Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

Summary

Este trabalho apresenta um método de triagem de alto rendimento usando um sistema universal de triagem enzimática genética que pode ser teoricamente aplicado a mais de 200 enzimas. Aqui, o sistema de triagem único identifica três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina) simplesmente alterando o substrato usado (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato).

Abstract

O recente desenvolvimento de uma técnica de ensaio de célula única de alto rendimento permite a triagem de novas enzimas com base em atividades funcionais de uma biblioteca metagenômica em larga escala¹. Anteriormente, propusemos um sistema de triagem enzimática genética (GESS) que usa regulador de dimetilfenol ativado por fenol ou p-nitrofenol. Uma vez que uma grande quantidade de reações enzimáticas naturais produz esses compostos fenólicos a partir de substratos derivados de fenol, este único sistema de triagem genética pode ser teoricamente aplicado para rastrear mais de 200 enzimas diferentes no banco de dados BRENDA. Apesar da aplicabilidade geral do GESS, a aplicação do processo de triagem requer um procedimento específico para atingir os sinais máximos de citometria de fluxo. Aqui, detalhamos o processo de triagem desenvolvido, que inclui o pré-processamento do metagenoma com GESS e a operação de um classificador de citometria de fluxo. Três diferentes substratos fenólicos (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato) com GESS foram usados para rastrear e identificar três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina), respectivamente. As atividades enzimáticas metagenômicas selecionadas foram confirmadas apenas com a citometria de fluxo, mas o sequenciamento de DNA e diversas análises in vitro podem ser usados para posterior identificação gênica.

Introduction

Uma técnica de ensaio de uma única célula de alto rendimento recentemente desenvolvido permite novas enzimas a ser rastreada a partir de uma biblioteca genética em larga escala com base nas suas actividades funcionais ^1. No nível de célula única, as proteínas que regulam a transcrição são empregues para provocar a expressão do gene repórter por detecção pequenas moléculas que são produzidos como um resultado de uma actividade da enzima alvo. Uma abordagem precoce envolvido o isolamento de um operão de fenol-degradantes de Ralstonia eutropha E2 utilizando a expressão genética induzida por substrato rastreio método (SIGEX), em que o substrato induz a expressão de uma proteína repórter ^2. NHAr de Pseudomonas putida foi usado para seleccionar benzaldeído desidrogenase ^3, e de Corynebacterium glutamicum LysG foi utilizado para o rastreio de alto rendimento de uma nova estirpe de L-lisina-produzir diversas bibliotecas de mutantes ^4.

Anteriormente, uma enzima screeni genéticasistema ng (GESS) foi proposta como uma plataforma de triagem geralmente aplicável ^5. Este sistema utiliza o regulador dimetilfenol-reconhecendo fenol, DMPR, de P. putida. DMPR (E135K), e um mutante de DMPR, também pode ser empregue em GESS (PNP-GESS) para a detecção de p-nitrofenol (PNP). Na presença de enzimas alvo a produção de compostos fenólicos, GESS em E. células de E. coli emite um sinal de fluorescência, permitindo o isolamento rápido de células isoladas usando um classificador de células activadas por fluorescência (FACS). Mas a expressão da enzima metagenômico parece ser mais fraca do que a de enzimas recombinantes convencionais; portanto, GESS foi desenhado para detectar compostos fenólicos com o máximo de sensibilidade ao investigar a combinação de local de ligação ribossómica (RBS) e sequências de terminação junto com ótima condição operacional ^5.

Uma das vantagens fundamentais do GESS é que este método único permite teoricamente o rastreio de OVer de 200 tipos diferentes de enzimas na base de dados BRENDA (Tabela 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) simplesmente empregar substratos diferentes. Foi mostrado que a celulase, lipase e hidrolase metil paration (MPH) pode ser detectada utilizando PNP-GESS com substratos apropriados de p-nitrofenilo butirato, p-nitrofenil-cellotrioside, e metil paration, respectivamente ^5. Recentemente, provou-se que uma fosfatase alcalina (AP), que é uma das novas enzimas identificadas utilizando PNP-GESS, é o primeiro AP termolábil encontrados em metagenomes marinhos adaptados ao frio ^6.

Aqui, os detalhes do processo de triagem é apresentado com PNP-GESS detectar as actividades de três tipos diferentes de lipase enzymes-, celulase, e fosfatase alcalina -e rapidamente identificar novas enzimas candidatas a partir de uma biblioteca metagenômico ^5,6. Os processos incluem metagenome pré-processamento com PNP-GESS e operação de uma flow citometria classificador. Enquanto os acertos obtidos terão de ser sequenciado para posterior identificação, este protocolo abrange o procedimento acima para os passos de confirmação de actividade enzimática utilizando citometria de fluxo.

