Abstract
心脏衰竭和心律失常是全世界发病率和死亡率的主要原因。然而，在患病心脏发病和心肌故障的机制仍有待完全澄清。最近令人信服的证据表明，在肌丝的 Ca 2+敏感性的变化会影响细胞内Ca 2+稳态和离子通道活动在心肌细胞，负责在健康和患病心脏心脏动作电位和收缩的主要机制。事实上，潜在的心脏动作电位（如钠离子 ，钙离子和钾离子通道，钠+ -Ca 2+交换）和细胞内钙离子处理的蛋白质（ 例如 ，兰尼碱受体和钙离子通道的活动和运输2+ -ATP酶肌浆网（SERCA2a的）或磷蛋白和磷酸化其）的常规测量evalu吃了心脏兴奋收缩（EC）耦合的基本机制。在细胞膜和细胞内钙离子的变化包括电活动有兴奋收缩耦联的触发信号，而肌丝的收缩和舒张的功能单位，肌丝钙离子敏感性是在肌原纤维性能的实施势在必行。然而，很少有研究纳入肌丝钙离子敏感性到心肌的功能分析，除非它是研究的重点。在这里，我们描述了测量肌缩短/再延长使用的Fura-2 AM（比率检测），并评估肌丝的 Ca 2+从大鼠心脏心肌细胞敏感性的变化，细胞内钙离子水平的协议。其主要目的是强调肌丝钙离子敏感性，应考虑到EC联轴器机械分析。我的全面排查对背后的健康和患病心脏肌细胞收缩将提供有价值的信息设计平移和治疗价值的更为有效的战略通道，离子转运，细胞内钙离子处理和肌丝钙离子敏感性。
Introduction
心肌兴奋收缩（EC）耦合是分析心肌， 即心脏1,2的收缩功能的机械性能的根本方案。 EC耦合 通过膜去极化继发于细胞膜离子通道的活动发起（ 例如，电压门控钠通道，它可以通过膜片钳技术测量）。电压门控的L型的随后活化的Ca 2+通道（LTCCS）和Ca 经由 LTCCS 2+内流触发散装的Ca 2+通过兰尼碱受体（RyRs的）的释放，从纳摩尔提高胞质Ca 2+浓度（纳米）到微摩尔（μM）的水平。这种增加在细胞内钙离子促进钙离子结合在薄丝肌钙蛋白C（TNC）和抒发灯丝复杂的构象变化，促进肌动球蛋白相互作用和达到myocardi人收缩3。相反，细胞内钙重新摄取回SR中的肌质网（SR）通过的 Ca 2+ -ATP酶（SERCA2a的），或者是通过 钠 / 钙交换和质膜挤出肌纤维钙离子 ATP酶1,2。因此，在细胞内的Ca的下降2+指使细长丝的构象变化返回到原来的状态，从而导致肌动蛋白-肌球蛋白和肌细胞松弛1-3的解离。在这个方案中，SERCA2a的活性通常被认为是，以确定心肌松弛的速度，因为它占70 -在大多数哺乳动物的心脏细胞1细胞内的Ca 2+去除的90％。正如LTCC，碱受体和SERCA2a的等这样的，不正常的钙处理一直被认为是受损的收缩和放松患病心脏1-4的主要机制。
离子 ，其功能如同在EC耦合 账户信使约1％的总细胞内Ca 2+和广大钙势必细胞内钙离子缓冲5,6。这是由于这样的事实，即各个的 Ca 2+缓冲液是在心肌细胞丰富， 例如，膜磷脂，ATP，磷酸，钙调蛋白，小清蛋白，肌原纤维TNC，肌球蛋白，SERCA2a的，并且在对SR肌集钙蛋白。5,6,7。其中，SERCA2a的和跨国公司是主要的钙缓冲5,6,7。此外，钙离子结合到其缓冲器是抽搐期间一个动态的过程（ 例如，钙2+ 30-50％结合于肌钙蛋白和Ca期间将它解离2+瞬变7）和中的 Ca 2+结合的原因的其他变化在细胞内钙的改变游离钙离子的“释放”到细胞质，结果2+浓度entration。因此，细胞内Ca 2+水平的扰动引起异常肌丝的运动，这是收缩功能障碍和心律失常8,9的前体。许多因素（包括生理和病理）可以是肌丝蛋白质的转录后修饰，影响肌丝的 Ca 2+缓冲和肌丝的 Ca 2+敏感性8-10的来源。最近，据报道，在肌丝蛋白突变增加的 Ca 2+结合亲和力和细胞内Ca 2+的处理，触发的 Ca 2+瞬变，异常的 Ca 2+释放，和心律失常8的暂停依赖性增强。根据这一理念，我们也表现出高血压大鼠心脏继发于神经元型一氧化氮合酶上调的肌丝钙脱敏与高架舒张和收缩的 Ca 2+水平有关11，这又增加了LTCC的对于Ca 2+依赖性失活12的脆弱性。因此，肌丝的 Ca 2+敏感性是细胞内Ca 2+稳态和肌细胞收缩功能的“有效的”调节器。它已成为必要分析肌丝和Ca之间的相互作用2+处理的蛋白质为心肌兴奋收缩耦联及心功能的彻底调查。
