Abstract
Hjärtsvikt och hjärtarytmier är de främsta orsakerna till dödlighet och sjuklighet i världen. Dock kvarstår mekanismen för patogenes och hjärtinfarkt fel i sjuka hjärta till fullo klar. Senaste övertygande bevis för att förändringar i myofilament Ca2 + känslighet påverkar intracellulär Ca2 + homeostas och jonkanal aktiviteter i hjärtmyocyter, de grundläggande mekanismer som ansvarar för hjärtaktionspotentialen och kontraktion hos friska och sjuka hjärtan. Faktum är att verksamheten i jonkanaler och transportörer underliggande hjärtaktionspotentialer (t.ex. Na +, Ca2 + och K + -kanaler och Na + -Ca 2+ växlar) och intracellulära Ca2 + hanterings proteiner (t ex., Ryanodinreceptorer och Ca 2+ -ATPas i sarkoplasmatiska retiklet (SERCA2a) eller fosfolamban och dess fosforylering) konventionellt mätas för att utvärdeåt de grundläggande mekanismerna av hjärt excitation-kontraktion (EG) koppling. Båda elektriska aktiviteter i membranet och intracellulära Ca2 + förändringar är utlösarsignaler i EG koppling, medan myofilament är den funktionella enheten av sammandragning och avslappning, och myofilament Ca2 + känsligheten är absolut nödvändigt för att genomföra myofibrill prestanda. Ändå är det få studier införliva myofilament Ca2 + känslighet till den funktionella analysen av hjärtmuskeln om det inte är i fokus för studien. Här beskriver vi ett protokoll som mäter sarcomere förkortning / re-förlängning och den intracellulära Ca2 + nivå med Fura-2 AM (ratiometrisk detektering) och utvärdera förändringarna i myofilament Ca2 + känslighet i hjärtmuskelceller från råtthjärtan. Huvudsyftet är att understryka att myofilament Ca2 + känsligheten bör beaktas i EG koppling för mekanistiska analys. Omfattande undersökning av ipå kanaler, jon transportörer, intracellulär Ca2 + hantering och myofilament Ca2 + känslighet som ligger bakom myocyt kontraktilitet hos friska och sjuka hjärtan kommer att ge värdefull information för att utforma mer effektiva strategier för translationell och terapeutiskt värde.
Introduction
Cardiac excitation-kontraktion (EG) koppling är den grundläggande systemet för analys av mekaniska egenskaper hos myokardiet, dvs., den kontraktila funktionen av hjärtat 1,2. EG koppling initieras genom membrandepolarisering sekundärt till verksamhet sarcolemmal jonkanaler (t.ex. den spänningsstyrda natriumkanalen, som kan mätas via patch-clamp teknik). Efterföljande aktivering av spänningskänsliga L-typ Ca2 + kanaler (LTCCs) och Ca 2+ inflöde via LTCCs utlösa huvuddelen av Ca2 + frisättning genom ryanodinreceptorer (RyRs), vilket ökar den cytosoliska Ca2 + -koncentration från nanomolar (nM ) mikromolar (^ M) nivå. En sådan ökning av cytosoliskt Ca2 + främjar Ca2 + bindning till troponin C (TNC) i tunna filament och framkallar konformationsförändringar på glöd komplexet för att underlätta aktin-myosin interaktion och uppnår myocardial kontraktion 3. Omvänt cytosoliska Ca 2 + åter uptaken tillbaka in i sarkoplasmatiska retiklet (SR) via Ca2 + ATPas i SR (SERCA2a) eller pressas ut ur myocyt via Na + / Ca2 + värmeväxlare och plasmalemmal Ca2 + ATPas 1,2. Följaktligen nedgången i cytosoliskt Ca2 + anstiftar konformationsförändringar av tunna trådar tillbaka till det ursprungliga tillståndet, vilket resulterar i dissociation av aktin-myosin och myocyt avkoppling 1-3. I detta system är aktiviteten hos SERCA2a allmänt anses bestämma hastigheten av myocardial avkoppling eftersom den står för 70-90% av cytosoliskt Ca2 + borttagning i de flesta däggdjurshjärtceller 1. Som sådan onormal Ca2 + hantering av LTCC, Ryr och SERCA2a, etc. har ansetts de primära mekanismerna för nedsatt kontraktilitet och avkoppling i det sjuka hjärtat 1-4.