Protocol

1. Preparação da biblioteca metagenômica com PNP-GESS

1. Construir uma biblioteca metagenômica em E. coli com um vector fosmid usando um kit de produção fosmid biblioteca de acordo com o protocolo do fabricante ^5.
2. Alíquota de 100 ul da biblioteca, para armazenamento a -70 ° C, que é uma fonte de células de biblioteca metagenomic.
   Nota: A densidade óptica de uma amostra medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD ₆₀₀₎ deste estoque biblioteca é de aproximadamente 100.
3. Descongelar 100 ul da biblioteca metagenômico estoque em gelo e em inocular um balão de 500 ml contendo 50 ml de meio Luria-Bertani (LB) e 12,5 ug / ml de cloranfenicol seguido de 37 ° C de incubação, durante 2 h.
4. Colher as células num tubo de 50 ml por centrifugação a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C.
5. Ressuspender o sedimento rapidamente em 50 ml de água destilada gelada (DW) e centrifugar a 1000 xg durante 20 min a 4 ° C novamente.
6. Resuspend o sedimento em 50 ul DW gelada com 10% (v / v) de glicerol. Utilizar 50 ul desta alíquota de células para electroporação.
7. Coloque a mistura de células electrocompetentes de 50 ul e pGESS (E135K) ⁵ de DNA (100 ng) numa cuvete de electroporação arrefecido em gelo e electroporar (1,8 kV / cm, 25 mF) a mistura.
8. adicionar rapidamente 1 ml de super caldo ideal com catabólica repressão médio (SOC) e voltar a suspender as células suavemente.
9. Transferir as células para um tubo de 14 ml de fundo redondo, usando uma pipeta e incubar a 37 ° C durante 1 h.
10. Espalhe 500 ul das células recuperadas numa LB 20 x 20 cm placa quadrada contendo 12,5 ug / ml de cloranfenicol e 50 jig / ml de ampicilina. Incubar a placa a 30 ° C durante 12 h.
11. Raspe as colónias usando um raspador de células e recolher células em um tubo cônico de 50 ml utilizando meios de armazenamento de células gelada.
12. Centrifugar a 1.000 xg durante 20 min a 4 ° C. Ressuspender o sedimento em 10 ml de mídia de armazenamento de células geladaspara chegar a um OD ₆₀₀ de 100.
13. Aliquota de 20 uL de células para armazenamento a -70 ° C.

2. Remoção falsos positivos a partir da biblioteca metagenômica

1. Descongelar as células ações metagenomic biblioteca (do passo 1.13) contendo fosmid DNA metagenômica e pGESS (E135K) em gelo.
2. Inocular 10 ml de células em 2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol em um tubo de fundo redondo de 14 ml. Incubar a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 4 h.
3. Enquanto isso, ligue a máquina de FACS e abra o software FACS padrão. Utilize as seguintes definições: diâmetro da ponta do bico, 70 mm; Adiante Área de Dispersão (-A FSC) sensibilidade, 300 amplificação V-logarítmica; Side Area Scatter (-A SSC) Sensibilidade, 350 amplificação V-logarítmica; Área fluoresceína isotiocianato (FITC-A) sensibilidade, a amplificação de 450 V-logarítmica; parâmetro de patamar, FSC-Um valor 5.
   Nota: As configurações mais comuns são fornecidaspara o dispositivo de FACS mencionado na tabela de materiais. Ajustar as configurações para outros dispositivos de FACS.
4. Dilui-se as células a partir de bibliotecas metagenomic Passo 2.2 pela adição de 5 ul da amostra para um tubo de fundo redondo de 5 ml contendo 1 ml de PBS.
5. Colocar a amostra biblioteca diluída para o porto de carga do instrumento FACS e clique no botão de carga no Aquisição Painel do software FACS.
6. Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 1.500 eventos / seg clicando e controlar os botões Taxa de fluxo no painel.
7. Criar log escalado FSC-A vs. log escalado SSC-Um gráfico de dispersão em uma planilha global, clicando no botão gráfico de pontos na barra de ferramentas. Ajuste o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) usando o botão Polígono Gate na barra de ferramentas.
8. Traçar um histograma com a contagem de células vs. log escalado FITC-A na planilha clicando no botão histograma. Em seguida, ajuste a tensão FITC do CytomeTer separador Definições na janela de Controlo Inspector de tal modo que o pico da distribuição em forma de sino é inferior a 10 ² de FITC-A.
9. Criar um log escalado FSC-A vs. o log FITC-A trama clicando no botão gráfico de pontos na planilha global. Definir um portão triagem R2 no terreno utilizando o botão de porta polígono na barra de ferramenta, de modo que a porta está localizada entre as células + 5% e -5% do centro da distribuição (10% total de células em torno do pico de a de sino curva em forma).
10. Colocar num tubo de recolha contendo 1,2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol na saída do instrumento FACS e classificar 10 ⁶ células que satisfaçam ambos os R1 e R2 portas.
11. Retire o tubo de coleta, boné, e gentilmente vortex.