在这里，我们描述了评估肌丝钙离子敏感性在孤立的心肌细胞变化的协议。细胞内钙离子分布的综合分析，肌丝钙离子敏感性和收缩会发掘新机制基本心肌力学。
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Protocol
该协议是按照指南卫生的联合国国家机构发布的实验室动物的护理和使用（NIH出版号85-23，1996年修订）。它是经首尔国立大学的机构动物护理和使用委员会（IACUC）（IACUC批准号：SNU-101213-1）。
1.缓冲液配制（表材料和设备）
- 制备300毫升新鲜分离溶液对实验当天（以mM：氯化钠，135;氯化钾，5.4; MgCl 2的，3.5;葡萄糖，5; HEPES，5; 的 Na 2 HPO 4，0.4;牛磺酸，20; pH值7.4用NaOH）。
- 制备100毫升新鲜的存储溶液在实验当天（以mM：NaCl的120;氯化钾5.4; MgSO 4上5; 氯化钙 0.2;钠丙酮酸5;葡萄糖5.5;牛磺酸20; HEPES 10;甘露醇29; pH 7.4的用NaOH）。
- 制备灌注溶液1L（以mM：氯化钠，141.4;氯化钾，4;和NaH 2 PO 4，0.33; MGCL 2，1; HEPES，10;葡萄糖，5.5; 氯化钙 ，1.8;甘露醇，14.5; pH为7.4，用NaOH）。
- 通过加入胶原酶（1毫克/毫升），蛋白酶（0.1毫克/毫升），牛血清白蛋白（BSA，1.67mg / ml）和钙离子 （0.05毫摩尔）制备加入30ml胶原酶溶液1至25隔离毫升解。
- 通过加入胶原酶（1毫克/毫升），牛血清白蛋白（1.67毫克/毫升），和钙离子 （0.05毫摩尔）至16.7毫升隔离溶液制备20毫升胶原酶溶液2。
- 通过加入0.4克的BSA至40ml的隔离溶液制备的40ml BSA溶液。单独10毫升和30ml成两个烧杯。添加的 Ca 2+至30毫升BSA溶液，使最终的Ca 2+浓度的BSA溶液是1毫米。
2.准备左心室（LV）心肌细胞的隔离
- 从动物设施的准备和隔离室转让清洁运输笼8-12周龄，雄性SD（SD）大鼠。
- H吃两水浴至37℃。
注意：使用一种水浴水 - 夹套容器和的Langendorff灌注系统的灌注管。使用其他水浴以分离单个细胞搅动心肌组织的树干。 - 加入5 ml和3.3的BSA溶液（不含Ca 2+）至25毫升胶原酶溶液1和16.7 ml胶原酶溶液2 ml至补足体积至30ml和20ml，分别。
- 在的Langendorff灌注系统，分别为（ 图1A）添加隔离溶液（100毫升）和胶原酶溶液1（30毫升）中，以第1列（第1栏）和第2列（第2列）。
- 充氧在的Langendorff灌注系统（ 图1A） 通过氧连接管分离溶液和胶原酶溶液1中第1栏和Col.2。同样地，含氧化合物胶原酶溶液2，并在摇动的水槽用100％O 2的经由所述BSA溶液氧气连接管。
3. LV心肌细胞的分离
- 麻醉通过戊巴比妥钠（30毫克/千克）的腹膜内注射大鼠和脚趾捏和缺乏撤回反射的确认麻醉状态。
- 移动老鼠解剖盘。在仰卧位，固定四条腿到主体用胶带的侧面。
- 应用胸中期轴向切口手术剪刀打开胸腔，确保不损害心脏。使用另一一双干净的剪刀从血管连接（ 例如，上，下腔静脉，肺血管，主动脉）和心包膜13解剖心脏。
