Um exemplo de terapia genética adenoviral nas córneas cultivadas de órgãos diabéticos humanos é apresentado para a normalização da cicatrização tardia de feridas e expressão de marcadores de células-tronco epiteliais marcadamente reduzida nessas córneas. Também descreve a otimização desse processo em culturas epiteliais límbicas enriquecidas com células-tronco.
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Artigo de método
Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste protocolo é descrever as alterações moleculares em córneas diabéticos humanos e demonstrar como eles podem ser aliviados pela terapia de gene adenoviral em córneas de órgãos-cultivadas. A doença da córnea do diabético é uma complicação da diabetes com alterações frequentes de nervos da córnea e cicatrização epitelial. Nós também documentaram expressão significativamente alterada de vários marcadores de células-tronco epiteliais putativos em córneas diabéticos humanos. Para atenuar estas alterações, a terapia de gene adenoviral foi implementado com sucesso utilizando a regulação positiva da expressão do proto-oncogene c-met e / ou a regulação negativa da matriz proteinases metaloproteinase-10 (MMP-10) e catepsina F. Esta terapia acelerou a cicatrização em córneas diabéticos mesmo quando apenas o compartimento de células-tronco do limbo foi transduzida. Os melhores resultados foram obtidos com o tratamento combinado. Para possível transplante de paciente de células-tronco normalizados, um exemplo também é apresentada do optimizatina transdução de gene nas culturas enriquecidas com células-tronco usando potenciadores policati�icos. Esta abordagem pode ser útil não só para os genes seleccionados, mas também para os outros mediadores de cicatrização do epitélio da córnea e a função das células-tronco.
Introdução
A doença da córnea diabética resulta principalmente no epitélio degenerativa (Ceratopatia) e nervosas mudanças (neuropatia). Ele é muitas vezes manifestada pelas anormalidades de cicatrização de feridas epiteliais e redução dos nervos da córnea 1-4. Estima-se que 60-70% diabéticos têm vários problemas de córnea 1,3. Os nossos estudos identificaram várias proteínas marcadoras com expressão alterada em córneas diabéticos humanos, incluindo a regulação negativa de (receptor do factor de crescimento de hepatócitos) c-met proto-oncogene e a regulação positiva de metaloproteinase de matriz-10 (MMP-10) e a catepsina F 5, 6. também têm documentado diminuição da expressão de vários marcadores de células estaminais epiteliais córneas putativos nos diabéticos humanos significativamente.
Nos estudos anteriores, nós desenvolvemos uma terapia de gene adenoviral à base para normalizar os níveis de marcadores alterou-diabetes usando sistema de cultura de órgãos humanos diabéticos da córnea, que mostra cicatrização lenta, diabéticaalterações marcador, e a redução da expressão do marcador de células semelhantes às ex vivo córneas 7,8 haste. Esta persistência de alterações parece ser devida à existência de memória metabólica epigenética 9. Este sistema de cultura foi ainda utilizado para a terapia genética. Os alvos para a presente terapia foram escolhidos a partir de marcadores, quer com uma expressão reduzida em córneas diabéticos (c-met proto-oncogene), ou o aumento da expressão (MMP-10 e a catepsina F).
A terapia adenoviral (AV) foi usada em todo o córneas de órgãos-cultivadas ou apenas o compartimento de limbo periférica córneo. Este compartimento abriga células-tronco epiteliais que renovar o epitélio corneano e participar activamente na cicatrização de feridas 4,10-15. Aqui, os protocolos são fornecidos para a cultura normal e diabética humana córnea órgão, cicatrização de feridas epiteliais, o isolamento e caracterização das culturas de células do limbo enriquecida em células estaminais e células adenoviral e transdução da córnea. Nossoresultados mostram a viabilidade desta terapia para normalizar a expressão do marcador e cicatrização de feridas em diabéticos córneas para transplante possível futuro. Eles também sugerem que a terapia de combinação é a maneira mais eficaz para restaurar o padrão de marcadores normal e cicatrização do epitélio da córnea diabética 16-18.
