CO 2 durante 3 semanas.

4. Cultura das células classificadas em 1 celular por poço

NOTA: Os procedimentos a seguir aplicam-se a manipulação de células individuais usando a mão e boca pipetas. Uma abordagem alternativa é a compra de um micromanipulador. Um micromanipulador típico inclui um microscópio invertido com uma plataforma motorizada operada-joystick.

  1. Prepare vidro Pasteur Pipettes.
    1. Usando um bico de Bunsen, tirar a ponta de uma pipeta Pasteur de vidro para uma ponta fina (~ 30 mm na abertura). As pipetas de Pasteur de vidro devem ter uma rolha de algodão para criar uma barreira para o fluxo de ar a partir do operador.
    2. Autoclave as pipetas de Pasteur de vidro ardido a 121 ° C durante 20 min para a esterilização.
  2. Prepare placas de 96 poços para a Cultura.
    1. Prepare semi-sólida frio acordo meio de culturaing com o protocolo descrito anteriormente 18.
    2. Repartir o meio nas cavidades interiores de uma placa de 96 poços de fundo plano de ligação a partir de 100 ul / poço usando uma seringa de 1 ml. Encha as cavidades exteriores com água estéril para manter a humidade.
    3. Colocar a placa de cultura sobre gelo até à sua utilização.
  3. Prepare as células separadas.
    1. Adicionar ~ 6.000 células colhidas a partir de um classificador a 2,5 volume final ml de DMEM / F12 / PS contendo 10% de FCS e 1% de metilcelulose em um tubo de poliestireno de 5 ml. Agitar vigorosamente para misturar os componentes. Espera durante 5 min ou até que as bolhas flutuam para o topo do tubo. Este passo não necessita de ser realizada em gelo.
    2. Dispensar a solução de células para dois pratos de 35 mm a 1 mL / prato usando uma seringa de 1 ml com uma agulha de 18 G ½.
    3. Espalhe a solução de células no prato-o suavemente o prato com a mão. Não permitir que o meio semi-sólido para atingir a margem do prato de 35 mm, como as células individuais na margem do Cann bemot ser observado claramente usando um microscópio de luz invertida.
  4. Prepare a área de trabalho em torno de um microscópio.
    1. Adicione uma solução contendo DMEM / F-12 e 1% de metilcelulose sem quaisquer células (forma "não-célula '), e administrar a solução (tal como descrito em 4.3.2) em duas placas de Petri de 35 milímetros (1 ml por placa) .
    2. Limpo e limpe a área de trabalho em torno de um microscópio de contraste de fase invertida com uma solução de álcool 70%.
  5. Monte a pipeta com a parte de boca.
    1. Escolha uma pipeta Pasteur de vidro estéril que foi preparado no passo 4.1. Anexar a extremidade de uma ponta de pipeta de 1 ml de plástico para o topo da pipeta Pasteur de vidro. Anexar a extremidade mais pequena da ponta de pipeta de 1 ml de plástico a uma extremidade de um tubo de borracha de parede fina, e o bocal para a outra extremidade do tubo. Utilizar a mesma pipeta de vidro para retirar várias células do mesmo grupo.
    2. Elaborar, por sucção boca, um pequeno volume (~ 10 a 50 ul) do"Não-cell" solução semi-sólido feito na etapa 4.4.1 com a pipeta Pasteur de vidro.
      NOTA: A solução semi-sólida, na abertura estreita da pipeta de Pasteur de vidro cria resistência ao escoamento e proporciona uma barreira para evitar a contaminação das células a serem colhidos.
  6. Escolha uma única célula.
    1. Colocar a placa de 35 mm contendo as células separadas na platina do microscópio e remover a tampa.
    2. Encontrar as células utilizando uma lente da objectiva de 10X e foco numa célula adequada para ser retirado.
    3. Localizar e colocar a abertura da ponta da pipeta junto à célula de interesse. Aplicar sucção pela boca.
      NOTA: O movimento da célula deve ser muito lenta, de modo que não há risco de perda da célula durante o processo posterior. O movimento da célula de entrar na abertura da pipeta deve ser visível. Se o fluxo move-se demasiado rápido, mudar para uma pipeta com uma abertura mais estreita.
  7. Depositar a única célula em um poço Cultura.
    1. Uma vez que a célula está no pipeta, utilizar a língua para interromper o fluxo através do bloqueio da abertura da peça de boca. Pause brevemente antes de se retirar a ponta a partir do meio semi-sólido para assegurar que o meio semi-sólido parou de fluir.
    2. Colocar a ponta da pipeta a um poço na placa de 96 poços, preparado no passo 4.2. Empurre a pilha para fora lentamente soprando suavemente na peça de boca. Marcar o bem após a célula é depositado, a fim de evitar o plaqueamento duas células num poço.
  8. Certifique-se de que uma única célula é colocada em uma Bem Cultura.
    1. Coloque a ponta da pipeta na "não-cell 'meio preparado no passo 4.4.1. Ao observar a abertura da ponta sob o microscópio, empurrar para fora a solução semi-sólido remanescente. Esperar nenhuma célula a fluir para fora da ponta da pipeta.
    2. Para verificar novamente, encontrar a localização no poço cultura onde foi implantada a única célula.
  9. Cultura das células individuais a 37 ° C em 5% de CO 2 para cimaa 3 semanas.

