Em ensaios de colónias in vitro para a detecção de auto-renovação e diferenciação de células progenitoras isoladas a partir de pâncreas de murino adulto são concebidos. Nestes ensaios, progenitores pancreáticas dar origem a colónias de células no espaço 3-dimensional em meio semi-sólido contendo metilcelulose. Protocolos para a manipulação de células individuais e caracterização de colónias individuais são descritos.
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Artigo de método
In Vitro Colony Os ensaios para a caracterização de células progenitoras Tri-potentes Isolado das adultas murino Pâncreas
* These authors contributed equally
Neste artigo
Resumo
Resumo
Stem e células progenitoras do pâncreas adultos poderia ser uma fonte potencial de células beta como terapêuticos para o tratamento de pacientes com diabetes do tipo 1. No entanto, ainda é desconhecido se existem células estaminais e progenitoras no pâncreas adulto. estratégias de pesquisa usando cre-lox linhagem-tracing em ratos adultos têm rendido resultados que apoiar ou refutar a ideia de que as células beta podem ser gerados a partir dos dutos, a localização presumida quando adultas progenitoras pancreáticas podem residir. Estes métodos de rastreamento de linhagem in vivo cre-lox, no entanto, não pode responder às perguntas de auto-renovação e multi-linhagem de diferenciação e dois critérios necessários para definir uma célula-tronco. Para começar a abordar esta lacuna técnica, eu inventei ensaios de colónias 3-dimensionais para progenitores pancreáticas. Logo após a publicação inicial, outros laboratórios desenvolveram independentemente um semelhante, mas não idêntico, método chamado o ensaio organ�de. Em comparação com o ensaio de organ�de, o nosso método empregametilcelulose, que forma soluções viscosas que permitem a inclusão de proteínas de matriz extracelular em baixas concentrações. Os ensaios de metilcelulose contendo permitir a detecção e análise das células progenitoras para o nível de uma única célula, que são críticos quando progenitoras constituem uma pequena sub-população mais fácil, como é o caso de muitas células estaminais adultas de órgãos. Juntos, os resultados de vários laboratórios demonstrar in vitro de auto-renovação e multi-linhagem diferenciação de células progenitoras semelhante pancreáticas de ratos. Os protocolos atuais descrevem dois ensaios de colónias à base de metilcelulose para caracterizar progenitores rato pancreáticas; um contém uma preparação comercial de proteínas da matriz extracelular de murino e o outro uma proteína da matriz extracelular artificial conhecido como um hidrogel laminina. As técnicas aqui descritas são: 1) dissociação do pâncreas e triagem de CD133 + Sox9 / eGFP + ductais de ratos adultos, 2) manipulação de uma única célula das scélulas orted, 3) analisa única colônia usando 4) dissociação de colónias primárias em uma única célula suspensões e re-plaqueamento microfluídico qRT-PCR e montagem-toda a imunocoloração, e em ensaios de colónias secundárias para avaliar a auto-renovação ou diferenciação.
Introdução
O pâncreas é composto por três grandes linhagens celulares; células acinares secretam enzimas digestivas, dutos segregam mucina para se defender de agentes patogénicos e transportar enzimas digestivas para o intestino, e células endócrinas secretam hormônios, incluindo a insulina e glucagon, que mantêm a homeostase da glicose. Durante o desenvolvimento embrionário do pâncreas, as células ductais primeiros são a fonte das células progenitoras tri-potentes, capazes de dar origem às três linhagens no pâncreas dos animais adultos 1,2. Como as células estaminais e progenitoras adultas, tais como células estaminais da medula óssea, são já utilizados com sucesso ....
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Protocolo
Declaração de Ética: Nós aderir aos padrões éticos amplamente aceitas na realização de pesquisas para garantir a qualidade ea integridade dos resultados. A experimentação animal é conduzido de acordo com protocolos aprovados pelo Institutional Animal Care e do Comitê Use da City of Hope.
1. Prepare suspensão de célula individual desde Adulto Murino pancreata
NOTA: Em publicações anteriores 7,11, foram utilizados ratos CD-1 ou fundo B6; ambos os fundos obtiveram resultados semelhantes. Uma linha de rato transgénico (designado Sox9 / EGFP) com reforçada proteína verde fluorescente conduzido por Sox9 loci 19,20, foi criado no CD-1 de ....
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Resultados
Células progenitoras pancreáticas mediana pode ser enriquecida por activadas por fluorescência de células (Figura 1). A linha de ratinhos transgénicos Sox9 / EGFP utilizado aqui foi gerado em primeiro lugar como um resultado do Projecto GENSAT Atlas Cerebral 19, e o repórter EGFP está sob o controlo de um cromossoma artificial bacteriano contendo ~ 75 kb a montante e ~ 150 kb sequências a jusante de Sox9 20 . Nestes ratinhos, EGFP etiquetas ductos p.......