3. metagenômico Enzyme Screening

1. Incubar as células escolhidas (do passo 2.11) a 37 ° C com agitação a 200 rpm até a _DO600 atinge 0,5.
2. Adicionar 1 ml copiar solução de indução para amplificar o número de cópias fosmid intracelular. Incubam-se as células durante mais 3 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
3. Para preparar as células para seleccionar, adicionar 0,5 ml de células em cultura e de um substrato adequado (p-nitrofenil de etilo, p-nitrofenil-β-D-celobiósido, fosfato ou fenilo) para um tubo de 14 ml de fundo redondo numa concentração final de 100 uM.
   1. Para uma amostra de controlo, adicionar 0,5 ml de células cultivadas a partir do Passo 3.2 para um tubo de fundo redondo de 14 ml. Adicionar o mesmo volume de PBS como o volume do substrato no passo 3.3.
4. Incubam-se as duas amostras, a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 3 h.
5. Ao mesmo tempo, preparar a máquina de FACS com as mesmas configurações que o passo 2.3.
6. Adicionar 5 uL de células (para selecção), e células de controlo para dois tubos de 5 ml de fundo redondo contendo 1 ml de PBS, respectivamente.
7. Colocar o tubo contendo células de controle para tele porto de carregamento dos FACS e clique no botão Carregar na Aquisição Painel do software FACS. Ajustar a taxa de eventos para 1.000 - 3.000 eventos / seg, controlando Taxa de Fluxo botões no painel.
8. Log criar escalado FSC-A vs. log escalado SSC-Um gráfico de dispersão, clicando no botão gráfico de pontos na planilha global do software e ajustar o portão de dispersão R1 para abranger os eventos singlet (população bacteriana) utilizando o botão Polígono Portão sobre o barra de ferramentas.
9. Log criar escalado FSC-A vs. log escalado FITC-Um gráfico de dispersão, clicando no botão gráfico de pontos na planilha e definir uma classificação portão R2 no terreno utilizando o botão Polígono Portão na barra de ferramentas para que menos de 0,1% de células negativas são detectados dentro do portão R2.
10. Substitua o tubo de amostra de controlo com o tubo de amostra de triagem, e ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg, controlando os botões Taxa de fluxo no painel.
11. Coloque um tubo de coleta contendo 0,5ml LB na saída do instrumento FACS e resolver 10 ⁴ células que satisfaçam ambas as portas R1 e R2.
    Nota: O critério de ordenação pode variar de topo de 0,1% a 5% de FITC-A na porta R2. Neste protocolo, as células top 1% foram recolhidos como positivos.
12. Retire o tubo de coleta, boné, e gentilmente vortex.
13. Espalhe as amostras de 0,5 ml recolhidos em duas placas de ágar (90 mm de placas de Petri) contendo LB, 50 ug / ml de ampicilina, 12,5 ug / ml de cloranfenicol e Incubar a placa a 37 ° C durante a noite.
14. Se necessário, execute rodadas adicionais de triagem para FITC-A enriquecimento, repetindo as etapas 3.1-3.14.