5. Escolha Individual colônias de cultura semi-sólida para Análise Microfluidic qRT-PCR

NOTA: Três semanas após o plaqueamento classificados CD133 + células Sox9 / + EGFP para o ensaio de colónias contendo ECM murino, anel ou colónias densas são formadas 7 (Figura 2). Quando o Anel / colónias densas são dissociados em suspensão de células isoladas e re-plaqueadas em placas de cultura de hidrogel laminina, Endocrine colónias / acinares são gerados após aproximadamente uma semana 7 (Figura 2). Para determinar a composição de cada linhagem de colónias, análise de qRT-PCR de microfluidos é usado para detectar a expressão de marcadores de linhagem 7. Para o pré-amplificação, uma colônia é misturado numa mistura principal contendo uma mistura TaqMan sonda, tampão de reação e SuperScript III 21. O chip 48,48 matriz é posteriormente utilizado para reacções de PCR microfluídicos 21.

  1. Prepara-se o pré-amplificação por RCPmisture contendo 48 sondas.
    1. Pipetar 1,5 mL de cada sonda TaqMan (20x estoque) em um tubo de 1,5 ml. Adicionar 78 ul de tampão TE para ajustar o volume para 150 ul.
  2. Prepare a mistura principal, seguindo os protocolos do fabricante 21.
  3. Coloque 9 ul de mistura principal em cada 0,2 ml tubo de reacção de parede fina adequados para PCR, e repita essa etapa para até 48 tubos.
  4. Escolha colónias isoladas a partir da cultura semi-sólida.
    NOTA: anel / colônias densas são maiores do que as colónias Endócrino / acinares, com diâmetros variando de ~ 50 a 400 mm 9,11. Portanto, único anel / colônias densas são colhidos usando uma pipeta P10 equipado com uma ponta de pipeta 10 ul que são dobradas em uma forma curva. Para escolher o pequeno Endócrino / colônias acinares (Figura 2), consulte o passo 4.
    1. Localizar uma colônia de interesse sob alta ampliação (por exemplo, 20X lente objetiva), reduzir a ampliação e aspirate A colônia. (Opcional) Tome uma imagem de contraste de fase da colônia nesta etapa para documentar as características visíveis da colônia.
    2. Transferir a colônia dentro do tubo de PCR contendo 9 ul de mistura principal.
    3. Escolher o próximo colônia. Até 45 colônias no total podem ser analisadas por corrida PCR, deixando 3 pontos para controles.
  5. extracção de ARN e a síntese de ADNc com a pré-amplificação.
    1. Agitar as amostras vigorosamente antes de realizar a reacção térmica.
    2. Realizar as reacções de ciclos térmicos de acordo com as instruções do fabricante 21. Anel / colônias densas requerem 14 ciclos, colônias Endócrino / acinares exigem 16-20 ciclos, e as células individuais exigem 22 ciclos.
      NOTA: Pré-amplificação de ADNc pode ser armazenado a -20 ° C antes da análise por PCR de microfluidos.
  6. Executar reacções de PCR subsequentes, utilizando um chip de microfluidos, de acordo com as instruções do fabricante 21.
6. Whole Mount imunocoloração das Colónias

