Um exemplo de terapia genética adenoviral nas córneas cultivadas de órgãos diabéticos humanos é apresentado para a normalização da cicatrização tardia de feridas e expressão de marcadores de células-tronco epiteliais marcadamente reduzida nessas córneas. Também descreve a otimização desse processo em culturas epiteliais límbicas enriquecidas com células-tronco.
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Artigo de método
Adenoviral terapia genética para Diabetic Ceratopatia: Efeitos sobre a cicatrização de feridas e Stem Cell marcador expressão em humanos Corneas Organ-cultivadas e células epiteliais Limbal
Neste artigo
Resumo
Resumo
O objetivo deste protocolo é descrever as alterações moleculares em córneas diabéticos humanos e demonstrar como eles podem ser aliviados pela terapia de gene adenoviral em córneas de órgãos-cultivadas. A doença da córnea do diabético é uma complicação da diabetes com alterações frequentes de nervos da córnea e cicatrização epitelial. Nós também documentaram expressão significativamente alterada de vários marcadores de células-tronco epiteliais putativos em córneas diabéticos humanos. Para atenuar estas alterações, a terapia de gene adenoviral foi implementado com sucesso utilizando a regulação positiva da expressão do proto-oncogene c-met e / ou a regulação negativa da matriz proteinases metaloproteinase-10 (MMP-10) e catepsina F. Esta terapia acelerou a cicatrização em córneas diabéticos mesmo quando apenas o compartimento de células-tronco do limbo foi transduzida. Os melhores resultados foram obtidos com o tratamento combinado. Para possível transplante de paciente de células-tronco normalizados, um exemplo também é apresentada do optimizatina transdução de gene nas culturas enriquecidas com células-tronco usando potenciadores policati�icos. Esta abordagem pode ser útil não só para os genes seleccionados, mas também para os outros mediadores de cicatrização do epitélio da córnea e a função das células-tronco.
Introdução
A doença da córnea diabética resulta principalmente no epitélio degenerativa (Ceratopatia) e nervosas mudanças (neuropatia). Ele é muitas vezes manifestada pelas anormalidades de cicatrização de feridas epiteliais e redução dos nervos da córnea 1-4. Estima-se que 60-70% diabéticos têm vários problemas de córnea 1,3. Os nossos estudos identificaram várias proteínas marcadoras com expressão alterada em córneas diabéticos humanos, incluindo a regulação negativa de (receptor do factor de crescimento de hepatócitos) c-met proto-oncogene e a regulação positiva de metaloproteinase de matriz-10 (MMP-10) e a catepsina F 5, 6. também têm docume....
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Protocolo
Doença National Research Interchange (NDRI, Philadelphia, PA) fornecido consentidos post mortem saudáveis e diabéticos olhos humanos e córneas. protocolo de recolha de tecido humano do NDRI é aprovado pela comissão de gestão e sujeitas a Institutos Nacionais de Saúde supervisão. Esta pesquisa foi conduzida sob o Cedars-Sinai Medical Center Institutional Review Board aprovado (IRB) protocolo isenta EX-1055. Colaborando cirurgiões da córnea, Drs. E. Maguen e Y. Rabinowitz, fornecido jantes córneo de descarte para o isolamento de culturas epiteliais da córnea enriquecida com células-tronco. Esta pesquisa foi conduzida no âmbito do protocolo IRB aprovado Pro00019393.
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Resultados
Nós mostramos anteriormente que nas culturas de órgãos da córnea, as diferenças na expressão de marcadores diabéticos (por exemplo, proteínas de membrana de base e α3β1 integrina) e cicatrização de feridas entre as córneas normais e diabéticos são preservadas. Este sistema de cultura foi submetido à terapia genética destinada a normalizar os níveis de marcadores alterou-diabetes, c-Met, MMP-10, e catepsina F.
Quando t.......
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Discussão
A córnea parece ser um tecido ideal para terapia génica devido à sua localização em que a superfície de entrega de genes, bem como a avaliação de eficácia e efeitos secundários, são fáceis. No entanto, uma tradução clínica desta abordagem poderosa ainda é lenta devido à escassa informação sobre as causas genéticas das doenças da córnea e os alvos de terapia genética 24. Complicações diabéticas, incluindo alterações da córnea pode ser em grande parte epigenética na natureza, o que se traduz na memória metabóli.......
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Divulgações
Os autores declaram não ter interesses financeiros.
