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Artigo de método

Geração de mídia e aplicativos Organ-condicionado para o Estudo Influências específicas do órgão em cancro da mama metastático Comportamento

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DOI:

10.3791/54037

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13 de junho de 2016

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1London Regional Cancer Program, London Health Sciences Centre, 2Department of Anatomy & Cell Biology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 3Department of Biochemistry, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 4Department of Oncology, Schulich School of Medicine & Dentistry, Western University, 5Lawson Health Research Institute

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Este manuscrito descreve um sistema modelo ex vivo composto de meios condicionados por órgãos derivados do linfonodo, osso, pulmão e cérebro de camundongos. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e estudar fatores solúveis derivados de órgãos e seus efeitos no tropismo de órgãos e no comportamento metastático das células cancerígenas.

Resumo

O câncer de mama metastatiza preferencialmente para linfonodos, ossos, pulmão, cérebro e fígado em pacientes com câncer de mama. Esforços de pesquisa anteriores se concentraram na identificação de fatores inerentes às células de câncer de mama que são responsáveis por esse padrão metastático observado (denominado tropismo de órgãos), no entanto, muito menos se sabe sobre os fatores presentes em órgãos específicos que contribuem para esse processo. Isso se deve em parte à falta de sistemas de modelos in vitro que recapitulem com precisão o microambiente do órgão. Para resolver isso, foi estabelecido um sistema modelo ex vivo que permite o estudo de fatores solúveis presentes em diferentes microambientes de órgãos. Este modelo consiste na geração de meios condicionados a partir de órgãos (linfonodos, ossos, pulmão e cérebro) isolados de camundongos nus atímicos normais. O sistema modelo foi validado demonstrando que diferentes linhagens celulares de câncer de mama exibem comportamento maligno específico de linhagem celular e específico de órgão em resposta a meios condicionados por órgãos que correspondem ao seu potencial metastático in vivo. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e avaliar fatores solúveis derivados de órgãos específicos que podem desempenhar um papel no comportamento metastático da mama e de outros tipos de células cancerígenas, incluindo influências no crescimento, migração, comportamento semelhante ao tronco e expressão gênica, bem como a identificação de potenciais novos alvos terapêuticos para o câncer. Este é o primeiro sistema modelo ex vivo que pode ser usado para estudar o comportamento metastático específico de órgãos em detalhes e avaliar o papel de fatores solúveis derivados de órgãos específicos na condução do processo de metástase do câncer.

Introdução

O câncer de mama é o câncer mais freqüentemente diagnosticado em mulheres ea segunda principal causa de mortes relacionadas ao câncer 1. alta taxa de mortalidade do câncer de mama é principalmente devido à falha da terapia convencional para reduzir e eliminar a doença metastática; aproximadamente 90% das mortes relacionadas ao câncer é atribuída a metástases 2. A compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes da cascata metastática é fundamental para o desenvolvimento de terapias eficazes, tanto precoce e cancro da mama de fase tardia.

A pesquisa passada ajudou a elucidar a natureza de várias etapas de metástase do câncer de mama e é a hipótese de que o resultado de ambos progressão e metástase do câncer é em grande parte dependente das interações entre células cancerosas e o ambiente host 3. As observações clinicas indicam que muitos cancros mostrar tropismo de órgãos, isto é., A tendência para metastizar preferencialmente a organs.In específica do CASe de cancro da mama, doença de um paciente geralmente se espalha ou metástases para 5 locais principais, incluindo o osso, pulmões, nódulo linfático, fígado, cérebro e 06/04. Muitas teorias têm sido desenvolvidas para explicar esse processo, mas apenas alguns têm resistido ao teste do tempo. A teoria de Ewing de metástase, proposto na década de 1920, a hipótese de thatthe de distribuição de metástase era estritamente devido a fatores mecânicos; pelo qual as células de tumor são realizadas por todo o corpo por padrões de fluxo sanguíneo fisiológico definidos normais e simplesmente prender no primeiro leito capilar encontram 7. Em contraste, a "semente e solo" hipótese de Stephen Paget 1889 sugeriu que as interações moleculares adicionais foram responsáveis ​​pela sobrevivência e crescimento de metástases, através do qual as células cancerosas ( "sementes") só pode estabelecer-se e microambientes órgãos proliferatein que produzem factores moleculares apropriados ( "solo ") 8. Quase um século depois, Leonard Weiss sobtomou uma meta-análise dos dados da autópsia confirmou anteriormente publicados e predição de Ewing que muitos tumores metastáticos detectados na altura da necropsia foram encontrados nas proporções esperadas, que seria de esperar se o tropismo órgão metastática foi determinada por padrões de fluxo sanguíneo sozinho. No entanto, em manyinstances havia menos ou mais metástases formadas em certos locais, então seria de esperar por um projecto de factores mecânicos de Ewing 9. Estas contas e teorias sugerem que microambientes de órgãos específicos desempenham um papel fundamental nos padrões de divulgação e subsequente crescimento e sobrevivência de muitos tipos de câncer, incluindo câncer de mama.