  1. Colheita e Fix Colonies.
    1. Pegar as colónias sob o microscópio, como nos passos 4 ou 5.4, e adicioná-los a uma solução de paraformaldeído a 4%. Incubar O / N a 4 ° C com agitação suave.
    2. Lavam-se as colónias com 1X PBS duas vezes durante 10-30 min à temperatura ambiente. Armazenar as colónias fixas, a 4 ° C em tubos de 1,5 ml selados com parafina.
  2. Manchar as colônias com anticorpos.
    1. colónias de transferência para uma cavidade de uma placa de 96 poços pretas com fundo claro contendo 200 ul de tampão de bloqueio (5% de burro e / ou soro de cabra, 0,1% de Triton X-100 em PBS 1x). Incubar O / N a 4 ° C com agitação suave.
    2. Dilui-se o anticorpo primário a uma concentração pré-determinada (por exemplo, 1: 500 para hamster anti-mucina um anticorpo) usando tampão de bloqueio. Transferir as colónias a um limpa bem com 200 uL de anticorpo primário, e incubar O / N a 4 ° C com agitação suave. Wash as colónias 3 vezes com PBS contendo 0,1% de Tween 20. Transferir as colónias em um novo poço com 200 ul de PBS 1x / Tween 20 a 0,1% durante 10 min à temperatura ambiente para cada lavagem.
    3. Dilui-se o anticorpo secundário a uma concentração pré-determinada (por exemplo, 1: 2000 para o anticorpo de hamster de cabra anti-arménio) usando tampão de bloqueio. Manter a solução no escuro. Transferir as colónias para limpar poços contendo 200 uL de anticorpo secundário, e incubar durante 2 horas à temperatura ambiente. Lavam-se as colónias 3 vezes com PBS / 0,1% de Tween 20, tal como no passo 6.2.2.
  3. colónias Counter-mancha com DAPI e visualizar com microscopia confocal.
    1. Transferir as colónias nos poços com PBS contendo 300 nM de DAPI e incubar durante 5 min à TA.
    2. Transferir as colónias DAPI coradas para uma placa de Petri com fundo de vidro 35 mm para visualização. Coloque uma lamela por cima das colónias para evitar a evaporação.
    3. Usar um microscópio confocal para capturar as imagens. Para visualizar DAPI staining, usar de dois fótons de excitação comprimento de onda de 730-950 nm. Use um laser de argônio com um comprimento de onda de 458 nm para excitar fluorocromos com comprimentos de onda de emissão de 519 e 561 nm. Use um laser de hélio-neon com um comprimento de onda de 633 nm para excitar fluorocromos com comprimentos de onda de emissão de 665 nm.

7. dissociar e Re-placa primária Anel / Dense Colonies em secundários Colony Ensaios

Nota: Todos os procedimentos devem ser realizados em condições estéreis. Evite choque frio para as células desse procedimento, tanto quanto possível, tais como colocar as células no gelo ou lavar as células com frio PBS / BSA. Tais práticas reduzem a viabilidade das células banhado a re.