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Protocolo
Doença National Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) fornecido consentidos post mortem saudáveis e diabéticos olhos humanos e córneas. protocolo de recolha de tecido humano do NDRI é aprovado pela comissão de gestão e sujeitas a Institutos Nacionais de Saúde supervisão. Esta pesquisa foi conduzida sob o Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board aprovado (IRB) protocolo isenta EX-1055. Colaborando cirurgiões da córnea, Drs. E. Maguen e Y. Rabinowitz, fornecido jantes córneo de descarte para o isolamento de culturas epiteliais da córnea enriquecida com células-tronco. Esta pesquisa foi conduzida no âmbito do protocolo IRB aprovado Pro00019393.
1. Cultura de Órgãos de córnea humana
Nota: córneas normais e diabéticos ou olhos inteiros são recebidos em meio de armazenamento corneal refrigerados (por exemplo, Optisol GS) no prazo de 48 horas após a morte do fornecedor nacional NDRI.
- Retire as córneas de recipiente de armazenamento com uma pinça e lavá-los duas vezes in a (ABAM) mistura de antibiótico-antimicótico. Em caso de olhos inteiros, cortar as córneas para fora dos globos com tesoura curva. Deixe pelo menos um aro conjuntival 5 mm e também lavar as córneas em ABAM.
- Preparar a mistura a ser colocado na concavidade da córnea. Consiste em meio isento de soro mínimo essencial (MEM) contendo ABAM, 1 mg / ml de vitelo pele colagénio (feita a partir de uma solução estoque de 10 mg / ml em ácido 0,1 N acético), 1% de ágar, e insulina-transferrina-selenite complementar 7.
- Microondas esta mistura até à ebulição durante a esterilização e de dissolução do agar. Pode demorar até 1 minuto para que tudo se dissolver. Deixe a tampa do tubo parcialmente aberto porque a mistura transborda facilmente quando ferve. Por esta razão, vários ciclos de ebulição pode ser necessária, para cada 10-15 seg. Arrefecer a mistura a 37-39 ° C.
- Coloque as córneas lado epitelial para baixo em 60 mm pratos estéreis. Encher a concavidade da córnea com cerca de 0,5 ml da mistura descrita no ponto 1.2. omistura solidifica sobre as córneas dentro de 2 min.
- Coloque as córneas lado de agar para baixo em pratos estéreis de 60 mm e adicionar o meio completo contendo MEM com ABAM, e insulina-transferrina-selenite suplemento 7 (37 ° C) para manter o seu nível de aproximadamente no limbo para a cultura de interface ar-líquido. O volume médio é de 7-8 ml por placa.
- Colocar as cápsulas com as córneas em uma incubadora de CO 2 a 5% humidificada com uma panela de água (desta forma, o nível de humidade é mantida a ou acima de 95%) a 35 ° C (temperatura normal da córnea). Adicionar 100 � de meio (duas gotas) por dia no epitélio para umedecer as córneas.
- Monitorar a morfologia da córnea e da viabilidade das células epiteliais microscopicamente sob luz transmitida através de um microscópio padrão com um objetivo 4X. Faça isso uma vez por dia.
- Mudar o meio de três em três dias. As córneas podem ser cultivadas por pelo menos três semanas. Para as experiências de terapia genética, as córneas de cultura durante 3-5 dias, em seguida, transduce com genes de interesse (4,1-4,4), deixe por mais 3-5 dias, dependendo do transgene e sujeito ao protocolo de cicatrização de feridas (2,1-2,4).
2. cicatrização do epitélio da ferida
Nota: nas córneas diabéticos, o desbridamento epitelial por raspagem mecânica não é viável porque a membrana basal epitelial frágil é separado no processo, o que não acontece nas córneas normais. Assim, para manter as córneas normais e diabéticos em condições semelhantes de cicatrização de feridas, a remoção química do epitélio com n-heptanol 19 é usado. Este procedimento remove o epitélio mas deixa para trás uma membrana basal intacto em ambos os córneas normais e diabéticos.
- Para executar o desbridamento epitelial central 20, colocar um disco de papel de filtro de 5 milímetros embebidos em n-heptanol na superfície anterior da córnea central para 75 seg.