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Discussão
Os ensaios de colónias pancreáticas e colónia única análises descritas aqui foram inspirados pelos ensaios de colónias hematopoiéticas contendo metilcelulose que têm desempenhado papéis importantes em decifrar a biologia das células progenitoras hematopoiéticas nas últimas décadas 23. Nestes ensaios (Figura 5), dissociado células pancreáticas são plaqueadas em metilcelulose contendo meio de cultura semi-sólido com factores de crescimento apropriadas e proteínas da MEC que suportam a formação .......
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Divulgações
Os autores não têm nada para revelar.
Agradecimentos
Agradecemos Lucy Brown e Alexander Spalla da Analytical Citometria Núcleo at City of Hope para assistência na classificação. Este trabalho é apoiado em parte pelo National Institutes of Health (NIH) concede R01DK081587 e R01DK099734 para HTK e U01DK089533 de ADR, e pela National Science Foundation subvenção NSF-DMR-1206121 e California Institute for Regenerative Medicine RB5-07398 concessão para DAT Apoia do J. Instituto Joseph Jacobs para a engenharia molecular de Medicina da Caltech para DAT, e os da Fundação Oxnard e Ella Fitzgerald Fundação para HTK também são reconhecido agradecimento.
Financiamento: Este trabalho é ....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Proteínas ECM murinas (Matrigel) | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA) | 354230 | Estoque mantido em -20 ° C |
| Hidrogel de laminina | fornecido por David Tirrell (Pasadena, CA EUA) | Estoque mantido em -20 ° C | |
| Metilcelulose | Shinetsu Chemical (Tóquio, Japão) | 1.500 centipoise (unidade de viscosidade dinâmica igual a 15 g/cm/seg) (alta viscosidade) | |
| Dulbecco's Phosphate-Buffered Saline | Mediatech (Manassas, VA, EUA) | 21-031-CV | |
| Phosphate Buffered Saline | Gibco (Grand Island, NY, EUA) | 15070-063 | |
| Frasco cônico de frasco de 50 ml | Corning Inc. (Corning, NY, EUA) | 352070 | |
| 100 mm x 20 mm Placa de cultura em suspensão | Corning Inc. (Corning, NY, EUA) | 430591 | |
| Albumina de soro bovino | Sigma (St. Louis, MO, EUA) | A8412 | |
| Penicilina/estreptomicina | Gibco (Grand Island, NY, EUA) | 15070-063 | |
| DNase1 | Calbiochem (Darmstadt, Alemanha) | 260913 | |
| Colagenase B | Roche (CH-4070, Basel, Schweiz, Suíça) | 11088831001 | Estoque mantido em -20 ° C |
| Anti-camundongo CD16/32 | Biolegend (San Diego, CA, EUA) | 101310 | baixa endotoxina, livre de azida |
| PE-Cy7 Rato IgG2a κ Controle de | Isotipo Biolegend (San Diego, CA, EUA) | 400522 | |
| Rato IgG1 κ Controle | Isotipo eBioscience (San Diego, CA, EUA) | 13-4301-82 | |
| Anti-CD133-Biotina | eBioscience (San Diego, CA, EUA) | 13-1331-82 | |
| Anti-CD71-PE-Cy7 | Biolegend (San Diego, CA, EUA) | 113812 | |
| Estreptavidina-Aloficocianina | Biolegend (San Diego, CA, EUA) | 405207 | |
| 4 ', 6-Diamidino-2-fenilindol | Invitrogen ( Waltham, MA, EUA) | 3571 | Estoque mantido em -20 ° C |
| Anti-mucina 1 | Thermo Fisher Scientific (Waltham, MA EUA) | HM-1630-P1 | |
| Dylight 649 Hamster anti-armênio de cabra | Jackson Immuno (West Grove, PA, EUA) | 127-495-160 | |
| Meio de águia modificado de Dulbecco: Mistura de nutrientes F-12 | Mediatech (Manassas, VA, EUA) | 10-092-CV | |
| tissure de soro bovino fetal | (Long Beach, CA, EUA) | 101 | Estoque mantido em -20 ° C |
| Tris Ácido etilenodiaminotetracético | TEKnova (Hollister, CA, EUA) | T0221 | |
| Rneasy Micro Kit | Qiagen (Venlo, Holanda) | 74004 | |
| Kit de Transcrição Reversa QuantiTec | Qiagen (Venlo, Holanda) | 205310 | |
| CellsDirect One-Step qRT-PCR Kit | Ambion/Invitrogen(Grand Island, NY, EUA) | 11753-100 | |