Agradecimentos
Agradecemos o apoio financeiro do NIH/NEI R01 EY13431 (AVL), CTSI grant UL 1RR033176 (AVL) e subsídios do Regenerative Medicine Institute, Cedars-Cedars Medical Center.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| meio essencial mínimo | Thermo Fisher Scientific | 11095-080 | |
| Optisol-GS | Bausch & Lomb | 50006-OPT | |
| ABAM mistura antibiótico-antimicótica | Thermo Fisher Scientific | 15240062 | |
| colágeno de pele de bezerro | Sigma-Aldrich | Ágar C9791 | |
| , grau de cultura de tecidos | Sigma-Aldrich | A1296 | |
| n-heptanol | Sigma-Aldrich | Composto 72954-5ML-F | |
| O.C.T. | VWR International | 25608-930 | |
| Dispase II | Roche Applied Science | 4942078001 | |
| meio livre de soro de queratinócitos (KSFM) | Thermo Fisher Scientific | 17005042 | |
| EpiLife meio com cálcio | Thermo Fisher Scientific | MEPI500CA | |
| suplemento médio N2, 100x | Thermo Fisher Scientific | 17502-048 | |
| B27 suplemento médio, 50x | Thermo Fisher Scientific | 17504-044 | |
| suplemento de crescimento de queratinócitos humanos, 100x | Thermo Fisher Scientific | S-001-5 | |
| tripsina 0,25% - EDTA 0,02% com vermelho de fenol | Thermo Fisher Scientific | 25200056 | |
| tripsina 0,25% com vermelho de fenol | de tripsina de soja 15050065 | Thermo Fisher Scientific | |
| Sigma-Aldrich | T6414 | ||
| soro fetal bovino | Thermo Fisher Scientific | 26140079 | |
| insulina-transferrina-selenita suplemento (ITS) | Sigma-Aldrich | I3146-5ML | |
| anticorpo para queratina 14 | Santa Cruz Biotechnology | sc-53253 | |
| anticorpo para queratina 15 | Santa Cruz Biotechnology | sc-47697 | |
| anticorpo para queratina 17 | Santa Cruz Biotechnology | SC-58726 | |
| anticorpo para Δ Np63&alfa; | Santa Cruz Biotechnology | sc-8609 | |
| anticorpo para PAX6 | BioLegend | PRB-278P-100 | |
| anticorpo para nidogênio-1 | R& D Systems | MAB2570 | |
| anticorpo para integrina &alfa; 3β 1 | EMD Millipore | MAB1992 | |
| fibronectina humana | BD Biosciences | 354008 | |
| laminina humana | Sigma-Aldrich | L4445 | |
| colágeno humano tipo IV | Sigma-Aldrich | Adenovírus C6745-1ML | |
| expressando MMP-10 shRNA | Capital BioSciences | personalizado | |
| expressando catepsina F shRNA | Capital BioSciences | ||
| expressando shRNA embaralhado e GFP | Capital BioSciences | ||
| expressando c-met | OriGene (plasmídeo) | SC323278 | |
| adenovírus expressando GFP | KeraFAST | FVQ002 | |
| citrato de sildenafil, 25 mg | Pfizer | de farmácia | |
| fator de crescimento epidérmico | Thermo Fisher Scientific | PHG0311 | |
| poli-L-lisina | Sigma-Aldrich | P4707 | |
| polybrene | Sigma-Aldrich | 107689-10G | |
| ViraDuctin | Cell Biolabs | AD-200 | |
| ibiBoost | ibidi, Alemanha | 50301 | |
| solução salina tamponada com fosfato (PBS) | Thermo Fisher Scientific | 10010049 | |
| Corning espátula de extremidade redonda | Dow Corning | 3005 | |
| Placas de Petri de 60 mm | Thermo Fisher Scientific | 174888 | |
| Nunc Lab-Tek II lâminas de câmara multipoços | Sigma-Aldrich | C6807 | |
| 200 μ l pontas de pipeta | Bioexpress | P-1233-200 | outros fornecedores disponíveis |
| microscópio invertido | Nikon | Diaphot | outros fornecedores/modelos disponíveis |
| incubadora de CO2 umidificado | Thermo Fisher Scientific | 370 (Steri-Cycle) | outros fornecedores/modelos disponíveis |
| microscópio fluorescente | Olympus, Japão | BX-40 | outros fornecedores/modelos disponíveis |
| microscópio estéreo de dissecação | Leica, Alemanha | S4 E | outros fornecedores/modelos disponíveis |
Referências
- Bikbova, G., Oshitari, T., Tawada, A., Yamamoto, S. Corneal changes in diabetes mellitus. Curr Diabetes Rev. 8 (4), 294-302 (2012).
- Calvo-Maroto, A. M., Perez-Cambrodí, R. J., Albarán-Diego, C., Pons, A., Cerviño, A. Optical quality of the diabetic eye: a review. Eye (Lond). 28 (11), 1271-1280 (2....
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Reimpressões e permissões