+ som fungerar som budbärare i EG-kopplings står för cirka 1% av den totala intracellulära Ca2 + och majoriteten av Ca2 + är bunden till intracellulära Ca 2 + buffertar 5,6. Detta beror på det faktum att olika Ca2 + buffertar finns rikligt i hjärtmyocyter, t.ex., membranfosfolipider, ATP, phosphocreatine, kalmodulin, parvalbumin, myofibrill TNC, myosin, SERCA2a och calsequestrin i SR. 5,6,7. Bland dem, SERCA2a och TNC är de dominerande Ca2 + buffertar 5,6,7. Dessutom 2+ bindning till dess buffertar är Ca en dynamisk process under rycka (t.ex. binder 30-50% av Ca2 + till TNC och separera från det under Ca2 + transienter 7) och förändringen i Ca2 + bindning orsakar ytterligare "släppa" av fri Ca2 + till cytosolen, resulterar i förändringar av den intracellulära Ca2 + koncentration. Följaktligen störning av den intracellulära Ca2 + nivå framkallar onormala myofilament rörelser, som är föregångare till kontraktil dysfunktion och arytmier 8,9. Många faktorer (både fysiologiska och patologiska) kan vara källor till posttranskription modifieringar av myofilament proteiner som påverkar myofilament Ca2 + buffring och myofilament Ca2 + känslighet 8-10. Nyligen rapporterades det att mutationer i myofilament proteiner ökar Ca2 + bindningsaffiniteten och intracellulär Ca2 + hantering, utlöser paus beroende förstärkning av Ca2 + transienter, onormal Ca2 + frisättning, och arytmier 8. I linje med detta koncept, har vi också visat att myofilament Ca2 + hyposensibilisering hos hypertensiva råtthjärtan sekundära till uppreglering av neuronal kväveoxidsyntas är förknippad med förhöjda diastoliskt och systoliskt Ca2 + nivåer11, vilket i sin tur ökar sårbarheten i LTCC till Ca2 + -beroende inaktive 12. Följaktligen är myofilament Ca 2 + känslighet en "aktiv" regulator av intracellulär Ca2 + homeostas och myocyt kontraktil funktion. Det har blivit nödvändigt att analysera interaktioner mellan myofilament och Ca2 + hanterings proteiner för grundlig utredning av myocyt EG koppling och hjärtfunktion.
Här beskriver vi ett protokoll som bedömer förändringarna i myofilament Ca2 + känsligheten i isolerade hjärtmyocyter. Omfattande analys av intracellulär Ca2 + profil kommer myofilament Ca2 + känslighet och kontraktion gräva nya mekanismer underliggande hjärt mekanik.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Protocol
Protokollet är i enlighet med handledningen för vård och användning av försöksdjur som publicerats av FN: s National Institutes of Health (NIH publikation nr 85-23, reviderad 1996). Den godkändes av Institutional Animal Care och användning kommittén (IACUC) i Seoul National University (IACUC godkännande nr .: SNU-101.213 till 1).
1. Buffer Förberedelse (tabell Material och utrustning)
- Förbereda 300 ml färskt isolering lösning på dagen för experimentet (i mM: NaCl, 135; KCl, 5,4; MgCl2, 3,5; glukos, 5; HEPES, 5; Na 2 HPO 4, 0,4; taurin, 20; pH 7,4 med NaOH).
- Bereda 100 ml färskt lagringslösning på dagen för experimentet (i mM: NaCl 120; KCl 5,4; MgSO 4 5; CaCl2 0,2; natrium-pyruvat 5; glukos 5,5; taurin 20; HEPES 10; mannitol 29; pH 7,4 med NaOH).
- Förbered 1L av perfusion lösning (i mM: NaCl, 141,4; KCl, 4, NaH 2 PO 4, 0,33; MGCl 2, 1; HEPES, 10; glukos, 5,5; CaCl2, 1,8; mannitol, 14,5; pH 7,4 med NaOH).
- Förbered 30 ml kollagenaslösning 1 genom tillsats av kollagenas (1 mg / ml), proteas (0,1 mg / ml), bovint serumalbumin (BSA, 1.67mg / ml), och Ca 2 + (0,05 mM) till 25 ml av isolering lösning.
- Förbered 20 ml kollagenaslösning 2 genom tillsats av kollagenas (1 mg / ml), BSA (1,67 mg / ml), och Ca 2 + (0,05 mM) till 16,7 ml av isolering lösning.
- Förbered 40 ml BSA-lösning genom att tillsätta 0,4 g BSA till 40 ml av isolering lösning. Separat 10 ml och 30 ml i två bägare. Lägga Ca2 + till 30 ml av BSA-lösning så att den slutliga Ca2 + -koncentrationen i BSA-lösningen är 1 mM.
2. Förberedelse för isolering av vänsterkammar (LV) Myocyter
- Överför 8-12 veckor gamla, Sprague-Dawley (SD) råttor i rena transportburar från djuret möjlighet att beredningen och isoleringsrum.
- Häta två vattenbad till 37 ° C
Obs: Använd en vattenbad under vattnet - mantlade behållaren och perfusion rören i Langendorff perfusion systemet. Använd den andra vattenbad för att agitera hjärtvävnadsstammar för att separera enskilda myocyter. - Tillsätt 5 ml och 3,3 ml av BSA-lösning (utan Ca2 +) till 25 ml kollagenas lösning en och 16,7 ml kollagenas lösning två för att göra upp volymen till 30 ml och 20 ml.