| Paraformaldeído | Santa Cruz Bio (Santa Cruz, CA, EUA) | SC-281692 | |
| Soro de cabra | Jackson Immuno (West Grove, PA, EUA) | 005-000-121 | Estoque mantido em -20 ° C |
| Soro de burro | Jackson Immuno (West Grove, PA, EUA) | 0017-000-121 | Estoque mantido em -20 ° C |
| Triton X-100 | Sigma (St. Louis, MO, EUA) | T9284 | |
| Tripsina | Sigma (St. Louis, MO, EUA) | T-4799 | |
| Ácido etilenodiaminotetracético | Invitrogen (Waltham, MA, EUA) | 15575-020 | |
| Tripsina-EDTA | Life Technologies (Waltham, MA, EUA) | 25200-056 | |
| Água Estéril | Gibco (Grand Island, NY, EUA) | 15230-147 | Pipeta Pasteur de grau de biologia molecular |
| Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA) | 13-678-8B | ||
| 40 μ m Malha de Filtro | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA) | 08-771-1 | |
| 70 μ m malha de filtro | Fisher Scientific (Pittsburgh, PA, EUA) | 08-771-2 | |
| TC Placa 96 Bem Suspensão | Sarstedt | 83.3924 (Anteriormente 83.1835) | |
| Seringa de 1 cc | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA) | 309659 | |
| Seringa de 10 cc | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA) | 301604 | |
| 48.48 Dyanmic Array Chip | Fluidigm (San Francisco, CA, EUA) | BMK-M-48.48 | |
| Fluidigm GE 48.48 Amostra de Matriz Dinâmica & Kit de Reagentes de Carregamento de Ensaio | Fluidigm (San Francisco, CA, EUA) | 85000800 | |
| TaqMan Universal PCR Master | Mix Applied Biosystems (Grand Island, NY, EUA) | 4304437 | |
| Monolaurato de polietilenoglicol sorbitano | Sigma (St. Louis, MO, EUA) | P7949 | |
| Prato com fundo de vidro | MatTek (Ashland, MA, EUA) | P35G-1.5-14-C Placa de | Petri de 35 mm com fundo de vidro |
| Bocal/Tubo de Borracha | Renova Life Inc. (College Park, MD, EUA) | MP-SET | |
| Nicotinamida | Sigma (St. Louis, MO, EUA) | N0636 | Estoque mantido em -20 ° C |
| Fator de Crescimento Endotelial Vascular | R& D Systems (Minneapolis, MN, EUA) | 293-VE | Estoque mantido em -80 &# 176; C |
| Activin B | R& D Systems (Minneapolis, MN, EUA) | 659-AB | Estoque mantido em -80 &# 176; C |
| Extendin 4 | Sigma (St. Louis, MO, EUA) | E7144 | Estoque mantido em -20 ° C |
| Rspondin-1 | R & D Systems (Minneapolis, MN, EUA) | 3474-RS | Estoque mantido em -80 &# 176; C |
| Falcon 5 ml Tubo de Fundo Redondo de Poliestireno | Corning Inc. (Corning, NY, EUA) | 352054 | |
| Agulha PrecisionGlide 18 G x1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA) | 305196 | |
| Agulha PrecisionGlide 16 G x 1 1/2 | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA) | 305198 | |
| Superfície de Fixação Ultra-Baixa Costar Placa de fundo plano de 24 poços | Corning Inc. (Corning, NY, EUA) | 3473 | |
| Costar 96 Placa de Poço Preto | Corning Inc. (Corning, NY, EUA) | 3603 | Fundo plano e transparente com tampa. Microplacas de poliestireno preto tratadas com TC |
| Zeiss LSM510 META NLO Axiovert 200M Microscópio Invertido | Carl Zeiss AG (Oberkochen, Alemanha) | ||
| Biomark HD | Fluidigm (São Francisco, CA, EUA) | ||
| Classificador de células de produtos de pesquisa de pedidos especiais Aria | Becton Dickson (Franklin Lakes, NJ, EUA) | ||
| PBS/BSA | 1x PBS 0,1% (m/vol) BSA PenStrep (49 Unidades/ml Penicilina, 49 μ g/ml Estreptomicina) | ||
| PBS/BSA/Dnase1 | 1x PBS 0,1% (m/vol) BSA PenStrep (49 Unidades/ml Penicilina, 49 μ g/ml de estreptomicina) Dnase 1 (2.400 unidades/ml por pâncreas) |
Referências
- Gu, G., Brown, J. R., Melton, D. A. Direct lineage tracing reveals the ontogeny of pancreatic cell fates during mouse embryogenesis. Mech Dev. 120, 35-43 (2003).
- Kopp, J. L., et al.
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Reimpressões e permissões