- 留足够长的主动脉的一部分（5 - 8 mm产品），夹紧用细镊子主动脉，和1分钟（ 图1A）内快速安装的Langendorff灌注系统的插管。领带缝合线4/0紧紧过主动脉。
- 通过削减主动脉卸除消化心脏，并通过召开用钳子将主动脉含有新鲜的隔离解决方案（ 图1Bi）烧瓶中传送。用细剪刀和镊子大部分LV游离壁（包括隔膜），以切成小块（〜22毫米， 图1Bii）。
- 转移片放入含预热和含氧的新鲜胶原酶溶液2（ 图1Biii）的烧瓶中。振摇10分钟。请提供氧气的含肌细胞胶原酶溶液2。
- 移动心肌细胞-悬浮液10 ml离心管中，使用滴管带吸球，并添加钙 -含BSA溶液（1：1的体积比）。离心在30克2分钟，弃上清。重悬在5ml BSA溶液的肌细胞沉淀。离心并弃去上清液。
- 驱散心肌细胞颗粒，并在RT（ 图1Biv-VI）保持心肌细胞在10毫升预氧化的存储解决方案。
- 在烧瓶内的剩余的LV组织 - 重复程序（3.9步骤3.7）。
注意：不断重复的过程（步骤3.7 - 3.9）再次直到大部分LV组织消失，细胞获得了良好的收益。 - 保持在存储溶液中的细胞在室温6-8小时，直至实验结束。
4.细胞内钙瞬变和心肌细胞收缩的同时测量
- 负载的LV心肌细胞与乙酰氧甲基酯的Fura-2 AM（2μM）。
注：在黑暗的管（ 图1Bvii）装载的细胞执行所有加载的程序和实验。- CENTRifuge在2000 xg离心肌细胞悬浮液（1ml）中，持续10秒。弃去上清液并重新悬浮于1ml台罗德氏溶液具有低Ca 2+浓度（250μM，表材料和设备）的肌细胞沉淀。
- 添加的Fura-2AM和泊洛沙姆407（2微升），轻轻分散肌细胞悬浮液，并保持该混合物在RT（20 - 24℃）15分钟（ 图1Bvii）。
- 离心混合物，持续5秒，弃去上清液并分散肌细胞沉淀在1ml含有500μM 的 Ca 2+灌注溶液。 10分钟后，离心该混合物，持续5秒，并丢弃上清液。
- 加入新鲜的灌注溶液（500μM 钙 1毫升），并保持的Fura-2AM -加载 心肌细胞颗粒在此解决方案的记录。
- LV的细胞收缩和细胞内Ca 2+测定
- 录像之前，填补通过运行输液管与台氏溶液，这是水套预热到36℃。
- 放置的Fura凌晨2点几滴 - 加载的LV心肌悬浮于5倒置荧光显微镜的腔室 - 8分钟。慢慢灌注台罗德氏溶液（2.2毫升/分钟）。
- 按数字刺激开始字段刺激（2赫兹）的前面板上的“启动”按钮。
注意：输出电压（10V，5毫秒的持续时间）通过设置在腔室的任一侧铂导线施加到心肌细胞中的腔室。- 选择细胞的合同稳定（而不是那些显示高血糖或低收缩）记录。
- 调整选择的心肌细胞中的基于视频的肌节检测系统的水平位置和调整显微镜的焦点，以获得肌节的最佳图像。在其中肌节清晰明确，直到平均观察到的区域紫色矩形框的位置肌节长度（红色峰）的显示单一尖峰（ 图2A，下图）。
- 记录响应于场刺激（ 图2A和B）小节的长度的变化。
注意事项：1范围内使用加载的细胞 - 2小时。 - 调节摄像机的光圈，使得在基于视频的肌节的检测系统中的场是心肌细胞（ 图2A）的尺寸。刺激与360纳米/ 380纳米激发和发射510纳米（收购频率1000赫兹）的心肌细胞。记录肌节缩短和与场刺激（ 图2B）的Fura2调幅比。
5.肌丝钙离子敏感性评价
- 平均肌节长度和Ca在稳态2+瞬变（10 - 20痕量）和绘制的Fura-2比对相同的心肌细胞的肌节长度的相平面环（都与测量值S和增量变化; 图2C）。
- 在每个小区，定义的Fura -2在50％松弛（EC 50， 图2C）的比例。比较这两个循环，每个干预的EC 50。