- Lägg isoleringslösning (100 ml) och kollagenaslösning 1 (30 ml) till kolonn 1 (Kol 1) och kolumn 2 (Kol 2) i Langendorff perfusion systemet, respektive (Figur 1A).
- Syresätta isoleringslösningen och kollagenaslösning 1 i spalt 1 och Col.2 via syreanslutningsröret i Langendorff perfusion system (figur 1A). På samma sätt, syre kollagenas lösning 2 och BSA-lösning i skakvattenbad med 100% O 2 viasyre anslutningsröret.
3. Isolering av LV Myocyter
- Söva en SD-råtta via intraperitoneal injektion av pentobarbitalnatrium (30 mg / kg) och bekräfta bedövningsmedel status genom tå nypa och brist på tillbakadragande eftertanke.
- Flytta råtta till en dissektion fack. I ryggläge, säkra de fyra benen till de sidor av kroppen med tejp.
- Applicera bröstkorg mitten axiella snitt med kirurgiska sax för att öppna kistan, vilket garanterar att inte skada hjärtat. Använd en annan par rena sax för att dissekera hjärtat från anslutnings fartyg (t.ex. överlägsen och nedre hålvenen, lungkärl, och aorta) och perikardiell membranet 13.
- Lämna kvar en del av aorta av en tillräcklig längd (5-8 mm), klämma aortan med fin pincett, och snabbt montera kanylen enligt Langendorff perfusion systemet inom en min (Figur 1A). Tie suturtråd 4/0 tätt över aorta.
- Demontera diger hjärta genom att skära aorta och överföra den genom att hålla aorta med pincett i kolven innehållande färsk isolering lösning (Figur 1Bi). Använd fin sax och pincett för att skära det mesta av LV fria väggen (inklusive septum) i mindre bitar (~ 22 mm, figur 1Bii).
- Överföra bitarna i en kolv innehållande förvärmd och syresatt färsk kollagenaslösning 2 (figur 1Biii). Skaka i 10 min. Håll leverera syre till myocyte innehållande kollagenas lösning 2.
- Flytta myocyt - suspensionen till en 10 ml centrifugrör med hjälp av droppers med en sugbälgen och lägga Ca2 + - innehållande BSA-lösning (1: 1 i volym). Centrifugera vid 30 g under 2 minuter och kassera supernatanten. Åter avbryta myocyte pelleten i 5 ml BSA-lösning. Centrifugera och kassera supernatanten.
- Dispergera myocyt pellets och hålla myocyter i 10 ml av pre-oxygenerad lösning lagring vid RT (Fig 1Biv-vi).
- Upprepa förfarandena (steg från 3,7 till 3,9) med kvarvarande LV vävnaden i kolven.
Obs: Håll upprepa förfarandena (steg från 3,7 till 3,9) igen tills det mesta av LV vävnaden försvinner för att få en bra avkastning på myocyter. - Hålla myocyter i lagringslösning för 6-8 timmar vid rumstemperatur fram till slutet av experimenten.
4. samtidiga mätningar av intracellulära Ca2 + transienter och myocyt kontraktion
- Last LV myocyter med acetoximetylester Fura-2 AM (2 M).
Obs: Utför alla förfaranden och experiment lastning med laddade myocyter i en mörk rör (Figur 1Bvii).- Centrifuge den myocyt suspension (1 ml) vid 2000 xg under 10 sek. Kassera supernatanten och återsuspendera myocyte pelleten i 1 ml Tyrode lösning med en låg Ca2 + koncentration (250 pM, tabell Material och utrustning).
- Lägg Fura-02:00 och poloxamer 407 (2 pl), försiktigt sprida myocyte fjädring, och hålla blandningen vid RT (20-24 ° C) under 15 min (Figur 1Bvii).
- Centrifugera blandningen i 5 sek, kassera supernatanten och sprida myocyte pelleten i 1 ml perfusion lösning innehållande 500 | iM Ca2 +. Efter 10 min, centrifugera blandningen i 5 sek och kassera supernatanten.
- Lägg färsk perfusion lösning (500 iM Ca2 +, 1 ml) och hålla Fura-02:00 - loaded myocyt pelleten i denna lösning för inspelningar.
- Mätning av LV myocyte kontraktion och intracellulär Ca2 +
- Före inspelning, fylla perfusion röret som går genom envattenmantel med Tyrode-lösning, som är förvärmd till 36 ° C
- Placera några droppar av Fura 02:00 - laddad LV myocyt upphängning på kammaren av ett inverterat fluorescensmikroskop för 5-8 minuter. Långsamt BEGJUTA Tyrode-lösning (2,2 ml / min).
- Tryck på "start" -knappen på framsidan av den digitala stimulator att starta fältstimulering (2 Hz).
Notera: Utspänningen (10 V, 5 msek varaktighet) appliceras på de myocyter i kammaren genom platinatrådar placerade på vardera sidan av kammaren.- Välj myocyter kontraktet stabilt (inte de visar hyper- eller hypo-kontraktion) för inspelning.