  1. Prepare Solutions.
    1. tampão de lavagem pré-aquecido (DMEM / F12; P / S; 0,1% de BSA) num banho de água a 37 ° C.
    2. Pré-aquecer uma placa de 96 poços (fundo plano; fraca ligação) em uma temperatura de 37 ° C incubadora. Adicionam-se 100 ul 100% de FCS a uma cavidade da placa e uma solução de tripsina-EDTA a 100 uL de 0,25% para uma segundabem.
  2. Recolha Colonies.
    1. Escolher e reunir um total de 20 ou mais / anel de colônias densas em culturas primárias, utilizando pontas de pipeta 10 ml, como descrito no passo 5.4.
    2. Coloque as colónias em água morna (pelo menos RT) tampão de lavagem (~ 1000 mL) num tubo de 1,5 mL e centrifugação a 400 xg durante 5 min. Remover o sobrenadante.
  3. Dissociar as colônias em uma única célula suspensões utilizando tripsina.
    1. Transferir o volume restante (20 ul ou menos), que contém as colónias, para o poço que contém uma solução de tripsina quente (preparado em 7.1).
    2. Incubar a placa numa incubadora a 37 ° C (não um banho de água) durante 1,5 min. Remover a placa e pipetar as colónias algumas vezes. Incubar a 37 ° C durante mais 1,5 min.
    3. Retirar a placa e pipeta cima e para baixo mais algumas vezes para acabar com as colónias. Verifique sob o microscópio para ver se as colónias foram dispersos predominantemente em suspensão de uma única célula.Evitar o excesso de digestão das colônias.
  4. Parar a reacção de tripsina por adição de FCS.
    1. Transferir 100 ul de FCS a quente para o poço que contém as células. Pipeta cima e para baixo algumas vezes. Transferência das células em um tubo de 1,5 ml contendo 1.000 mL tampão de lavagem quente. Centrifugar a 400 xg durante 5 min à TA.
    2. Lavar duas vezes com tampão quente.
    3. Re-suspender as células em ~ 200 ul de tampão ou meio de cultura.
  5. Contar o número de células utilizando um hemacitómetro. Manter a suspensão de células à TA.
  6. Re-placa de células em ensaios de colónias secundárias que contêm tanto proteínas de ECM de murino (5% v / v) ou hidrogel laminina (100 ug / ml) e dissociada Incubar as células a 37 ° C com 5% de CO 2.
    NOTA: Para as células re-plaqueamento em proteínas ECM murinos, usar 2.500-5.000 células por poço e cultura durante 2-3 semanas. Para re-pantes na cultura hidrogel laminina, use 10,000-25,000 células por poço e cultura para 7-12 dias.

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Resultados

Células progenitoras pancreáticas mediana pode ser enriquecida por activadas por fluorescência de células (Figura 1). A linha de ratinhos transgénicos Sox9 / EGFP utilizado aqui foi gerado em primeiro lugar como um resultado do Projecto GENSAT Atlas Cerebral 19, e o repórter EGFP está sob o controlo de um cromossoma artificial bacteriano contendo ~ 75 kb a montante e ~ 150 kb sequências a jusante de Sox9 20 . Nestes ratinhos, EGFP etiquetas ductos p...

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Discussão

Os ensaios de colónias pancreáticas e colónia única análises descritas aqui foram inspirados pelos ensaios de colónias hematopoiéticas contendo metilcelulose que têm desempenhado papéis importantes em decifrar a biologia das células progenitoras hematopoiéticas nas últimas décadas 23. Nestes ensaios (Figura 5), dissociado células pancreáticas são plaqueadas em metilcelulose contendo meio de cultura semi-sólido com factores de crescimento apropriadas e proteínas da MEC que suportam a formação ...

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Divulgações

Os autores não têm nada para revelar.