4. Hit Confirmação Seleção e atividade enzimática

1. Citometria de fluxo Análise
   1. A partir da placa incubada na Etapa 3.14, selecione uma colônia mostrando ausência de fluorescência usando um seletor de colônia sob a observação de 488 nm de comprimento de onda de um iluminador LED.
   2. Inocular a colônia selecionado em um 14 ml ro-und fundo do tubo contendo 2 ml de LB contendo 50 ug / ml de ampicilina e 12,5 jig / ml de cloranfenicol a 37 ° C com agitação a 200 rpm até a _DO600 atinge 0,5.
   3. Adicione 2 mL copiar solução de indução para amplificar o número de cópias fosmid intracelular. Incubam-se as células durante mais 3 horas adicionais a 37 ° C com agitação a 250 rpm.
   4. Preparar um tubo de 14 ml de fundo redondo e adicionar 1 ml de células em cultura (passo 4.1.3). Adicionar um substrato adequado (acetato de p-nitrofenilo, p -nitrophenyl- β -D-celobiósido, ou fosfato de fenilo) a uma concentração final de 100 uM.
      1. Para um controlo, adicionar 1 ml das células de cultura do passo 4.1.3 em um tubo de 14 ml de fundo redondo e adicionar o mesmo volume de PBS como o volume do substrato no passo 4.1.4.
   5. Incubam-se as duas amostras, a 37 ° C com agitação a 200 rpm durante 3 h.
   6. Enquanto isso, prepare a máquina FACS com as mesmas configurações como Passo 2.3.
   7. Adicionar 5 uL das células de controlo e substrato tratado para tubos de 5 ml de fundo redondo contendo 1 ml de PBS, respectivamente.
   8. Coloque as células controle tubo contendo no porto de carregamento do dispositivo FACS e clique no botão Carregar na Aquisição Painel do software FACS. Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg usando Vazão botões no painel.
   9. Clique no botão Aquisição para medir FITC-A.
   10. Substituir o tubo de amostra de controlo com o tubo de amostra substrato tratado. Ajustar a taxa de evento para 1.000 - 3.000 eventos / seg usando Vazão botões no painel.
   11. Clique no botão Aquisição para medir FITC-A.
   12. Comparar a fluorescência dos dois grupos de células através da representação gráfica de um histograma de contagem de células vs o log dimensionado FITC-A.
2. Outros ensaios para confirmar a actividade da enzima
   1. Para posterior identificação dos candidatos de enzimas selecionadas, extrair DNA fosmid usando pro extração padrãoprocedimentos dos kits de extração comerciais e analisar a sequência de nucleotídeos, ou testar a atividade enzimática in vitro ^6,7.

Results

Os três substratos fenólicos foram examinados para identificar novas enzimas metagenomic de uma biblioteca metagenome de sedimentos planas oceano-corrente em Taean, Coreia do Sul, seguindo o protocolo proposto. Para a construção da biblioteca, média 30 - sequências metagenome 40 kb foram inseridos no fosmids, que são baseados na E. coli F fator de replicão e apresentados como uma única cópia de uma célula. Note-se que fosmids têm sido amplamente utilizados para a construção de b...

Discussion

Aumentar a eficiência da produção de biocatalisadores é uma chave para o sucesso de bio-química indústria baseada ⁹ e metagenome é considerado um dos melhores fonte de enzima natural. Neste sentido, é essencial para o rastreio de novas enzimas a partir da metagenome onde a maioria dos recursos genéticos não têm sido explorados ^10. Vários métodos de rastreio foram desenvolvidos que detectam directamente produtos enzimáticos utilizando activadores de transcrição ^{11, 12,} mas estas técnicas ...

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Kit de	CopyControl Epicentre	CCFOS110	Fosmid
Solução de indução CopyControl	Epicentro	CCIS125	Solução de indução de cópia Fosmid
EPI300	Epicentro	EC300110	Célula eletrocompetente
pCC1FOS	Epicentro	CCFOS110	vetor Fosmid
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Cubeta de eletroporação e sistema eletroporado
FACSAria III	Becton Dickinson		Citometria de Fluxo (máquina FACS)
AZ100M	Microscópio Nikon
UltraSlim	Iluminador LED	Maestrogen
50-ml tubo cônico	BD Falcon
14-ml tubo de fundo redondo	Tubo
5 ml	BD Falcon
p-nitrofenil fosfato	Sigma-Aldrich	N7653	Substrato
p-nitrofenil β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrato
p-nitrofenil butilato	Sigma-Aldrich	N9876& nbsp;	substrato
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Triptona 10 g / L, Extrato de levedura 5 g / L, Cloreto de sódio 10 g / L
Caldo super ideal (SOB)	BD Difco	244310	Triptona 20 g / L, Extrato de levedura 5 g / L, Cloreto de sódio 0,5 g / L, Sulfato de magnésio 2,4 g / L, Cloreto de potássio 186 mg / L
Caldo super ideal com repressão catabólica (SOC)		SOB, 0,4% glicose
2x Extrato de levedura Triptona (2xYT)	BD Difco	244020	Digestão pancreática de caseína 16 g/L, Extrato de levedura 10 g/L, Extrato de levedura 5 g/L
Meio			2x caldo YT, 15% de glicerol, 2% de glicose
pGESS(E135K)			Um vetor de DNA contendo dmpR, genes egfp com seus promotores apropriados, RBS e terminador. Veja a referência 5 no manuscrito para Mais detalhes.
Cloranfenicol	Sigma	C0378
Ampicilina	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Citometria de Fluxo Software Versão 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4