Introduction
En nylig utviklet høy gjennomstrømming encellede analysen teknikken gjør nye enzymer for å være skjermet fra en storstilt genetisk bibliotek basert på deres funksjonelle aktiviteter 1. På celle-nivået, blir proteiner som regulerer transkripsjon anvendes for å utløse reporter-gen-ekspresjon ved å avføle små molekyler som er produsert som et resultat av en target enzymaktivitet. En tidlig metode omfattet isolering av en fenol-nedbrytende operonet fra Ralstonia eutropha E2 ved hjelp av substrat-indusert ekspresjon genetisk screening (SIGEX) -metoden, hvor substratet induserer ekspresjon av et rapportørprotein 2. Nhar av Pseudomonas putida ble brukt til å velge benzaldehyd dehydrogenase 3, og LysG fra Corynebacterium glutamicum ble anvendt for high-throughput screening av en ny L-lysin-produserende stamme fra forskjellige mutante biblioteker 4.
Tidligere en genetisk enzymet maskeringsng system (GESS) ble foreslått som et generelt gjelder screening plattform 5. Dette systemet bruker fenol-gjenkjenne dimetylfenol regulator, DmpR, P. putida. DmpR (E135K) og en mutant av DmpR, kan også anvendes i GESS (PNP-GESS) for deteksjon av p-nitrofenol (PNP). I nærvær av mål-enzymer som produserer fenoliske forbindelser, GESS i E. coli-celler avgir en fluorescens-signal, slik at den hurtig isolering av enkeltceller ved hjelp av et fluorescens-aktivert cellesorterer (FACS). Men ekspresjonen av metagenomic enzym synes å være svakere enn den for konvensjonelle rekombinante enzymer; Derfor GESS er designet for å oppdage fenoliske forbindelser med maksimal følsomhet ved å undersøke kombinasjonen av ribosomale bindingssetet (RBS) og terminatorsekvenser sammen med optimal driftstilstand 5.
En av de grunnleggende fordelene ved GESS er at denne enkle metode teoretisk tillater screening av over enn 200 forskjellige typer enzymer i Brenda databasen (tabell 1, http: // www.brenda-enzymes.info, 2013.7) ved bare å bruke forskjellige underlag. Det ble vist at cellulase, lipase, og metyl-paration hydrolase (MPH) kan påvises ved hjelp av PNP-GESS med passende substrater for p-nitrofenyl butyrat, p-nitrofenyl-cellotrioside, og metyl-paration, henholdsvis 5. Nylig ble det vist at et alkalisk fosfatase (AP), som er en av de nye enzymer som er identifisert ved hjelp av pnp-GESS, er den første termolabile AP befinner seg i kuldetilpassede marine metagenomes 6.
Her er detaljene for screening prosessen presenteres med PnP-GESS påvise aktivitetene til tre ulike typer enzymes- lipase, cellulase og alkalisk fosfatase -og raskt identifisere nye kandidat enzymer fra en metagenomic bibliotek 5,6. Prosessene omfatter metagenome preprosessering med PnP-GESS og opererer en flow cytometri sorter. Mens treff som oppnås vil måtte bli sekvensert for ytterligere identifikasjon, denne protokollen omfatter fremgangsmåten opp til trinnene av enzymaktivitet bekreftelse ved hjelp av flow cytometri.
Subscription Required. Please recommend JoVE to your librarian.