- Remover o filtro e lava-se as córneas em meio completo. Preencher a concavidade com 0,5 ml de agar-colágenomistura e da cultura como em 1.4. Após desbridamento, as células epiteliais geralmente morrem e descamam deixando para trás membrana basal microscopicamente intacta 7.
- Use 8,5 mm discos para criar feridas epiteliais maiores nos experimentos apenas com terapia genética limbo. Isso irá garantir o envolvimento de células-tronco do limbo no processo de cura.
- Monitorar a cicatrização da córnea microscopicamente. Fazer fotografias em 4x e 10x todos os dias até que o defeito epitelial é completamente curado. O processo de cura pode tomar a partir de 2 a 15 dias, dependendo do estado (normal ou diabética) e o tamanho da ferida.
Nota: Durante o processo de cura, as células de aranha preto são observados no plano focal superior. Estas células são apoptóticas ceratócitos de estroma que morreram após a remoção do epitélio 4. A cura é considerado completo quando essas células mortas são cobertas pelo epitélio cura e não são mais visíveis (Figura 2, inserção). - após a curaconclusão, cortar as córneas no meio, incorporá-los em composto OCT e processo para imunofluorescência indireta em seções criostato ou Western blot 16,21.
3. Isolamento de células do limbo e manutenção de tronco culturas enriqueceram-Cell
Nota: Preparar a célula primária limbo epitelial haste (LESC) culturas enriquecido a partir das bordas córneo. As jantes provenientes de doadores saudáveis e descartados após transplantes de córnea são recebidas dos cirurgiões que colaboram no meio de armazenamento corneal padrão (por exemplo, Optisol). Caso contrário, as culturas enriquecidas com Lesc Website pode ser obtido a partir das bordas de córneas excisadas inteiros normais e diabéticos ou globos recebido de NDRI no meio de armazenamento corneal.
- Se forem utilizadas as córneas inteiros ou globos, em primeiro lugar isolar as áreas límbicas. Para fazer isso, colocar a córnea em um prato de plástico estéril, com o lado epitelial para cima e remover a área central com uma trépano de 9 mm (faca circular da córnea).Descarte essa parte central. Então extirpar a zona de limbo usando uma trefina 13 mm e descartar a parte conjuntival exterior. células para isolar usar a borda do limbo do bagel-like. Antes de isolamento de células, remover as células endoteliais e aderentes remanescentes da íris a partir do lado interior da córnea de frente para o epitélio de superfície com uma mecha de algodão estéril.
- Isolar folhas de células do limbo usando tratamento dispase. Incubar cada halos com 2,4 U / ml de dispase II em 1,5 de meio isento de soro ml de queratinócitos (KSFM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) a 37 ° C durante 2 h 22.
- Suavemente aliviar a camada de células epiteliais do limbo fora do aro sob um microscópio de dissecação com uma pinça de estéreo e dissociar as células em 1 ml de tripsina a 0,25% - solução de EDTA 0,02% durante 30 min à temperatura ambiente.
- Lavam-se as células em 10 ml de meio (por exemplo, Epilife) e sedimentar-los a 300 xg numa centrifugadora de bancada durante 5 minutos a temperatura ambiente.
- th Ressuspendae células em meio de cultura: meio com N2, B27 e suplementos de crescimento de queratinócitos humanos, e factor de 10 ng / mL de crescimento epidérmico (EGF).
- Semear as células a 3.000-5.000 células / ml em frascos ou placas de 60 mm revestidas com uma mistura de proteínas de membrana basal humana, incluindo f ibronectina, colagénio tipo IV, laminina e (FCL), a 0,5-1 ug / cm 2, na KSFM médio.
- Cultura das células numa atmosfera humidificada (95% ou mais de humidade) incubador de CO2 a 37 ° C até formarem monocamadas confluentes totalmente. Isso pode demorar 1-2 semanas.