- Justera myocyt val i horisontellt läge av sarcomere detekteringssystemet videobaserat och justera fokus för mikroskop för att erhålla optimala bilder av sarkomerer. Placera den lila rektangulär ruta på det område där klara sarkomerer tydligt observeras tills den genomsnittligaav sarcomere längder (röd topp) visar en enda skarp topp (Figur 2A, lägre bild).
- Registrera ändringarna av sarcomere längd som svar på fältstimulering (Figur 2A och B).
Obs: Använd laddade muskelceller inom 1-2 h. - Justera bländaren på kameran så att fältet i systemet sarcomere detekteringsvideobaserat är storleken på myocyt (Figur 2A). Stimulera myocyt med excitation vid 360 nm / 380 nm och emission vid 510 nm (förvärvsfrekvens 1000 Hz). Spela sarcomere förkortning och fura2 AM förhållandet med fältstimulering (Figur 2B).
5. Bedömning av Myofilament Ca2 + Känslighet
- Genomsnitt sarcomere längder och Ca 2 + transienter vid steady-state (10 - 20 spår) och plotta fas-plan slinga av Fura-2 förhållande vs. sarcomere längd samma myocyte (båda med uppmätt värdes och delta förändringar; Figur 2C).
- I varje tomt, definierar Fura -2 förhållande till 50% relaxation (EC50, figur 2C). Jämför både slingan och EC50 för varje ingripande.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Representative Results
LV myocyter isoleras från normala och hypertensiva råtthjärtan. Stavformade myocyter med tydliga strimmor (representerande sarkomerer) och stabila kontraktioner som svar på fältstimulering anses vara de optimala myocyter och väljs för inspelningar (Figur 2A). I den i F igure 2A exempel -loaded en Fura 02:00 LV myocyt placeras horisontellt och öppningen av kameran justeras så att myocyt upptar större delen av inspelningen fältet och minimal bakgrundsområde ingår. I inspelningsområdet, justera måtten på den lila rutan genom att klicka och dra den här rutan på datorskärmen (genom inspelningsprogrammet). När den genomsnittliga sarcomere längden visar en skarp röd topp, starta inspelningen (Figur 2A, lägre bild).
Både sarkomeren längd och intracellulära Ca2 + transie NTS (Fura-2 nyckeltal) registreras samtidigt från samma myocyter (figur 3A). Den genomsnittliga spår av sarcomere längd och Ca2 + transienter visas i figur 3B. Individuellt, diastoliska / systoliska sarcomere längder, tid till topp (PT), och sarcomere förkortning mäts för att undersöka amplituden och dynamik myocyt kontraktilitet. Tid till 50% relaxation (TR 50) analyseras för att bedöma uppmjukning av myocyt. På samma sätt, det diastoliska och systoliska Fura-2 förhållanden (Ca2 + transienter), tid till topp (PT) av Ca 2 + transienter och tidskonstanten för Ca 2 + övergående sönderfalls (tau) analyseras för att bedöma myocyte kontraktion och avslappning (Tabell 1). I detta exempel, är amplituderna för Ca 2 + transienter måttligt förhöjda i LV myocyter från en hypertensiv råtta och kontraktion är måttligt reducerad (figur 3B och tabell 1).
innehåll "fo: keep-together.within-page =" 1 "> Dessutom relationerna mellan Fura - är två förhållande och sarcomere längd (anger myofilament Ca2 + känsligheten hos LV myocyter) plottas i både sken och hypertensiva råttor ( fig. 3C) den Fura 2 - sarcomere längd bana under relaxafasen av myocyt definierar en kvasi-jämvikt cytosolen Ca2 +, myofilament Ca2 + bindning, och sarcomere längd 14, och därför är det avkoppling fasen jämförs mellan de två grupper. den högerförskjutning av banan i myocyter från hypertensiva gruppen visar en reducerad myofilament svar på Ca 2 + (Figur 3C). Följaktligen den intracellulära Ca2 + -koncentrationen som krävs för halv relaxation (EC50) ökas (figur 3C) , med hänvisning till myofilament Ca2 + -desensitization vid hypertoni.Figur 1. Rutiner för att isolera LV myocyter från råtthjärta. (A) Den Langendorff perfusion system som används för att perfundera isoleringslösning in i hjärtat kanyler via aortan (infälld, förstorad bild av den monterade hjärta på perfusionssystemet) (B) i - iii:. Hjärtat efter digerering med kollagenas lösning 1 och dissekerades LV vävnad i en skål och kolv (B) IV - VI.. myocyt suspension efter tillsats av kollagenas lösning 2, myocyt pellet efter centrifugering och återsuspenderas myocyt pelleten i förvaringslösning (B) vii: Inkubation inkubera LV myocyter i Fura 02:00 - innehållande isolering lösning (2 iM Fura 02:00, 250 iM Ca2 + och med 2 pl poloxamer 407); wash-out, tvätta LV myocyter med isoleringslösning med 500 | iM Ca2 +; lagring, hålla Fura-02:00 - laddade LV myocyter ifärsk isolering lösning innehållande 500 | iM Ca2 +. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 2. Mätning av sarcomere matfett och Fura-2-förhållande (indikativ för den intracellulära Ca2 + nivå). (A) Ett diagram över sarcomere, en bild av en Fura-2 -loaded LV myocyt och den genomsnittliga sarcomere längd (den röda topp) visas på datorn. I den nedre panelen, är den svarta linjen genomsnittet av varje horisontell pixellinje inom den lila regionen av intresse. Den blå linjen är samma data nollställas vid varje ände. Den röda linjen är den snabba Fouriertransformen (FFT) kraftspektrum, som representerar antalet signaler FFT har beräknats. En skarp peak innebär en ren sarcomere inspelning. (B) Samtidiga inspelningar av sarcomere längd och Fura -2 förhållandet som svar på fältstimulering (2 Hz). (C) Fas-plan tomt i Fura 2 förhållandet vs sarcomere längd av samma LV myocyt (observera att både den faktiska längd / Fura 2 förhållandet och delta förändringar i dessa parametrar analyseras). EC50 (Fura 2 uppgick vid 50% avslappning, cirkel indikeras av pilen) är kvalitativ jämförelse av myofilament Ca2 + känslighet mellan grupperna. Klicka här för att se en större version av denna siffra.
Figur 3. Representativa resultat av analysen av LV myocyt kontraktion i sken och hypertensiva råttor. (A) Raw spår av sarcomere shortening och Fura - 2 förhållande mätning i LV myocyter från bluff och hypertensiva råttor (B) Genomsnittliga spår av sarcomere längd och Fura -. 2 signaler. Parametrar analyseras i genomsnitt spåren visas i tabell 1. (C) Fas-plan tomter av Fura - 2 förhållande vs. sarcomere längd (både den faktiska längden och Fura - 2 förhållandet och delta förändringar i dessa parametrar) i de två grupperna . Banan slinga skiftas till höger och EC50 tenderar att vara högre i högt blodtryck, vilket tyder på myofilament Ca2 + hyposensibilisering. PT, tid till topp (s); Tau, tidskonstant av Ca2 + gående förfall (sek) (erhållen genom att montera nedgången fasen av Fura - 2 förhållande med en exponentiell funktion) .TR 50: tid till 50% relaxation (s). 
Klicka här för att se en större versionav denna siffra.
| parametrar | Bluff | hypertoni | |
| Intracellulära Ca2 + | Diastoliskt Ca 2 + | 1,189 | 1,124 |
| Systoliskt Ca 2 + | 1,71 | 1,691 | |
| Amplitud (Δ-förhållande) | 0,521 | 0,567 | |
| Tid till topp (PT, s) | 0,021 | 0,031 | |
| Tau (n) | 0,079 | 0,076 | |
| sarcomere | diastoliskt | 1,758 | 1,78 |
| sarcomere längd (^ m) | |||
| sarcomere | 0,122 | 0,115 | |
| förkorta (16; längd, mm) | |||
| Tid till topp (PT, s) | 0,064 | 0,055 | |
| Tid till 50% | 0,032 | 0,03 | |
| Relaxation (TR 50, s) | |||
| EC50 | [Ca2 +] i (Fura-2-förhållande) för 50% sarcomere relengthening | 0,2382 | 0,3224 |
Tabell 1. Analys av Fura - 2 ratio (intracellulär Ca2 +) och sarcomere längdmätning.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Discussion
Här beskriver vi de protokoll för att bedöma förändringar av myofilament Ca2 + känslighet i en enda isolerad hjärt myocyte och betonar vikten av att mäta denna parameter tillsammans elektrofysiologiska egenskaper, intracellulära Ca2 + transienter, och myofilament dynamik. Detta beror på att inspelningar av en eller två av de parametrar som inte kan explicate mekanismerna bakom hjärtsammandragning och avkoppling. Till skillnad från konventionella metoder som mäter myocyte kontraktion och den intracellulära Ca2 + profil individuellt 1, den nuvarande metoden undersöker båda parametrarna samtidigt i samma hjärtmyocyter.
Ett antal metoder används vanligen för att bedöma myofilament Ca2 + känsligheten hos muskler eller myocyter 15,16,17, t.ex., undersökning av växelverkan mellan exogen Ca2 + och sarcomere / cell längd / spänningar i flådda myocyter(Behandlade med detergenter såsom saponin eller β-ESIN att permeabilisera membranet). Längder mäts med fotodiod och laserstråle diffraktion tekniker, och spänning med kraftgivare eller kolfibrer). Dessa tekniker används i stor utsträckning muskel studier därför att de gör det möjligt kvantitativa bedömningar av myofilament Ca2 + känslighet. Men endogena jonkanal aktiviteter i plasmamembranet och intracellulära Ca2 + hantering, som krävs för att initiera mekanik myofilament, försummas i dessa tekniker. Dessutom muskelremsor eller myocyter som undersöks är försträckt till en viss diastoliskt längd, och under dessa förhållanden kan den initiala sarcomere längd skilja sig från den verkliga diastoliska längden på myocyter (särskilt i sjukdomstillstånd och med interventioner). Detta belyser fördelen med strömmätning där cellulära organeller förbli relativt oberörd därmed möjliggör omfattande utväration av myocyt kontraktila funktion.