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Representative Results
LV肌细胞正常和高血压大鼠心脏分离。有明确的条纹（代表肌节），并稳定收缩响应于场刺激棒状细胞被认为是最佳的细胞和被选择用于记录（ 图2A）。在F中igure 2A所示的例子中，一个的Fura上午02点-loaded左心室心肌细胞水平定位并调节摄像机的光圈，使心肌细胞占据了大部分的记录区和最小的背景区域被包括在内。在录制现场，通过点击和拖动在计算机屏幕上此框（通过记录程序）调整紫色框的尺寸。当平均小节的长度示出了一个尖锐的红色的峰值，开始记录（ 图2A，下图）。
既小节的长度和细胞内Ca 2+ transie NTS（的Fura-2的比率）由相同的细胞（ 图3A）同时记录。小节的长度和Ca 2+瞬变的平均迹线示于图3B。单独来看，舒张/收缩肌节的长度，达峰时间（PT）和肌节缩短测量调查的幅度和心肌收缩力的动力。时间70％的松弛（TR 50）进行分析，以评估肌细胞的松弛。同样，舒张和收缩的Fura-2的比率（ 钙瞬变），达峰时间（PT）的Ca 2+瞬变和Ca的时间常数2+瞬变衰减（头）的分析，以评估肌细胞收缩和放松（ 表1）。在这个例子中， 钙瞬变的幅度适度的LV心肌细胞从高血压大鼠增大和收缩适度降低（ 图3B和表1）。
内容“FO：保together.within页=”1“>此外，的Fura之间的关系- 2比和肌节的长度（表示LV肌细胞的肌丝钙离子敏感性）在这两个假和高血压大鼠绘制（ 。 图3C）的的Fura 2 -中的心肌细胞的松弛阶段小节的长度的轨迹限定胞浆钙 ，肌丝的 Ca 2+结合，和肌节长度14的准平衡;因此，该松弛阶段在两个之间进行比较基。轨迹的心肌细胞的向右移位由高血压组指示降低肌丝响应于钙离子 （ 图3C），因此，所需的细胞内Ca 2+浓度为半松弛（EC 50）增大（ 图3C） ，指的是肌丝的 Ca 2+ -desensitization高血压。图1. 程序从大鼠心脏隔离LV肌细胞。 （一）用于灌注的隔离解决方案到通过主动脉插管的心脏中的Langendorff灌注系统（插图，灌注系统上安装心脏的放大图）（B）我-三：消化后，将心脏与胶原酶1和解剖LV组织培养皿和烧瓶（B）四-六：。肌细胞悬液加胶原酶溶液2，离心后心肌细胞沉淀，并重新悬浮心肌细胞颗粒在存储解决方案后，（B）七：孵化，孵化LV肌细胞的Fura上午02时-包含隔离解决方案（2微米的Fura 2日上午，250μM 钙和2微升泊洛沙姆407）;冲洗，洗LV肌细胞与隔离解决方案与500微米的 Ca 2+;存储，保留的Fura-2 AM - 加载LV肌细胞含有500μM 钙新鲜的隔离解决方案。 请点击此处查看该图的放大版本。
图2. 测量肌节缩短和的Fura-2的比率（指示细胞内Ca 2+ 水平 的 ） 的 。 （A）肌节的图中，呋喃-2 -loaded LV心肌细胞的图像和平均小节的长度（红峰）显示在电脑上。在下部面板，黑线是感兴趣的紫色区域内的各水平像素线的平均。蓝线是在每一端归零相同的数据。红线是快速傅立叶变换（FFT）的功率谱，其表示的FFT计算出的信号的数目。一个尖锐的PEAK意味着一个干净的肌节的记录。（B）肌节长度和的Fura -2回应场刺激（2HZ）的比例同时进行的录像。在2的Fura 主场迎战比同LV小节的长度（C）相平面情节心肌细胞（请注意，这些参数的两个实际长度/的Fura 2比率和增量的变化进行了分析）。 EC 50（2的Fura比为50％，松弛，有箭头指示圈）是肌丝钙组与组之间的灵敏度的定性比较。 请点击此处查看该图的放大版本。