Os esforços de investigação anteriores têm focado principalmente em fatores derivados de células do tumor e sua contribuição para o tropismo órgão observado na metástase do câncer de mama 10-12, fatores no entanto pouca pesquisa tem explorado derivados do microambiente órgão que pode fornecer um nicho favorável para o estabelecimentode metástases de cancro da mama. Esta é em grande parte atribuível aos desafios técnicos de estudar os componentes do microambiente do órgão in vitro.

O presente artigo descreve um sistema abrangente vivo ex modelo para estudar a influência dos componentes solúveis do nó de linfa, osso, pulmão, cérebro e no comportamento metastático de células de cancro da mama humano. Estudos anteriores validaram este sistema de modelo, demonstrando que as linhas celulares de cancro da mama diferentes exibir comportamento maligno específica de órgãos-específico da linha de células e em resposta a meio condicionado de órgãos que corresponde ao seu potencial metastático in vivo 13. Este sistema modelo pode ser usado para identificar e avaliar os factores solúveis derivados de órgãos específicos que podem desempenhar um papel no comportamento metastático da mama e outros tipos de células cancerosas, incluindo influências sobre o crescimento, a migração, caule-como o comportamento, e a expressão do gene, , bem como a identificação depotenciais novos alvos terapêuticos para o cancro. Este é o primeiro sistema ex vivo modelo que pode ser utilizado para estudar o comportamento metastático específico do órgão em pormenor e para avaliar o papel de factores solúveis derivados de órgãos na condução do processo de metástase do cancro.

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Protocolo

Todos os estudos com animais foram conduzidos de acordo com as recomendações do Canadian Council on Animal Care, no âmbito de protocolos aprovados pelo Uso de Animais Subcomissão Western University.