Materials
| Name | Company | Catalog Number | Comments |
| CopyControl | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid library production kit |
| CopyControl Induction Solution | Epicentre | CCIS125 | Fosmid copy induction solution |
| EPI300 | Epicentre | EC300110 | Electrocompetent cell |
| pCC1FOS | Epicentre | CCFOS110 | Fosmid vector |
| Gene Pulser Mxcell | Bio-Rad | Electroporation cuvette and electroporate system | |
| FACSAria III | Becton Dickinson | Flow Cytometry (FACS machine) | |
| AZ100M | Nikon | Microscope | |
| UltraSlim | Maestrogen | LED illuminator | |
| 50-ml conical tube | BD Falcon | ||
| 14-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| 5-ml round-bottom tube | BD Falcon | ||
| p-nitrophenyl phosphate | Sigma-Aldrich | N7653 | Substrate |
| p-nitrophenyl β-D-cellobioside | Sigma-Aldrich | N5759 | Substrate |
| p-nitrophenyl butylate | Sigma-Aldrich | N9876 | Substrate |
| Luria-Bertani (LB) | BD Difco | 244620 | Tryptone 10 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 10 g/L |
| Super Optimal broth (SOB) | BD Difco | 244310 | Tryptone 20 g/L, Yeast extract 5 g/L, Sodium Chloride 0.5 g/L, Magnesium Sulfate 2.4 g/L, Potassium Chloride 186 mg/L |
| Super Optimal broth with Catabolite repression (SOC) | SOB, 0.4 % glucose | ||
| 2x Yeast Extract Tryptone (2xYT) | BD Difco | 244020 | Pancreatic digest of Casein 16 g/L, Yeast extract 10 g/L, Yeast extract 5 g/L |
| Cell storage media | 2x YT broth, 15% Glycerol, 2% Glucose | ||
| pGESS(E135K) | A DNA vector containing dmpR, egfp genes with their appropriate promoters, RBS, and terminator. See the reference 5 in the manuscript for more details. |
||
| Chloramphenicol | Sigma | C0378 | |
| Ampicillin | Sigma | A9518 | |
| BD FACSDiva | Becton Dickinson | Flow Cytometry Software Version 7.0 | |
| PBS | Gibco | 70011-044 | 0.8% NaCl, 0.02% KCl, 0.0144% Na2HPO4, 0.024% KH2OP4, pH 7.4 |
References
- Eggeling, L., Bott, M., Marienhagen, J.
- Uchiyama, T., Abe, T., Ikemura, T., Watanabe, K. Substrate-induced gene-expression screening of environmental metagenome libraries for isolation of catabolic genes. Nat. Biotechnol. 23 (1), 88-93 (2005).
- Van Sint Fiet, S., van Beilen, J. B., Witholt, B. Selection of biocatalysts for chemical synthesis. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 103 (6), 1693-1698 (2006).
- Binder, S., et al. A high-throughput approach to identify genomic variants of bacterial metabolite producers at the single-cell level. Genome Biol. 13 (5), R40 (2012).
- Choi, S., et al. Toward a generalized and High-throughput Enzyme Screening System Based on Artificial Genetic Circuits. ACS Synthetic Biology. 3 (3), 163-171 (2014).
- Lee, D. H., et al. A novel psychrophilic alkaline phosphatase from the metagenome of tidal flat sediments. BMC Biotechnology. 15 (1), (2015).
- Warnecke, F., et al. Metagenomic and functional analysis of hindgut microbiota of a wood-feeding higher termite. Nature. 450 (7169), 560-565 (2007).
- Kim, U. J., Shizuya, H., de Jong, P. J., Birren, B., Simon, M. I. Stable propagation of cosmid sized human DNA inserts in an F factor based vector. Nucleic Acids Research. 20 (5), 1083-1085 (1992).
- Jemli, S., Ayadi-Zouari, D., Hlima, H. B., Bejar, S. Biocatalysts: application and engineering for industrial purposes. Crc. Cr. Rev. Biotechn. 36 (2), 246-258 (2014).
- Lorenz, P., Eck, J.
- Uchiyama, T., Miyazaki, K. Product-induced gene expression, a product responsive reporter assay used to screen metagenomic libraries for enzyme encoding genes. Applied and environmental microbiology. 76 (21), 7029-7035 (2010).
- Mohn, W. W., Garmendia, J., Galvao, T. C., De Lorenzo, V. Surveying bio-transformations with à la carte genetic traps: translating dehydrochlorination of lindane (gamma-hexachlorocyclohexane) into lacZ-based phenotypes. Environmental microbiology. 8 (3), 546-555 (2006).
- Tang, S. Y., Cirino, P. C. Design and application of a mevalonate-responsive regulatory protein. Angew Chem. Int. Ed. 50 (5), 1084-1086 (2011).
- Jha, R. K., Kern, T. L., Fox, D. T., Strauss, C. E. M. Engineering an Acinetobacter regulon for biosensing and high-throughput enzyme screening in E. coli via flow cytometry. Nucleic Acids Res. 42 (12), 8150-8160 (2014).