图3. LV心肌细胞收缩的假和高血压大鼠分析的代表性结果。 （A）肌节的S原始痕迹hortening和的Fura -从假和高血压大鼠心肌细胞LV 2比测量（B）小节的长度和的Fura平均痕迹- 2信号。在平均迹线分析参数示于表1（C）的相平面上的的Fura的曲线图- 2的比率与肌节长度（两者的实际长度和的Fura -这些参数的2比和增量的变化）在两组。轨迹循环移位到右侧和EC 50往往是在高血压更高，这表明肌丝的 Ca 2+脱敏。 PT，达峰时间（秒）;时间70％的松弛（秒）：.TR 50 -头， 钙瞬变衰减（秒）的时间常数（2比用一个指数函数由的Fura的衰落相拟合获得）。 
请点击此处查看大图这一数字。
| 参数 | 假 | 高血压 | |
| 细胞内Ca 2+ | 舒张钙 | 1.189 | 1.124 |
| 收缩的 Ca 2+ | 1.71 | 1.691 | |
| 振幅（Δ比） | 0.521 | 0.567 | |
| 时间峰（PT，S） | 0.021 | 0.031 | |
| 头（S） | 0.079 | 0.076 | |
| 肌节 | 舒张 | 1.758 | 1.78 |
| 小节的长度（微米） | |||
| 肌节 | 0.122 | 0.115 | |
| 缩短 （16;长度，毫米） | |||
| 时间峰（PT，S） | 0.064 | 0.055 | |
| 50％的时间 | 0.032 | 0.03 | |
| 放松（TR 50，S） | |||
| EC50 | [ 钙 离子浓度 （呋喃2的比例）为50％，肌节relengthening | 0.2382 | 0.3224 |
表1的Fura分析- 2的比率（细胞内Ca 2+）和肌节长度测量。
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Discussion
这里，我们描述了协议，以评估肌丝的 Ca 2+在单个孤立心肌细胞的敏感性的变化，并强调测定该参数一起电生理特性，细胞内Ca 2+瞬变，和肌丝动力学的重要性。这是因为一个或两个参数的记录可能没有阐明心脏收缩和舒张的基本机制。不同于测量肌细胞收缩和细胞内Ca 2+信息单独1的常规方法，本方法检查这两个参数在相同的心肌细胞同时。
许多方法通常被用来评估肌肉或肌细胞15,16,17， 例如，外源Ca之间的相互作用的检查2+和肌节/细胞长度/张力在皮肤细胞的肌丝的 Ca 2+敏感性（用洗涤剂如皂角苷或β-ESIN通透膜处理的）。长度与光电二极管和激光束衍射技术，和张力与力传感器或碳纤维）测量。这些技术被广泛用于肌肉的研究，因为它们使肌丝的 Ca 2+敏感性定量评估。然而，在质膜和细胞内Ca 2+的处理内源性离子通道的活动，这些都需要以引发肌丝的力学，忽略在这些技术。此外，所研究的肌肉带或肌细胞是预拉伸到一定舒张长度，并在这些条件下，初始小节的长度可以从肌细胞（特别是在疾病的条件和与干预）的实际舒张长度不同。这突出了当前的测量，其中的细胞器保持相对无扰，由此的优点，使全面evalu肌细胞收缩功能的通货膨胀。
可以理解，肌细胞（ 钙 -tolerating）和的Fura的最佳负载质量-上午02点是肌丝钙离子敏感性评价成功的两个关键因素。因此，若干修改被施加到协议，以获得可行的棒状肌细胞（总细胞的60-80％，如先前18,19,20描述）。首先，钙离子的低剂量在消化过程中（ 例如，Ca 2+浓度是在胶原酶溶液50μM和在存储溶液200μM）被添加到溶液。第二，在消化过程中，牛血清白蛋白加至胶原酶溶液以增强膜的稳定性。第三，最解的隔离，这增强功能细胞的百分比和实验的持续时间（6-8小时）中是氧化。第四，离体心肌细胞被保存在存储解决方案Çontaining 200μM 钙 。