Förståeligt, kvaliteten på de myocyter (Ca2 + -tolerating) och den optimala last av Fura - 2AM är två nyckelfaktorer för framgångsrik bedömning av myofilament Ca2 + känslighet. Följaktligen är flera ändringar tillämpas på protokoll för att få livskraftiga stavformade myocyter (60-80% av den totala celler, som beskrivits tidigare 18,19,20). För det första är en låg dos av Ca2 + till lösningarna under rötningsprocesser (t.ex., är den Ca2 + -koncentrationen 50 pM i kollagenas lösningar och 200 | iM i lagringslösning). För det andra, under rötningsprocessen är BSA sattes till kollagenas lösningar för att förbättra membranstabiliteten. Tredje, de flesta av de lösningar är syresatt under isolering, vilket ökar den andel av funktionella myocyter och varaktigheten av de experiment (6-8 h). För det fjärde är isolerade myocyter förvaras i förvaringslösning containing 200 iM Ca2 +.
Att erhålla optimal lastning med Fura 02:00, är två olika Ca 2 + koncentrationer (250 och 500 ^ m) som används och poloxamer 407 (2 | il, 20% framställd i dimetylsulfoxid) tillsätts för att öka permeabiliteten hos Fura-02:00 genom membranet och dess stabilitet i muskelceller. Det bör noteras att alla Ca2 + indikator färgämnen är Ca2 + buffertar 21. Därför bör forskare undvika att använda en hög koncentration av Fura-2 AM eller en längre inkubationstid för att undvika överdriven buffring och minskad myocyt kontraktilitet. Det rekommenderas att myocyt kontraktion utan Fura - två lastrutinmässigt kontrolleras, vilket är ett viktigt steg för att uppskatta kvaliteten på myocyt och laddningsstatus. Variabilitet i lastning är oundviklig. Därför är det viktigt att kontrollera variabiliteten i myocyt kontraktion, bestämt huruvida antalet contracting myocyter i kammaren liknar före och enfter lastning. Analys av hyper- eller hypo avtalsslutande myocyter bör undvikas eftersom de inte utgör den genomsnittliga status myocyter och kan orsaka snedvridna resultat och utvärderingar.
Det bör noteras att de uppmätta förändringarna i Fura 2-förhållande är reflektioner av den intracellulära Ca2 + nivå, snarare än den faktiska kemiska koncentrationen av Ca 2 +. Därför den här beskrivna metoden utvärderar kvalitativa förändringar av myofilament Ca2 + känsligheten, snarare än den faktiska känsligheten hos myofilament till Ca2 +. Kalibrering av Fura - 2 signal till intracellulära Ca2 + -koncentrationen är lösningen att förvärva tillförlitliga Ca2 + koncentrationer i enskilda myocyter. Kalibreringsproceduren kräver lastning myocyter med olika koncentrationer av Ca2 + konjugerad Fura - 02:00 (Ca koncentration 2+ sträcker sig 0-39 M), och den erhållna Fura - 2 måtten är beräknade med the följande formel: [Ca2 +] i = Kd * (R - Rmin) / (Rmax - R) * F380max / F380min 21. Det är möjligt att härleda de sammanslagna medelvärden av Ca2 + koncentrationer genom ett sådant kalibreringsförfarande. Emellertid, därför att laddningen av Ca2 + indikatorer är variabel bland myocyter och kalibrering utförs inte i en individuell cell, Ca2 + halter kan inte förvärvas exakt. Dessutom, om F360 / F380 mäts snarare än F340 / F380 (som i föreliggande studie), är Fura 2-förhållande mindre noggranna (eftersom F360 är den isobestisk våglängd av Fura-2 fluorescens 22). Det är dock fortfarande en giltig metod för att bedöma kvalitativa förändringar i myofilament Ca2 + känsligheten i fysiologiska experiment, särskilt i sjuka människors hjärtan, där myofilament kan samtidigt ändras efter förändringar i den intracellulära miljön. Det rekommenderas att denna metod kombineras med alternativa metoder (som debeskrivs tidigare i diskussionen avsnitt) att exakt analysera den verkliga känslighet myofilament till Ca2 +.
Den andra begränsningen av metoden i studien av myocyt kontraktion är obelastat tillstånd. Det kan underskatta eller överskatta de förändringar i myofilament Ca2 + känslighet. Därför att noggrant utvärdera myofilament Ca2 + känslighet, bör analys utföras med alternativa mätningar för både kvalitativ och kvantitativ bedömning.