1. Isolamento de órgãos (pulmão, cérebro, ossos, gânglios linfáticos)

  1. Prepare quatro tubos de 50 ml estéreis cónicos (um para cada órgão a ser isolado) contendo aproximadamente 30 ml de solução salina tamponada com fosfato estéril (PBS). Pré-pesam cada tubo de PBS utilizando uma balança eletrônica.
  2. Eutanásia 6-12 semana rato velho por inalação de CO 2. Os ratos devem ser deixada na câmara de CO 2, durante cerca de 1 - 2 minutos ou até que o rato para de se mover e de respiração. eutanásia bem sucedida pode ser ainda confirmada pela falta de batimentos cardíacos quando verificados manualmente com um dedo. Evite deslocamento cervical como este método pode romper vasos sanguíneos do pescoço levando a dificuldade em retirar os gânglios linfáticos axilares.
    Nota: Os trabalhos anteriores usado especificamenteratinhos nus femininos saudáveis, Hsd: atímicos Nude- Foxn1 nu 13.
  3. Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, coloque o mouse sobre as suas costas em uma almofada de espuma de poliestireno, espalhar os membros e usar pinos para mantê-los no lugar.
  4. Utilizando uma pinça e tesouras estéreis, cortar a pele abdominal na linha média na genitália e cortar para cima em direção à boca. Gentilmente puxar para trás a pele abdominal dos músculos abdominais e pinos no local no bloco de espuma de poliestireno.
  5. Localize a axilar, braquial, e linfonodos inguinais.
    Nota: Os linfonodos são geralmente rodeado por tecido adiposo. Os nódulos linfáticos inguinais são os mais fáceis de localizar como eles são encontrados superficialmente na junção de dois vasos sanguíneos na pele abdominal puxado para trás. Axilares e linfáticos braquial nós estão localizados mais profundamente no tecido e exigem manobras suave de tecido.
    1. Depois de ter localizado os gânglios linfáticos, use a tesoura para cortar suavemente e com cuidado a linfa nãodes longe da pele, a gordura e os vasos e removê-los do rato. Para confirmar dissecção adequada, rolar a pinça sobre o tecido removido. Se um nódulo duro existe quando rolar a pinça sobre o tecido, em seguida, um nó de linfa tem provavelmente foi removido com sucesso.
    2. Coloque linfonodos removidos em PBS gelado.
  6. Usando os fórceps e tesouras, abrir a cavidade abdominal, cortando através da parede abdominal exposta em um movimento ascendente em direcção ao peito. Cuidadosamente cortar o esterno, expondo a cavidade torácica.
  7. Localize o diafragma abaixo dos pulmões e corte do diafragma. Ele deve puxar para as costelas devido à tensão.
  8. Levante os pulmões de baixo e cortar o tecido subjacente para a traqueia. Isto permite que os pulmões para ser removida livremente a partir da cavidade torácica. Retire o coração e os pulmões em bloco e coloque em PBS gelado. O coração pode ser removido dos pulmões aqui ou apenas antes da pesagem no Passo 2.
  9. Remova opinos, mantendo o mouse no lugar sobre a almofada de espuma de poliestireno. Vire o mouse e cortar a pele da parte inferior das costas todo o caminho através de flanco para flanco.
  10. Usando um pedaço estéril de gaze para manter o torso do mouse, tirar a pele de trás do mouse sobre as pernas e os pés do mouse.
  11. Usando o mesmo pedaço de gaze estéril, segure a perna no lugar, cuidadosamente quebrar a articulação do tornozelo do pé mouse e descascar a pele sobre a articulação proximal para a articulação do joelho.
  12. Com uma tesoura, retire a tíbia livre da articulação do joelho e coloque em PBS gelado.
  13. Repita os passos de 1,11) a 1,12) com o membro oposto.
  14. Utilizando uma pinça, segure o fêmur no lugar, cortar o tecido circundante muscular usando a tesoura e remova o fêmur, colocando-o em PBS gelado.
  15. Repita o passo 1.14) com o membro oposto.
  16. Usando um novo pedaço de gaze estéril, segure a cabeça do rato no lugar. Utilizando uma pinça e tesouras, remover suavemente a pele para expor as skull. Com uma tesoura, corte cuidadosamente o crânio occipital do centro da parte superior em uma linha reta e para baixo para expor o cérebro posterior.
  17. Usando fórceps, escavar por debaixo do cérebro para o anterior e remover todo o cérebro. Coloque o cérebro em PBS gelado.
  18. Repita os passos 1.1) a 1,17) durante pelo menos quatro ratos.

2. Órgão Pesando

  1. A seguir ao isolamento de órgãos, pesam cada tubo PBS contendo pulmão e tecido do cérebro utilizando uma balança electrónica.
  2. Calcula-se a diferença de peso, subtraindo o peso pré-isolamento (apenas PBS) a partir do peso do tubo de PBS + órgãos (pulmão e cérebro).
  3. Determinar a quantidade de meios necessários para ressuspender os fragmentos de tecido a partir da diferença de peso calculado.
    Nota: de pulmão e tecido cerebral são em peso normalizada, por re-suspensão em uma mistura 4: 1 de meios: proporção tecido (vol / peso).

