Este protocolo eficiente dirige rato estaminais embrionárias endoderme definitivo de células-derivadas para amadurecer as células epiteliais das vias respiratórias. Esta técnica utiliza a diferenciação 3-dimensionais andaimes pulmonares descelularizados para dirigir especificação das linhagens celulares de pulmão, em, uma configuração de cultura isento de soro definido.
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Artigo de método
Geração de células de camundongo Airway epiteliais derivados de ESC Usando descelularizado Lung Scaffolds
Neste artigo
Resumo
Resumo
Pulmão diferenciação linhagem requer integração de sinais ambientais complexos que incluem o factor de crescimento de sinalização, as interacções célula-célula e as interacções célula-matriz. Devido a esta complexidade, recapitulação de desenvolvimento do pulmão in vitro para promover a diferenciação de células estaminais para as células epiteliais do pulmão tem sido um desafio. Neste protocolo, andaimes pulmonares descelularizados são utilizados para imitar o ambiente de 3-dimensional do pulmão e gerar células epiteliais das vias aéreas derivadas de células estaminais. células-tronco embrionárias de rato são primeiro diferenciado à linhagem endoderme usando um método de cultura corporal embryoid (EB) com células da endoderme activina A. são então semeadas em andaimes descelularizados e cultivadas a interface ar-líquido por até 21 dias. Esta técnica promove a diferenciação de células semeadas para as células epiteliais das vias aéreas funcional (células ciliadas, células do clube, e células basais) sem suplementação adicional de fator de crescimento. Esta configuração cultura é definida, seru-M livre, barato e reprodutível. Embora não haja contaminação limitado de linhagens endoderme não-pulmonares na cultura, este protocolo só gera populações epiteliais das vias aéreas e não dá origem a células epiteliais alveolares. epitélios das vias aéreas gerados com este protocolo pode ser utilizado para estudar as interacções célula-matriz durante a organogénese de pulmão e para modelar doenças ou plataformas de drogas de descoberta de patologias relacionadas com o das vias respiratórias, tais como a fibrose cística.
Introdução
Dirigido a diferenciação de células pluripotentes para a linhagem de pulmão é dependente de eventos de sinalização precisos no microambiente 1,2. Devido à natureza dinâmica deste processo tem sido um desafio para mimetizar os acontecimentos precisos de organogénese do pulmão in vitro. Relatórios recentes têm utilizado estratégias de restrição de linhagem passo a passo com a suplementação de culturas bidimensionais factor de crescimento solúvel para alcançar a diferenciação pulmonar 3-8. Nos protocolos de diferenciação passo a passo, as células pluripotentes, se as células-tronco embrionárias (ESC) ou células-tronco pluripotentes induzid....
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Protocolo
Experimentos em animais foram realizados de acordo com as diretrizes do Comitê Animal Care do Hospital para Crianças Doentes Research Institute.
1. Andaime Preparação
- Decelularização dos pulmões
- Euthanize ratos Wistar adultos usando CO 2 câmara. Coloque o animal na câmara e começar a 100% de exposição de CO 2 a uma velocidade de enchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto.
- Observe animal para a inconsciência; isto irá ocorrer após cerca de 2-3 min. Se inconsciência não ocorre neste período de tempo, verificar a taxa e vedação da câmara preencher. Na sequência de inconsciência, observe animal para a co....
- Euthanize ratos Wistar adultos usando CO 2 câmara. Coloque o animal na câmara e começar a 100% de exposição de CO 2 a uma velocidade de enchimento de 10-30% do volume da câmara por minuto.
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Resultados
Conforme descrito neste protocolo, a diferenciação robusto de endoderme definitiva para amadurecer das vias aéreas células epiteliais podem ser alcançados com a cultura prolongada de células semeadas em seções de andaime de pulmão descelularizados. Recomenda-se que andaimes descelularizados ser caracterizado para garantir (1) células hospedeiras são completamente removidos, e (2) as proteínas da matriz extracelular são preservadas antes de utilizar andaimes para a diferenciação. Descelul.......
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Discussão
O protocolo aqui descrito gera epitélio das vias aéreas ESC-derivado maduros usando apenas andaimes naturais pulmonares à diferenciação com nenhuma outra suplementação dirigir. Esta configuração é definida cultura,, barato e reprodutível isento de soro. Nenhuma suplementação do factor de crescimento dos meios de diferenciação base é necessária. Métodos publicados anteriormente para a geração de células epiteliais do pulmão derivadas de células-tronco têm usado estratégias de 2-dimensional com a suplementação do fator de.......
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Divulgações
Não há concorrentes interesses financeiros a declarar.