Agradecimentos

Agradecemos Lucy Brown e Alexander Spalla da Analytical Citometria Núcleo at City of Hope para assistência na classificação. Este trabalho é apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) concede R01DK081587 e R01DK099734 para HTK e U01DK089533 de ADR, e pela National Science Foundation subvenção NSF-DMR-1206121 e California Institute for Regenerative Medicine RB5-07398 concessão para DAT Apoia do J. Instituto Joseph Jacobs para a engenharia molecular de Medicina da Caltech para DAT, e os da Fundação Oxnard e Ella Fitzgerald Fundação para HTK também são reconhecido agradecimento.

Financiamento: Este trabalho é apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) concede R01DK081587 e R01DK099734 para HTK e U01DK089533 para ADR e pelo Instituto Nacional Science Foundation subvenção NSF-DMR-1206121 e Medicina Regenerativa da Califórnia RB5-07398 subvenção para DAT Suporta do Joseph J. JacobsInstituto de Engenharia Molecular de Medicina da Caltech para DAT, e os da Fundação Oxnard e Ella Fitzgerald Fundação para HTK também estão reconhecido agradecimento. Pesquisa relatada nesta publicação incluiu o trabalho realizado no Analytical Citometria Core e Microscopia de Luz Digital Imaging Núcleo apoiado pelo National Cancer Institute dos Institutos Nacionais de Saúde com o número prêmio P30CA33572.