3. Geração de Mídia Lung- e cérebro-condicionado

  1. Num t estérilemissão cultura capô, inverter tubos PBS contendo pulmão ou cérebro três vezes para remover o sangue residual de órgãos e aspirado PBS contendo sangue. Repita com PBS frio fresco até que a solução aparece clara, sem evidência de sangue.
  2. Coloque pulmões e cérebros em separado 60 milímetros 2 pratos de petri de vidro. Usando duas lâminas de bisturi estéril, pulmões moer ou cérebros por várias vezes cortar e para trás até fragmentos de tecido são aproximadamente ~ 1 mm3 de tamanho.
  3. Ressuspender fragmentos de tecido num volume apropriado (previamente determinado no passo 2.3) de meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM): F12 suplementado com suplemento concentrada 1x penicilina e mitogénio (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml).
  4. Adicionar fragmentos pulmonares ou tecido cerebral ressuspensos para um poço de uma placa de 6 poços.
  5. Incubar fragmentos de tecidos em meio, durante 24 horas a 37 ° C e 5% de CO 2. Após a incubação, recolher meios condicionados para cada tecido e fUTRAS diluir pela adição de três volumes equivalentes de meio fresco em um tubo de 50 ml.
  6. Centrifugar a 1.000 xg em meios condicionados diluídos para cada órgão a 4 ° C durante 15 min para remover grandes restos de tecido. Recolher o sobrenadante de mídia e filtrar através de um filtro de seringa de 0,22 mM.
  7. Piscina meios condicionados de cada órgão (ie., Pulmão com pulmão e cérebro com cérebro) a partir de vários ratos para explicar a variabilidade do mouse-a-mouse. Alíquotas e armazenamento de meios condicionados à temperatura de -80 ° C até à sua utilização.

4. geração de mídia de Medula Óssea condicionado

  1. Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, aparar o excesso de tecido do osso e remover epífises (peças finais) dos ossos com uma tesoura.
  2. Usando uma agulha G 27 ½, cavidade medular dos ossos descarga, empurrando 1 ml de PBS através do centro de cada osso. Isso permitirá que você para coletar células do estroma da medula óssea (BMSC) para um tubo fresco contendo PBS.
  3. Centrifugar a 1,000 xg durante 5 min a 4 ° C e lava-se duas vezes com PBS BMSC. Ressuspender as células do estroma da medula óssea em 20 ml de meio de crescimento de células de estroma ósseo (DMEM: F12 suplementado com 1x concentrada mitogénio suplemento, penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml) e 10% de soro Boven fetal (FBS) ).
  4. Placa 10 ml de células estromais de medula óssea ressuspensas em um frasco T75.
    Nota: Combine e células da placa de cada 2 ratos em cada frasco T75; por quatro camundongos, dois frascos T75 são necessários (cerca de 1 x 10 7 células / frasco).
  5. Incubar as células do estroma da medula óssea em meio de crescimento de células de estroma ósseo durante 24 h a 37 ° C e 5% de CO 2. Após a incubação, remover a mídia de ambos os frascos T75 e colocar em novo frasco T75, rotular este frasco como "Floater Flask". Adicionar meio fresco de crescimento de células de estroma ósseo para frascos anteriores 2 e incuba-se todos os frascos de 3 a 37 ° C e 5% de CO 2.
  6. Depois de células atingirem aproximadamente 70% de confluência (aproximadamente 5-7dias), as células de passagem. Para fazer isso, remover o meio e lavar as células duas vezes com PBS (3 mL cada lavagem). Remover PBS e adicionar 3 ml de solução de tripsina / EDTA, assegurando que a tripsina cobre toda a superfície do frasco. Depois de células retire o frasco (~ 2-3 min), pare tripsinização reacção por adição de 3 ml de osso meio de crescimento de células do estroma). Centrifugar 900 xg durante 5 min a 4 ° C, descartar meios de comunicação, e ressuspender as células em 10 ml de meio fresco de crescimento de células de estroma ósseo.
  7. Células de associação de todos os frascos e a passagem 1: 5 em três novos frascos T75 e incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. Depois de as células mais uma vez chegar a 70%, repita o passo 4.6 e piscina e de passagem todas as células aderentes uma segunda vez. Re-placa de todas as células para frascos T75 e quatro incubar a 37 ° C e 5% de CO 2. meios de crescimento celular de estroma ósseo deve ser utilizado para todos os passos.
  8. F12 + 1x mitogen concentrada su: permitir que as células para alcançar a confluência, lavar as células três vezes com PBS e adicionar estromal meios de recolha de células ósseas (DMEMpplement + penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml); 10 ml / T75), certificando-se que esta mídia é livre de FBS. Recolha de meio condicionado de medula óssea de 72 horas mais tarde, filtra-se através de um filtro de 0,22 um, piscina, alíquota, e armazenar a -80 ° C até à sua utilização.
  9. Se desejado, confirmar o fenótipo das células do estroma da medula óssea (BMSC) isolados utilizando anticorpos contra a Sca-1 de rato, CD105, CD29, e CD73, CD44, utilizando técnicas de citometria de fluxo padrão como descrito anteriormente 13.

