Aqui, apresentamos um protocolo para a síntese de partículas semelhantes a vírus, seja através de baculovírus ou sistemas de expressão de mamíferos e purificação ultracentrifugação. Esta abordagem altamente personalizada é utilizado para identificar antigénios virais como alvos de vacinas de maneira segura e flexível.
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Artigo de método
Expressão e purificação de partículas semelhantes a vírus para a vacinação
Neste artigo
Resumo
Resumo
partículas semelhantes a vírus (VLPs) e partículas sub-virais (SVPS) são uma abordagem alternativa para concepção de uma vacina viral que oferece as vantagens de aumento da bio-segurança e estabilidade ao longo do uso de agentes patogênicos vivos. Não infeccioso e a auto-montagem, as VLP são utilizados para apresentar a proteínas estruturais como imunogénios, evitando a necessidade de agentes patogénicos vivos ou vectores virais recombinantes para a entrega de antigénio. Neste artigo, demonstramos as diferentes fases de concepção VLP e desenvolvimento para futuras aplicações em testes em animais pré-clínicos. O procedimento inclui as seguintes fases: selecção do antigénio, a expressão do antigénio na linha de células de escolha, purificação de VLP / SVPS, quantificação e para a dosagem de antigénio. Nós demonstramos a utilização de ambas as linhas celulares de mamífero e de insecto para a expressão de antigénios e os nossos demonstrar como metodologias diferem no rendimento. A metodologia apresentada podem ser aplicadas a uma variedade de agentes patogénicos e pode ser conseguido por substituição dos antigénios imunogénicos com Strproteínas uctural de microorganismo do usuário de interesse. VLP e SVPS auxiliar na caracterização de antigénios e selecção dos melhores candidatos a vacinas.
Introdução
partículas semelhantes a vírus (VLPs) são uma tecnologia aprovado para vacinação humana. Na verdade, algumas das vacinas mais contemporaneamente licenciados, incluindo os vírus do papiloma humano (HPV) e Β hepatite (HepΒ) vacinas empregam esta abordagem. As VLPs são formadas a partir de proteínas estruturais capazes de auto-montagem. As partículas montados imitar morfologias virais, mas não pode infectar ou replicar porque lhes falta genomas virais. VLP pode ser expressa e purificada a partir de um número de sistemas procariotas e eucariotas. Uma revisão da literatura revelou que os diferentes sistemas de expressão são empregadas com as seguintes taxas: bactérias - 2....
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Protocolo
1. Sistema de expressão de mamífero para a geração de gripe H3N2 VLP
- Subclone viral estrutural glicoproteínas hemaglutinina (HA), neuraminidase (NA), e vírus da imunodeficiência humana (HIV) Gag p55 em vectores de expressão eucarióticos, tais como pTR600 descrito anteriormente 7.
- Amplificar o ADN em Escherichia coli quimicamente competentes (por exemplo, DH5a) e isolar o plasmídeo de transfecção de grau utilizando um kit de purificação de plasmídeo de acordo com as instruções do fabricante. Quantidade de DNA é dependente de rendimento e as necessidades do usuário.
- Manter a linha celular de mamífero, 293T, em meio de ....
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Resultados
rendimentos VLP foram variáveis por design construção de antigénio viral. Neste protocolo, demonstramos a utilização de células de insecto e de mamífero para a produção de SVP ou VLP em sobrenadante e purificação por ultracentrifugação. Quatro subtipos de gene estrutural cassetes de expressão DENV prM / E foram usadas para construir as versões do DENV SVPS demarcadas (1-4) como na Tabela 1 e demonstram uma gama entre 1,1-2,6 mg de proteína total em volumes de 0,6 ml. P.......
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Discussão
Usámos as técnicas descritas acima para expressar e purificar com êxito SVPS e as VLP compostas por várias proteínas estruturais para vários patogénios. De um modo geral, que utilizam sistemas de expressão de mamífero para gerar nossos VLP. No entanto, em nossas mãos, de células derivadas de mamíferos CHIK rendimentos VLP foram baixos. CHIK rendimento VLP foi mais robusta quando se utiliza um sistema de células de baculovírus de insectos recombinante. Em geral, baculovírus de insecto sistemas de células de produzir quan.......
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Divulgações
Autores não têm nada a revelar.
Agradecimentos
Gostaríamos de agradecer os membros anteriores do laboratório Ross, que têm ajudado a otimizar o protocolo para a máxima eficiência e produtividade.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Kit Maxi de Plasmídeo | Qiagen | 12163 | |
| DMEM | Cellgro | 10-013 | |
| Lipofectamine | Life Technologies | L3000075 | Lipofectamine 2000, Lipofectamine 3000 |
| Opti-MEM I | Life Technologies | 31985062 | |
| Sistema de Expressão de Baculovírus Bac-to-Bac | Technologies | 10359-016 | |
| Placa agitadora multiponto Cimarec I 6 | ThermoFisher Scientific | 50094596 | |
| Tubos de ultracentrífuga Polyclear | Seton | 7025 | Confirme os tubos apropriados para ultracentrífuga e tamanho de balde |
| Kit de ensaio de proteína Micro BCA | ThermoFisher Scientific | 23235 | |
| Tampão citrato de fosfato | Sigma | P4922 | |
| o-fenilenodiamina dicloridrato | Sigma | P8287 | |
| 0.22 μ m topo do filtro de vácuo (500 ml) | Nalgene | 569-0020 | |
| Glicerol | Sigma | G5516 | |
| H2SO4 | Sigma | 339741 | |
| Sf-900 II SFM | ThermoFisher Scientific | 10902-096 |
Referências
- Zeltins, A. Construction and characterization of virus-like particles: a review. Mol Biotechnol. 53, 92-107 (2013).
- Jain, N. K., et al. Formulation and stabilization of recombinant protein based virus-like particle vaccines. Adv Drug De....
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Reimpressões e permissões