以获得最佳的装载带的Fura上午02时，两种不同的 Ca 2+浓度（250和500微米）的使用和泊洛沙姆407（2微升，在二甲亚砜制备的20％）加到通过膜，以提高的Fura-2AM的渗透性和其心肌细胞的稳定性。应当指出，所有的 Ca 2+指示剂染料的 Ca 2+缓冲液21。因此，研究人员应避免使用的Fura-2 AM的高浓度或更长的温育，以避免过多的缓冲并减少肌细胞收缩性。所以建议没有的Fura细胞收缩 - 2装载常规检查，这是估计的肌细胞的质量和加载状态的一个重要步骤。变异载荷是不可避免的。因此，为了检查细胞收缩的变异性，具体地，在腔室收缩肌细胞的数目是否是类似于之前和重要的是压脚提升负载。应避免高血糖或防收缩肌细胞的分析，因为它们不表示心肌细胞的平均状态，并可能导致偏差结果和评价。
应当指出，在的Fura 2比测量的改变是细胞内Ca 2+水平的反射，而不是钙的实际化学浓度。因此，这里所描述的方法评估肌丝的 Ca 2+敏感性质变，而不是肌丝对钙离子的实际灵敏度。的Fura的校准- 2信号到细胞内Ca 2+浓度是获得在个别细胞可靠的 Ca 2+浓度的溶液。校准过程需要加载肌细胞用各种浓度的Ca 2+缀合的Fura - 2的AM（Ca 2+浓度范围从0到39微米），将所得的Fura - 2的比率与第计算Ë以下公式：[ 钙 离子浓度 = KD *（R - Rmin的）/（R最大- R）* F380max / F380min 21。有可能通过这样的校准过程来获得的 Ca 2+浓度的汇集平均值。然而，由于钙指标的负载量为肌细胞和校准间变量没有在个体细胞进行的，钙离子浓度可能不能准确地获取。此外，如果F360 / F380被测量，而不是F340 / F380（如在本研究中），所述的Fura 2比是不准确的（因为F360是的Fura-2的荧光22的等吸收波长）。尽管如此，它仍然是评估肌丝的Ca 2+生理实验灵敏度质的变化，尤其是在患病的人的心，在这里可以肌丝在细胞内环境改变后伴随改变的一种有效方法。建议这种方法与其他方法相结合（如德在讨论部分先前刻划），以肌丝的真实灵敏 度精确地分析，以钙离子 。
在细胞收缩的研究方法的其它局限性是空载状态。它可能低估或高估肌丝钙离子敏感性的变化。因此，为了准确地评价肌丝的 Ca 2+敏感性，分析应与定性和定量评估替代测量来执行。
该技术适用于在健康和患病心脏，包括人类心脏的样品，其中该细胞氧化还原环境和转录后修饰被改变，从而导致肌丝功能伴随变更评估心肌功能。特别是，离子通道，细胞内离子稳态和在肌丝调控蛋白是互动;因此，所有这些组件在concer起作用吨至确定体内心脏性能（ 例如 ，如在超声心动图测定）。
最后，我们描述了评估肌丝的 Ca 2+敏感性的变化的方法，并强调与心脏电结合，细胞内Ca 2+的处理，和心肌细胞收缩分析该参数，以获得肌细胞功能的完整资料的重要性。肌丝的 Ca 2+敏感性应 常规使用患病心脏模型，其中这些参数的变化，以及各种细胞内信号通路是相互关联的机制的研究来测定。
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Acknowledgments
这项研究是由基础科学研究计划通过教育，科学与技术部（2013068067）资助的韩国国家研究基金会（NRF）的支持;由教育部，科技部，首尔国立大学医院，高血压的韩国社会（2013年），SK电信研究基金的韩国部脑韩国21毕业生计划（编号3420130290）和中国国家自然科学基金（NSFC 31460265;国家自然科学基金81260035）。
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
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