Tekniken är tillämplig för att bedöma hjärtmuskelfunktion hos friska och sjuka hjärtan, inbegripet mänskliga hjärtprover, där den cellulära redox miljön och posttranskriptions modifieringar ändras, vilket resulterar i åtföljande förändringar i myofilament funktioner. I synnerhet jonkanaler, intracellulär jon homeostas och regulatoriska proteiner i myofilament är interaktiva; Därför är alla dessa komponenter fungerar i concert för att bestämma hjärtprestanda in vivo (t.ex. mätt i ekokardiografi).
Sammanfattningsvis beskriver vi en metod för att utvärdera förändringarna i myofilament Ca2 + känslighet och betonar vikten av att analysera denna parameter i samband med hjärtats elektrofysiologi, intracellulär Ca2 + hantering och myocyt kontraktion för att erhålla en fullständig profil myocyt funktion. Myofilament Ca2 + känsligheten bör mätas rutinmässigt i mekanistiska studier med sjuka hjärt modeller, där förändringar i dessa parametrar samt olika intracellulära signalvägar är kopplade till varandra.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Acknowledgments
Denna forskning stöds av Basic Science Research Program genom National Research Foundation of Korea (NRF) som finansieras av ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik (2013068067); av hjärnan Korea 21 Graduate Program för koreanska ministeriet för utbildning, vetenskap och teknik, Seoul National University Hospital, den koreanska Society of Hypertension (2013), SK Telecom Research Fund (nr. 3420130290) och från National Natural Science Foundation i Kina (NSFC 31460265; NSFC 81260035).
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Sprague Dawley rat | Koatech | 8-12 weeks | |
| Pentobarbital Sodium | Hanlim Pharmaceutical (Korea) | AHN901 | Insurance code:645301220 |
| NaCl | Sigma | S9625 | |
| KCl | Sigma | P4504 | |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | |
| HEPES | Sigma | H3375 | |
| Glucose | Sigma | G8270 | |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | |
| Mannitol | Sigma | M4125 | |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | |
| Taurine | Merck | 8.08616.1000 | |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | |
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | |
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | |
| Protease | Sigma | P6911 | |
| Fura-2 (AM) | Molecular Probes | F1221 | |
| Pluronic F127 20% solution in DMSO | Invitrogen | P3000MP | |
| Shaking Water Bath | Chang Shin Scientific | Model: C-108 | |
| IonWizard Softwae Suite | IonOptix Ltd | Experimental Builder | Acquisition and Analysis of EC Coupling Data in Myocytes |
| Myocyte Calcium & Contractility Recording System | IonOptix Ltd | ||
| Circulating Water Bath | BS-Tech | BW2-8 | |
| Myocyte Fluorescence Microscope | Nikon | DIATPHOTO 200 | |
| MyoCam-S Power | IonOptix | ||
| Fluorescence & Video Detection | IonOptix | MyoCam-S | |
| CFA300 | |||
| PMT400 | |||
| Fluorescence & System Interface | IonOptix | FSI700 | |
| Excitation Light Source | IonOptix | mSTEP | |
| High intensity ARC Lamp Power supply | Cairn Reseach | ||
| Filter wheel controller | IonOptix | GB/MUS200 | |
| Digital Stimulator | Medical Systems Corportion | S-98 Mutimode | |
| Compositions of Experimental Solutions | |||
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| Isolation Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 135 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 5 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5 |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 3.5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Na2HPO4 | Sigma | 71649 | Concentration (mmol) 0.4 |
| Storage Solution (pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 120 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 5.4 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.2 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 29 |
| MgSO4 | Sigma | M5921 | Concentration (mmol) 5 |
| Sodium Pyruvate | Sigma | P2256 | Concentration (mmol) 5 |
| Taurine | Sigma | CB2742654 | Concentration (mmol) 20 |
| Perfusion Solution (Tyrode solution, pH: 7.4, NaOH) | |||
| NaCl | Sigma | S9625 | Concentration (mmol) 141.4 |
| KCl | Sigma | P4504 | Concentration (mmol) 4 |
| NaH2PO4 | Sigma | S8282 | Concentration (mmol) 0.33 |
| HEPES | Sigma | H3375 | Concentration (mmol) 10 |
| Glucose | Sigma | G8270 | Concentration (mmol) 5.5 |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1.8 For Fura 2AM loading, CaCl2 concentrations are 0.25 mM and 0.5 mM |
| MgCl2 | Biosesang | M2001 | Concentration (mmol) 1 |
| Mannitol | Sigma | M4125 | Concentration (mmol) 14.5 |
| Collangenase Solution 1 | |||
| Isolation Solution (30mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 5 ml) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| Protease | Sigma | P6911 | Concentration (mmol) 0.1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| Collangenase Solution 2 | |||
| Isolation Solution (20mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin (BSA solution 3.3 mL) | Concentration (mmol) 1.67 mg/mL | ||
| Collagenase Type 2 | Worthington | LS004177 | Concentration (mmol) 1 mg/mL |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 0.05 mM |
| BSA solution | |||
| Isolation Solution (40mL) | |||
| Bovine Fetal Albumin | Sigma | A7906 | Concentration (mmol) 400 mg |
| CaCl2 | Biosesang | C2002 | Concentration (mmol) 1mM |
References
- Bers, D. M., et al.