5. geração de mídia Linfonodo condicionado

  1. Em uma capa de cultura de tecidos estéreis, inverter tubo PBS contendo nódulos linfáticos três vezes para remover o sangue residual de nódulos linfáticos e aspirado sangrenta PBS. Repita com PBS frio fresco até que a solução aparece clara, sem evidência de sangue.
  2. Coloque os gânglios linfáticos em placas de Petri de 60 mm2 de vidro. Usando duas lâminas de bisturi estéril, gânglios linfáticos picada por várias vezes cortar e para trás até tissue fragmentos são aproximadamente 1 mm 3 de tamanho.
  3. Num tubo de cónico, fragmentos de tecido ressuspender em 10 ml de Roswell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640) meio suplementado com penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml), 5 x 10 -5 M estéril β-mercaptoetanol ( 1,75 ul / 500 ml de meio) e 10% de FBS.
  4. Centrifuga-se a 900 xg durante 5 min a 4 ° C e colocar todas as células em 30 ml de meio. Adicionar 5 ml de meio / poço numa placa de 6 poços e incubar durante 7 dias a 37 ° C e 5% de CO 2.
  5. Após a 7 dias de incubação, descartar meios, lavar as células aderentes com 5 ml de PBS morno e adicione 5 ml de meio fresco a cada poço. Permitir que as células crescer até à confluência (aproximadamente 5 - 7 dias), trypsinize, reunir todas as células, e passagem tal como descrito no passo 4.6. células re-placa para placa de 6 poços. Repita este passo três vezes.
  6. Depois de três passagens, permitir que as células crescer até à confluência, lavar os poços três vezes com PBS e adicionar 2 ml / poço de DMEM: F12 + 1xsuplemento concentrado mitogénio e penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / mL), assegurando que este suporte é livre de FBS. Recolha meios condicionados-linfonodos após 72 horas, piscina, alíquota, e armazenar a -80 ° C até o uso.
  7. Se desejado, confirmar o fenótipo das células dos nodos linfáticos do estroma isoladas (LNSC) utilizando anticorpos contra CD45 e gp38 de rato, utilizando técnicas de citometria de fluxo padrão como descrito anteriormente 13.

6. Uso de Mídia Organ-condicionado para ensaios a jusante relacionadas com o comportamento metastático das células cancerosas

  1. Uma vez que os meios condicionados por órgão foi gerada tal como descrito nos passos 1 - 5, utilizá-lo para levar a cabo a jusante da célula diferente e ensaios de biologia molecular, a fim de determinar a influência de factores derivada de órgãos solúveis sobre o comportamento metastático de células cancerosas. Exemplos de ensaios normalizados descritos noutro local (na literatura) incluem matrizes de proteína 13, ensaios de crescimento celular 13, a migração celular Ensaios 13, tumorsphere formação 14, e RT-PCR 15. Os meios de base original utilizado para gerar o meio condicionado de órgão (ou seja, não condicionado DMEM:. Meio F12 suplementado com 1x concentrada suplemento mitogénio e penicilina (50 ug / ml) / estreptomicina (50 ug / ml) deve ser usado como um controlo negativo .

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Resultados

Geração de mídia com ar-Organ

Um diagrama / esquemática descrição geral do processo de isolamento de órgãos e geração de meios condicionados é apresentado na Figura 1, com imagens fotográficas representativos do processo mostrado na Figura 2. Deve notar-se que, quando este protocolo foi a primeira fase de desenvolvimento, fígado foi incluído em nossa análise, porque é um local...

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Discussão

A metástase é um processo complexo pelo qual uma série de eventos celulares são responsáveis ​​por invasão de tecido e tumor distante estabelecimento 4,30,31. O sistema modelo ex vivo aqui apresentada pode ser utilizada para estudar dois aspectos importantes da progressão metastático: homing célula de cancro ou de migração de um órgão específico ( "chegar") e o crescimento neste órgão ( "crescendo lá"). Muitos estudos têm focado anteriormente na identificação de características mo...

