Multi-enzima Triagem Usando um de alta capacidade Enzyme genética Sistema de Triagem

Resumo

Este trabalho apresenta um método de triagem de alto rendimento usando um sistema universal de triagem enzimática genética que pode ser teoricamente aplicado a mais de 200 enzimas. Aqui, o sistema de triagem único identifica três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina) simplesmente alterando o substrato usado (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato).

Resumo

O recente desenvolvimento de uma técnica de ensaio de célula única de alto rendimento permite a triagem de novas enzimas com base em atividades funcionais de uma biblioteca metagenômica em larga escala¹. Anteriormente, propusemos um sistema de triagem enzimática genética (GESS) que usa regulador de dimetilfenol ativado por fenol ou p-nitrofenol. Uma vez que uma grande quantidade de reações enzimáticas naturais produz esses compostos fenólicos a partir de substratos derivados de fenol, este único sistema de triagem genética pode ser teoricamente aplicado para rastrear mais de 200 enzimas diferentes no banco de dados BRENDA. Apesar da aplicabilidade geral do GESS, a aplicação do processo de triagem requer um procedimento específico para atingir os sinais máximos de citometria de fluxo. Aqui, detalhamos o processo de triagem desenvolvido, que inclui o pré-processamento do metagenoma com GESS e a operação de um classificador de citometria de fluxo. Três diferentes substratos fenólicos (acetato de p-nitrofenila, p-nitrofenil-β-D-celobiosídeo e fenil fosfato) com GESS foram usados para rastrear e identificar três enzimas diferentes (lipase, celulase e fosfatase alcalina), respectivamente. As atividades enzimáticas metagenômicas selecionadas foram confirmadas apenas com a citometria de fluxo, mas o sequenciamento de DNA e diversas análises in vitro podem ser usados para posterior identificação gênica.

Introdução

Uma técnica de ensaio de uma única célula de alto rendimento recentemente desenvolvido permite novas enzimas a ser rastreada a partir de uma biblioteca genética em larga escala com base nas suas actividades funcionais ^1. No nível de célula única, as proteínas que regulam a transcrição são empregues para provocar a expressão do gene repórter por detecção pequenas moléculas que são produzidos como um resultado de uma actividade da enzima alvo. Uma abordagem precoce envolvido o isolamento de um operão de fenol-degradantes de Ralstonia eutropha E2 utilizando a expressão genética induzida por substrato rastreio método (SIGEX), em que o substrato induz ....

Protocolo

1. Preparação da biblioteca metagenômica com PNP-GESS

1. Construir uma biblioteca metagenômica em E. coli com um vector fosmid usando um kit de produção fosmid biblioteca de acordo com o protocolo do fabricante ^5.
2. Alíquota de 100 ul da biblioteca, para armazenamento a -70 ° C, que é uma fonte de células de biblioteca metagenomic.
   Nota: A densidade óptica de uma amostra medida a um comprimento de onda de 600 nm (OD ₆₀₀₎ deste estoque biblioteca é de aproximadamente 100.
3. Descongelar 100 ul da biblioteca metagenômico estoque em gelo e em inocular um balão de 500 ml contendo 50 ml de meio Luria-Bertani (LB....

Resultados

Os três substratos fenólicos foram examinados para identificar novas enzimas metagenomic de uma biblioteca metagenome de sedimentos planas oceano-corrente em Taean, Coreia do Sul, seguindo o protocolo proposto. Para a construção da biblioteca, média 30 - sequências metagenome 40 kb foram inseridos no fosmids, que são baseados na E. coli F fator de replicão e apresentados como uma única cópia de uma célula. Note-se que fosmids têm sido amplamente utilizados para a construção de b.......

Discussão

Aumentar a eficiência da produção de biocatalisadores é uma chave para o sucesso de bio-química indústria baseada ⁹ e metagenome é considerado um dos melhores fonte de enzima natural. Neste sentido, é essencial para o rastreio de novas enzimas a partir da metagenome onde a maioria dos recursos genéticos não têm sido explorados ^10. Vários métodos de rastreio foram desenvolvidos que detectam directamente produtos enzimáticos utilizando activadores de transcrição ^{11, 12,} mas estas técnicas .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Kit de	CopyControl Epicentre	CCFOS110	Fosmid
Solução de indução CopyControl	Epicentro	CCIS125	Solução de indução de cópia Fosmid
EPI300	Epicentro	EC300110	Célula eletrocompetente
pCC1FOS	Epicentro	CCFOS110	vetor Fosmid
Gene Pulser Mxcell	Bio-Rad		Cubeta de eletroporação e sistema eletroporado
FACSAria III	Becton Dickinson		Citometria de Fluxo (máquina FACS)
AZ100M	Microscópio Nikon
UltraSlim	Iluminador LED	Maestrogen
50-ml tubo cônico	BD Falcon
14-ml tubo de fundo redondo	Tubo
5 ml	BD Falcon
p-nitrofenil fosfato	Sigma-Aldrich	N7653	Substrato
p-nitrofenil β-D-cellobioside	Sigma-Aldrich	N5759	Substrato
p-nitrofenil butilato	Sigma-Aldrich	N9876& nbsp;	substrato
Luria-Bertani (LB)	BD Difco	244620	Triptona 10 g / L, Extrato de levedura 5 g / L, Cloreto de sódio 10 g / L
Caldo super ideal (SOB)	BD Difco	244310	Triptona 20 g / L, Extrato de levedura 5 g / L, Cloreto de sódio 0,5 g / L, Sulfato de magnésio 2,4 g / L, Cloreto de potássio 186 mg / L
Caldo super ideal com repressão catabólica (SOC)		SOB, 0,4% glicose
2x Extrato de levedura Triptona (2xYT)	BD Difco	244020	Digestão pancreática de caseína 16 g/L, Extrato de levedura 10 g/L, Extrato de levedura 5 g/L
Meio			2x caldo YT, 15% de glicerol, 2% de glicose
pGESS(E135K)			Um vetor de DNA contendo dmpR, genes egfp com seus promotores apropriados, RBS e terminador. Veja a referência 5 no manuscrito para Mais detalhes.
Cloranfenicol	Sigma	C0378
Ampicilina	Sigma	A9518
BD FACSDiva	Becton Dickinson		Citometria de Fluxo Software Versão 7.0
PBS	Gibco	70011-044	0,8% NaCl, 0,02% KCl, 0,0144% Na2HPO4, 0,024% KH2OP4, pH 7,4

produção de biblioteca de fundo redondo BD Falcon de armazenamento celular