- Eisner, D. A., et al. Integrative analysis of calcium cycling in cardiac muscle. Circ Res. 87 (12), 1087-1094 (2000).
- Palmiter, K. A., et al. Molecular mechanisms regulating the myofilament response to Ca2+: implications of mutations causal for familial hypertrophic cardiomyopathy. Basic Res Cardiol. 92 (S1), 63-74 (1997).
- Missiaen, L., et al. Abnormal intracellular Ca2+ homeostasis and disease. Cell Calcium. 28 (1), 1-21 (2000).
- Trafford, A. W., et al. A novel, rapid and reversible method to measure Ca buffering and time-course of total sarcoplasmic reticulum Ca content in cardiac ventricular myocytes. Pflugers Arch. 437 (3), 501-503 (1999).
- Berlin, J. R., et al. Intrinsic cytosolic calcium buffering properties of single rat cardiac myocytes. Biophys J. 67 (4), 1775-1787 (1994).
- Robertson, S. P., et al. The time-course of Ca2+ exchange with calmodulin, troponin, parvalbumin, and myosin in response to transient increases in Ca2+. Biophys J. 34 (3), 559-569 (1981).
- Schober, T., et al. Myofilament Ca2+ sensitization increases cytosolic Ca2+ binding affinity, alters intracellular Ca2+ homeostasis, and causes pause-dependent Ca2+-triggered arrhythmia. Circ Res. 112 (2), 170-179 (2012).
- Briston, S. J., et al. Balanced changes in Ca buffering by SERCA and troponin contribute to Ca handling during β-adrenergic stimulation in cardiac myocytes. Cardiovasc Res. 104 (2), 347-354 (2014).
- Patel, B. G., Wilder, T., John Solaro, R. J., et al. Novel control of cardiac myofilament response to calcium by S-glutathionylation at specific sites of myosin binding protein C. Front Physiol. 4, 336 (2013).
- Jin, C. Z., et al. Myofilament Ca2+ desensitization mediates positive lusitropic effect of neuronal nitric oxide synthase in left ventricular myocytes from murine hypertensive heart. J Mol Cell Cardiol. 60, 107-115 (2013).
- Wang, Y., et al. Modulation of L-type Ca2+ channel activity by neuronal nitric oxide synthase and myofilament Ca2+ sensitivity in cardiac myocytes from hypertensive rat. Cell Calcium. 58 (3), 264-274 (2015).
- Louch, W. E., Sheehan, K. A., Wolska, B. M., et al. Methods in cardiomyocyte isolation, culture, and gene transfer. J Mol Cell Cardiol. 51 (3), 288-298 (2011).
- Spurgeon, H. A., et al. Cytosolic calcium and myofilaments in single rat cardiac myocytes achieve a dynamic equilibrium during twitch relaxation. J Physiol. 447, 83-102 (1992).
- Preston, L. C., et al. Functional effects of the DCM mutant Gly159Asp troponin C in skinned muscle fibres. Pflugers Arch. 453 (6), 771-776 (2007).
- Willott, R. H., et al. Mutations in Troponin that cause HCM, DCM AND RCM: what can we learn about thin filament function? J Mol Cell Cardiol. 48 (5), 882-892 (2010).
- Yasuda, S. I., et al. A novel method to study contraction characteristics of a single cardiac myocyte using carbon fibers. Am J Physiol Heart Circ Physiol. 281 (3), H1442-H1446 (2001).
- Sears, C. E., et al. Cardiac neuronal nitric oxide synthase isoform regulates myocardial contraction and calcium handling. Circ Res. 92 (5), e52-e59 (2003).
- Ashley, E. A., et al. Cardiac nitric oxide synthase 1 regulates basal and beta-adrenergic contractility in murine ventricular myocytes. Circulation. 105 (25), 3011-3016 (2002).
- Zhang, Y. H., et al. Reduced phospholamban phosphorylation is associated with impaired relaxation in left ventricular myocytes from neuronal NO synthase-deficient mice. Circ Res. 102 (2), 242-249 (2008).
- Roe, M. W., Lemasters, J. J., Herman, B., et al. Assessment of Fura-2 for measurements of cytosolic free calcium. Cell Calcium. 11 (2-3), 63-73 (1990).
- Grynkiewicz, G., et al. A new generation of Ca2+ indicators with greatly improved fluorescence properties. J Biol Chem. 260 (6), 3440-3450 (1985).