Patrocinador do estudo: O patrocinador não participou no desenho do estudo, coleta, análise ou interpretação dos dados.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Proteínas ECM murinas (Matrigel)Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA)354230Estoque mantido em -20 ° C
Hidrogel de lamininafornecido por David Tirrell (Pasadena, CA EUA)Estoque mantido em -20 ° C
MetilceluloseShinetsu Chemical (Tóquio, Japão)1.500 centipoise (unidade de viscosidade dinâmica igual a 15 g/cm/seg) (alta viscosidade)
Dulbecco's Phosphate-Buffered SalineMediatech (Manassas, VA, EUA)21-031-CV
Phosphate Buffered SalineGibco (Grand Island, NY, EUA)15070-063
Frasco cônico de frasco de 50 mlCorning Inc. (Corning, NY, EUA)352070
100 mm x 20 mm Placa de cultura em suspensãoCorning Inc. (Corning, NY, EUA)430591
Albumina de soro bovinoSigma (St. Louis, MO, EUA)A8412
Penicilina/estreptomicinaGibco (Grand Island, NY, EUA)15070-063
DNase1Calbiochem (Darmstadt, Alemanha)260913
Colagenase BRoche (CH-4070, Basel, Schweiz, Suíça)11088831001Estoque mantido em -20 ° C
Anti-camundongo CD16/32Biolegend (San Diego, CA, EUA)101310baixa endotoxina, livre de azida
PE-Cy7 Rato IgG2a κ Controle deIsotipo Biolegend (San Diego, CA, EUA)400522
Rato IgG1 κ ControleIsotipo eBioscience (San Diego, CA, EUA)13-4301-82
Anti-CD133-BiotinaeBioscience (San Diego, CA, EUA)13-1331-82
Anti-CD71-PE-Cy7Biolegend (San Diego, CA, EUA)113812
Estreptavidina-AloficocianinaBiolegend (San Diego, CA, EUA)405207
4 ', 6-Diamidino-2-fenilindolInvitrogen ( Waltham, MA,  EUA)3571Estoque mantido em -20 ° C
Anti-mucina 1Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA EUA)HM-1630-P1
Dylight 649 Hamster anti-armênio de cabraJackson Immuno (West Grove, PA, EUA)127-495-160
Meio de águia modificado de Dulbecco: Mistura de nutrientes F-12Mediatech (Manassas, VA, EUA)10-092-CV
tissure de soro bovino fetal(Long Beach, CA, EUA)101Estoque mantido em -20 ° C
Tris Ácido etilenodiaminotetracéticoTEKnova (Hollister, CA, EUA)T0221
Rneasy Micro KitQiagen (Venlo, Holanda)74004
Kit de Transcrição Reversa QuantiTecQiagen (Venlo, Holanda)205310
CellsDirect One-Step qRT-PCR KitAmbion/Invitrogen(Grand Island, NY, EUA)11753-100
ParaformaldeídoSanta Cruz Bio (Santa Cruz, CA, EUA)SC-281692
Soro de cabraJackson Immuno (West Grove, PA, EUA)005-000-121Estoque mantido em -20 ° C
Soro de burroJackson Immuno (West Grove, PA, EUA)0017-000-121Estoque mantido em -20 ° C
Triton X-100Sigma (St. Louis, MO, EUA)T9284
TripsinaSigma (St. Louis, MO, EUA)T-4799
Ácido etilenodiaminotetracéticoInvitrogen (Waltham, MA,  EUA)15575-020
Tripsina-EDTALife Technologies (Waltham, MA, EUA)25200-056
Água EstérilGibco (Grand Island, NY, EUA)15230-147Pipeta Pasteur de grau de biologia molecular
Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA)13-678-8B
40 μ m Malha de FiltroFisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA)08-771-1
70 μ m malha de filtroFisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA)08-771-2
TC Placa 96 Bem SuspensãoSarstedt83.3924 (Anteriormente 83.1835)
Seringa de 1 ccBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA)309659
Seringa de 10 ccBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA)301604
48.48 Dyanmic Array ChipFluidigm (San Francisco, CA, EUA)BMK-M-48.48
Fluidigm GE 48.48 Amostra de Matriz Dinâmica & Kit de Reagentes de Carregamento de EnsaioFluidigm (San Francisco, CA, EUA)85000800
TaqMan Universal PCR MasterMix Applied Biosystems (Grand Island, NY, EUA)4304437
Monolaurato de polietilenoglicol sorbitanoSigma (St. Louis, MO, EUA)P7949
Prato com fundo de vidroMatTek (Ashland, MA, EUA)P35G-1.5-14-C Placa dePetri de 35 mm com fundo de vidro
Bocal/Tubo de BorrachaRenova Life Inc. (College Park, MD, EUA)MP-SET
NicotinamidaSigma (St. Louis, MO, EUA)N0636Estoque mantido em -20 ° C
Fator de Crescimento Endotelial VascularR& D Systems (Minneapolis, MN, EUA)293-VEEstoque mantido em -80 &# 176; C
Activin BR& D Systems (Minneapolis, MN, EUA)659-ABEstoque mantido em -80 &# 176; C
Extendin 4Sigma (St. Louis, MO, EUA)E7144Estoque mantido em -20 ° C
Rspondin-1R & D Systems (Minneapolis, MN, EUA)3474-RSEstoque mantido em -80 &# 176; C
Falcon 5 ml Tubo de Fundo Redondo de PoliestirenoCorning Inc. (Corning, NY, EUA)352054
Agulha PrecisionGlide 18 G x1 1/2Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA)305196
Agulha PrecisionGlide 16 G x 1 1/2Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA)305198
Superfície de Fixação Ultra-Baixa Costar Placa de fundo plano de 24 poços Corning Inc. (Corning, NY, EUA)3473
Costar 96 Placa de Poço PretoCorning Inc. (Corning, NY, EUA)3603Fundo plano e transparente com tampa.  Microplacas de poliestireno preto tratadas com TC
Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Microscópio InvertidoCarl Zeiss AG (Oberkochen, Alemanha)
Biomark HD Fluidigm (São Francisco, CA, EUA)
Classificador de células de produtos de pesquisa de pedidos especiais AriaBecton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA)
PBS/BSA1x PBS
0,1% (m/vol) BSA
PenStrep (49 Unidades/ml Penicilina, 49 μ g/ml Estreptomicina)
PBS/BSA/Dnase11x PBS
0,1% (m/vol) BSA
PenStrep (49 Unidades/ml Penicilina, 49 μ g/ml de estreptomicina)
Dnase 1 (2.400 unidades/ml por pâncreas)
de Produtos biológicos de cultura de

Referências

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