Nota: Regularmente confirmar a identidade da célula por coloração imunocitoquímica positiva para os marcadores Lesc Website putativos incluindo PAX6, queratina (K) 14, K15, K17, e ΔNp63α. Os detalhes de coloração, incluindo os anticorpos primários foram publicados 8,16-18,22. - Para passagem, as células confluentes, tratá-los com uma solução de 1 ml de 0,05% de tripsina (1: diluição da solução a 0,25% 5) durante 10 min a 37 ° C. Adicionar 5 ml tr sojasolução de inibidor ypsin (10 mg / ml) diluído a 1: 4 em meio, e centrifuga-se as células como em 3.5.
- Lava-se a pelete de células em 3 ml de solução de inibidor de tripsina de soja diluída. Placa as células nas FCL-revestido (ver 3.7) pratos ou lâminas de câmara de vidro em 2 x 10 4 células / ml.
4. Transdução adenoviral de córneas Órgão-cultura
Nota: Os adenovírus recombinantes (AV) incluem AV-vector (sem gene inserido), AV-c-met (com o gene de leitura aberta de c-met), AV-shM10 (com shRNA para MMP-10) e AV-SHCF ( com shRNA para catepsina F). Eles são E1 / E3 suprimida-tipo 5 AV expressar genes sob o controle do principal promotor precoce imediato de citomegalovírus. Os vírus AV-c-met são gerados usando vector AV pad / CMV / V5-DEST 16. Os vírus AV-shRNA são personalizados gerada por subclonagem de sequências shRNA junto com o promotor HH1 e sequência tag GFP a partir iLenti-EGFP vetor em uma huma replicação-incompetentes (-E1 / -E3)n Tipo AV 5 genoma usando adeno-4 sistema de expressão 17.
- Transdução de uma córnea de órgãos-cultura de cada par com AV-vector e outra córnea, com um AV expressão gênica-modulação. Utilizar a AV-cMet em 0,8 a 1,25 x 10 8 unidades formadoras de placas (pfu) por córnea em meio de cultura durante 48 horas a 37 ° C mantendo as córneas sob a superfície do meio em cada poço de um prato de 24 poços. Use os vírus AV-shRNA a 1-2 x 10 8 pfu por córnea.
- Use os vírus para a transdução em meio completo suplementado com 75 ug / ml de citrato de sildenafil. Este reagente ativa o transporte caveolin facilitando a absorção viral pelas células epiteliais 21. Devido à curta meia-vida de sildenafil em soluções aquosas, re-adiciona a mesma quantidade ao meio de 4-5 horas mais tarde. O tratamento padrão é de 48 horas.
- Transferir córneas para novos pratos com uma extremidade espátula estéril redonda e cultura no meio sem AV mantendo o nível médio no limbo. Após o suplementoitional 4-8 dias na interface ar-líquido, processo as córneas tratadas com AV para diversas análises e testes para a cicatrização de feridas epiteliais (ver acima). Rotineiramente humedecer as córneas durante a cultura por meio de adição de 100 ul (duas gotas) em cima da córnea.
- Para a transdução de apenas as células do limbo, incubar os vírus com as córneas na interface ar-líquido com um nível médio no limbo, para evitar a transdução do epitélio central.
5. Transdução adenoviral de células cultivadas de limbo
- Manter as culturas LESC enriquecidos em meio contendo 10 ng / ml de EGF (ver 3.5) em placas de plástico revestidas com a mistura de FCL a 0,5 ug / cm2.
- Transduzir células cultivadas que atingiram 70-80% de confluência com o AV albergando o gene da proteína fluorescente verde (GFP-AV) ou shRNA-GFP em uma gama de multiplicidade de infecção mexidos-AV (MOI: 1-300 ufp / célula) , na forma com 2 ng / ml de EGF. Executar a transductioN, durante 4 h a 37 ° C num volume mínimo (0,2 ml) seguido por 20 h em 0,5 ml de meio. O sildenafil activador transporte caveolin não é necessária para a transdução de cultura de células.
- Utilizar um dos seguintes reagentes que facilitam a ligação à superfície da célula AV para melhorar a eficácia de transdução AV: ou policatiões (1 ug / ml de poli-L-lisina ou 5 ug / ml de polibreno), ou 6 ul / ml de reagente de transdução ( por exemplo, ViraDuctin), ou 20 ul / ml de intensificador de transdução (por exemplo, ibiBoost).