Agradecimentos
Queremos agradecer Dr. Rossant e Dr. Bilodeau para o ESC mCherry NKX2-1 usados em experimentos descritos nas Figuras 1-3. FACS foi realizada na instalação SickKids-UHN Citometria de Fluxo. Este trabalho foi financiado por subvenções de funcionamento dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde e uma subvenção de infra-estrutura (CSCCD) da Fundação Canadense de Inovação.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| ReagentesSolução de | |||
| perfusão | Sigma | H0777 | 10 U/ml heparina |
| Solução de perfusão | Gibco | 14170112 | dissolvida na solução salina balanceada Hank's (HBSS-) |
| Solução de descelularização | BioShop | CHA003 | 8 Solução de descelularização mM CHAPS |
| Sigma | E9884 | 25 Solução de descelularização mM EDTA | |
| BioShop | SOD002 | 1 M NaCl | |
| Solução de descelularização | Gibco | 14190-144 | dissolvido em PBS |
| Benzonase nuclease | Novagen | 70664-3 | 90 U/ml Benzonase nuclease |
| Benzonase nuclease | Gibco | 14190-144 | diluída em |
| solução antimicrobiana PBS | Gibco | 15140 | 200 U/ml de penicilina estreptomicina |
| Solução antimicrobiana | Gibco | 15290 | 25 μ g/ml de anfotericina B |
| Solução antimicrobiana | Gibco | 14190-144 | diluído em |
| tripsinização PBS | Gibco | 12605-028 | TrypLE |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Gibco | IMDM 2440-053, F12 11765-054 | Proporção de 3:1 de IMDM e Ham' s meio F12 modificado |
| Meios de diferenciação livres de soro (SFDM) | Suplemento Gibco | 12587-010 | B27 (diluição de 50x) |
| Meio de diferenciação livre de soro (SFDM) | Gibco | 17502-048 | (diluição de 100x) |
| Meio de diferenciação livre de soro (SFDM) | Gibco | 15260-037 | 0,05% (fração V) albumina de soro |
| Meios de diferenciação livre de soro (SFDM) | Gibco | 35050-061 | 200 mM Glutamax |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | M6145 | 4 μ M monotioglicerol |
| Serum free differentiation media (SFDM) | Sigma | A4403 | 0,05 mg/ml de ácido ascobico |
| Indução de endoderme | R& D | 338-AC/CF | Activin A |
| Anticorpos | |||
| CDH1 | BD Biosciences | 610181 | Camundongo, não conjugado, 1:100 |
| C-KIT | BD Biosciences | 558163 | Rato, PE-Cy7, 1:100 |
| CXCR4 | BD Biosciences | 558644 | Rato, APC, 1:100 |
| KRT5 | Abcam | ab24647 | Coelho, não conjugado, 1:1.000 |
| NKX2-1 | Abcam | ab76013 | Coelho, não conjugado, 1:200 |
| Laminin | Novus Biologicals | NB300-144 | Coelho, não conjugado, 1:200 |
| SCGB1A1 | Santa Cruz | sc-9772 | Cabra, não conjugada, 1:1.000 |
| SOX2 | R& D Systems | AF2018 | Cabra, não conjugada, 1:400 |
| TRP63 | Santa Cruz | sc-8431 | Mouse, não conjugado, 1:200 |
| TUBB4A | BioGenex | MU178-UC | Mouse, não conjugado, 1:500 |
| Goat IgG | Invitrogen | A-11055 | Burro, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-21202 | Burro, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Mouse IgG | Invitrogen | A-31571 | Burro, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Coelho IgG | Invitrogen | A-21206 | Burro, Alexa Fluor 488, 1:200 |
| Coelho IgG | Invitrogen | A-31573 | Burro, Alexa Fluor 647, 1:200 |
| Outros Materiais | |||
| Placas de baixa aderência | Nunc | Z721050 | Placas de ligação celular baixa, 6 poços |
| Membranas de interface ar-líquido | Whatman | 110614 | membrana de nucleóporo hidrofóbico, 8 μ m tamanho de poro |
| Vibratome | Leica | VT1200S | Leica Vibratome |
| Adesivo de tecido | Ted Pella | 10033 | Adesivo de tecido Pelco |
Referências
- Discher, D. E., Mooney, D. J., Zandstra, P. W. Growth Factors, Matrices, and Forces Combine and Control Stem Cells. Science. 324 (5935), 1673-1677 (2009).
- Daley, W. P., Peters, S. B., Larsen, M. Extracellular matrix dynamics in development and regenerative medicine. J. Cell....
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Reimpressões e permissões