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Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Este trabalho foi apoiado por doações da Canadian Breast Cancer Foundation-Ontario Region, da Canada Foundation for Innovation (nº 13199) e do apoio de doadores de John e Donna Bristol por meio da London Health Sciences Foundation (para A.L.A.). O apoio à bolsa de estudos e bolsas de estudo foi fornecido pelo programa de Bolsas de Pós-Graduação de Ontário (Província de Ontário, para GMP e JEC), o programa de Bolsa de Pós-Graduação do Canadá - Mestrado (para MMP), o Programa de Treinamento Estratégico dos Institutos Canadenses de Pesquisa em Saúde (CIHR) (para MMP, GMP e JEC) e a Unidade Translacional de Pesquisa de Câncer de Mama Pamela Greenaway-Kohlmeier no Programa Regional de Câncer de Londres (para MMP, G.M.P., J.E.C. e Y.X.). A.L.A. é apoiado por um Prêmio CIHR de Novo Investigador e um Prêmio de Pesquisador Inicial do Ministério de Pesquisa e Inovação de Ontário.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Tubos cônicos de 50 mlThermo Scientific (Nunc)339652Mantenha estéril
1x solução salina tamponada com fosfatoThermoFisher Scientific10010-023Mantenha os camundongos nus estéreis
Harlan LaboratoriesHsd:Athymic Nude-Foxn1nuUse às 6 - 12 semanas de idade Almofada de
espuma de poliestirenoN/AN/AA tampa descartada (~ 4 x 8 polegadas ou maior) de um contêiner de espuma de poliestireno pode ser usada para essa finalidade. Esterilize limpando com etanol.
FórcepsFine Science Tools11050-10Mantenha a tesoura estéril
deFine Science14058-11Mantenha as compressas de gaze estéreis
Fisher Scientific22-246069Mantenha estéreis
placas de Petri de vidro de 60 mm2Sigma-AldrichCLS7016560estéreis
Fisher ScientificS95937AMantenha o DMEM estéril
:F12Life Technologies21331-020Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar, manter estéril 
1x Mito + Extensor de SoroBD Biosciences355006Referido como "suplemento mitógeno concentrado" no manuscrito. Mantenha a
Penicilina-Estreptomicina estéril (10.000 U/ml)Life Technologies15140-122Mantenha estéril
Rosewell Park Memorial Institute 1640 (RPMI 1640)Life Technologies11875-093Quente em 37 &graus; C banho-maria antes de usar, manter estéril 
Soro Fetal BovinoSigma-AldrichF1051-500MLMantenha a solução estéril
de tripsina/EDTAThermoFisher ScientificR-001-100Quente em 37 ° C banho-maria antes de usar, manter estéril 
Placas de cultura de tecidos de 6 poçosThermo Scientific (Nunc)140675Mantenha estéril
0,22 μ m filtros de seringaSigma-AldrichZ359904Manter frascos de
cultura de tecidos T75Thermo Scientific (Nunc)178905Manter estéreis
TranswellsSigma-AldrichCLS3464Manter estéril, usar para ensaios
de migração Anti-mouse Sca-1R& D SystemsFAB1226Puso em 10 µ células l/106
anti-rato CD105 R& D SistemasFAB1320Puso em 10 µ células l/106
anti-rato CD29 R& D SystemsFAB2405P-025uso em 10 µ células l/106
anti-rato CD73 R& D SystemsFAB4488Puso em 10 µ l/106 células
Anti-rato CD44 R& D SystemsMAB6127-SPuso em 0,25 µ g/106 células
Anti-rato CD45eBioscience11-0451-81uso em 5 µ células l/106
anti-rato gp38eBioscience12-5381-80use em 10 µ L/106 células
β-mercaptoetanol Sigma-AldrichM6250 Manter estéril
Matrizes de proteínasRayBiotech Inc.AAM-BLM-1-2Use 1 matriz por condição de mídia (incluindo controle negativo), em triplicado
Ferramentas Mantenha as lâminas de bisturi estéreis

Referências

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