- Após substituição do meio por um sem o AV, incubar as células cultivadas durante 4 dias, na humidificada incubadora de CO 2 e avaliar o nível de expressão da GFP utilizando um microscópio de fluorescência invertido.
- Utilizar o ensaio de cicatrização da ferida zero para avaliar a migração celular nas culturas transduzidas-AV. Crescer as células nas lâminas de câmara de múltiplos poços. Faça as feridas em uma monocamada de células riscar em um movimento linear em linha reta com um pi 200 ulponta pette. Após o ferimento, mudar o meio para uma fresca para remover as células destacadas.
- Fotografar as feridas a cada dia com uma câmera digital ligada a um microscópio invertido em uma ampliação de 4X. Gravar o momento em que a cura é completa (os bordos da ferida entre em contacto ao longo de toda a ferida).
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Resultados
Nós mostramos anteriormente que nas culturas de órgãos da córnea, as diferenças na expressão de marcadores diabéticos (por exemplo, proteínas de membrana de base e α3β1 integrina) e cicatrização de feridas entre as córneas normais e diabéticos são preservadas. Este sistema de cultura foi submetido à terapia genética destinada a normalizar os níveis de marcadores alterou-diabetes, c-Met, MMP-10, e catepsina F.
Quando t...
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Discussão
A córnea parece ser um tecido ideal para terapia génica devido à sua localização em que a superfície de entrega de genes, bem como a avaliação de eficácia e efeitos secundários, são fáceis. No entanto, uma tradução clínica desta abordagem poderosa ainda é lenta devido à escassa informação sobre as causas genéticas das doenças da córnea e os alvos de terapia genética 24. Complicações diabéticas, incluindo alterações da córnea pode ser em grande parte epigenética na natureza, o que se traduz na memória metabóli...
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio financeiro do NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL) e subsídios do Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| meio essencial mínimo | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM mistura antibiótico-antimicótica | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| colágeno de pele de bezerro | Sigma-Aldrich | Ágar C9791 | |
| , grau de cultura de tecidos | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | Composto 72954-5ML-F | |
| O.C.T. | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| meio livre de soro de queratinócitos (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife meio com cálcio | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| suplemento médio N2, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 suplemento médio, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| suplemento de crescimento de queratinócitos humanos, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| tripsina 0,25% - EDTA 0,02% com vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| tripsina 0,25% com vermelho de fenol | de tripsina de soja 15050065 | Thermo Fisher Scientific | |
| Sigma-Aldrich | T6414 | ||
| soro fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulina-transferrina-selenita suplemento (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| anticorpo para queratina 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| anticorpo para queratina 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| anticorpo para queratina 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| anticorpo para Δ Np63&alfa; | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| anticorpo para PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| anticorpo para nidogênio-1 | R& D Systems | MAB2570 | |
| anticorpo para integrina &alfa; 3β 1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| fibronectina humana | BD Biosciences | 354008 | |
| laminina humana | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| colágeno humano tipo IV | Sigma-Aldrich | Adenovírus C6745-1ML | |
| expressando MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | personalizado | |
| expressando catepsina F shRNA | Capital BioSciences | ||
| expressando shRNA embaralhado e GFP | Capital BioSciences | ||
| expressando c-met | OriGene (plasmídeo) | SC323278 | |
| adenovírus expressando GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| citrato de sildenafil, 25 mg | Pfizer | de farmácia | |
| fator de crescimento epidérmico | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Alemanha | 50301 | |
| solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning espátula de extremidade redonda | Dow Corning | 3005 | |
| Placas de Petri de 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II lâminas de câmara multipoços | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μ l pontas de pipeta | Bioexpress | P-1233-200 | outros fornecedores disponíveis |
| microscópio invertido | Nikon | Diaphot | outros fornecedores/modelos disponíveis |
| incubadora de CO2 umidificado | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | outros fornecedores/modelos disponíveis |
| microscópio fluorescente | Olympus, Japão | BX-40 | outros fornecedores/modelos disponíveis |
| microscópio estéreo de dissecação | Leica, Alemanha | S4 E | outros fornecedores/modelos disponíveis |
Referências
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