Promover 3-D agregação de células FACS purificada epiteliais tímicos com EAK 16-II / EAKIIH6 de auto-montagem Hidrogel

Resumo

Este vídeo demonstra um protocolo para enriquecer células epiteliais tímicas (TECs) com gradiente de densidade para isolamento de FACS. Também mostra o uso de peptídeos EAK16-II/EAKIIH6 para promover a formação de agregados TEC. Os microambientes do hidrogel EAK16-II/EAKIIH6 fornecem a configuração 3-D necessária para manter a sobrevivência e a função dos TECs.

Resumo

A involução do timo, associada ao envelhecimento ou insultos patológicos, resulta em diminuição da produção de células T maduras. Restaurar a função de um timo com insuficiência é crucial para manter uma resposta imune adquirida mediada por células T eficaz contra patógenos invasores. No entanto, a regeneração e revitalização do timo provou ser desafiadora, em grande parte devido às dificuldades de reproduzir o microambiente 3D único do estroma tímico, que é crítico para a sobrevivência e função das células epiteliais tímicas (TECs). Desenvolvemos um novo sistema de hidrogel para promover a formação de agregados TEC, baseado na propriedade de automontagem dos oligopeptídeos anfifílicos EAK16-II e seu análogo histidinilado EAKIIH6. As TECs foram enriquecidas a partir de células tímicas isoladas com gradiente de densidade, classificadas com classificação celular ativada por fluorescência (FACS) e marcadas com anticorpos anti-molécula de adesão celular epitelial (EpCAM) que foram ancorados, juntamente com anti-His IgGs, nos complexos adaptadores da proteína A / G. A formação de agregados celulares foi promovida pela incubação de TECs com oligopeptídeos EAKIIH6 e EAK16-II e, em seguida, pelo aumento da concentração iônica do meio para iniciar a gelificação. Os agregados TEC incorporados no hidrogel EAK podem efetivamente promover o desenvolvimento de células T funcionais in vivo quando transplantados para camundongos nus atímicos.

Introdução

O timo é o órgão linfóide primário responsável pela geração de uma população diversa de células, T auto-tolerante patógeno-reactivo que é essencial à função do sistema imune adquirida. Ele é um órgão dinâmico onde timócitos em desenvolvimento, emigraram da medula óssea como células de linfócitos progenitoras, migram através da tridimensional (3-D) de matriz semelhante a esponja do estroma tímico, submeter a linhagem de especificação e diferenciação, e, eventualmente, emigrar quanto madura T-células. O êxito deste processo bem programado depende em grande parte da conversa cruzada entre os timócitos migram e as células epiteliais tímicas residenciais (TEC), a populaçã....

Protocolo

Todos os animais utilizados nos experimentos foram alojados no biotério do Instituto de Pesquisa Allegheny-Singer no âmbito do protocolo revisto e aprovado pelo Comitê de Cuidado e Uso Institucional Animal do / Allegheny Instituto de Pesquisa Cantor Allegheny Health Network.

1. digerindo o Thymus com colagenase

1. Colheita timo.
   1. Euthanize camundongos 3-5 semanas de idade C57BL6 / J em um dióxido de carbono (CO ₂₎ da câmara para colher timo. Em detalhe, colocar os murganhos na câmara sob indução _de CO ₂ durante 3-5 min e confirmar a morte verificando paragem cardíaca ou respiratória.
   <....

Resultados

Para examinar a eficácia de separação usando o protocolo de gradiente de densidade para enriquecer as células estromais CD45-, células colhidas a partir da interface e as pelotas de linfócitos precipitados foram coradas com anticorpos anti-EpCAM anti-CD45 e. Tanto anti-Ulex europaeus 1 Aglutinina (UEA1) e anticorpos anti-MHC de classe II foram também incluídas no coquetel de coloração para continuar a identificar os subconjuntos CTEC e MTEC. Como mostrado na Figura 1, qu.......

Discussão

Enquanto TEC são a população predominante do estroma tímico e desempenham papéis essenciais para a estrutura e a função das glândulas de timo, eles representam apenas cerca de 0,1-0,5% da celularidade do timo total. Eles também são células frágeis como elevadas percentagens de morte celular são ocasionalmente observados após a digestão de colagenase, ou seja, o tratamento de TEC dissociar a partir da matriz extracelular (ECM). Sua raridade (~ 200.000 por timo mouse) e fragilidade tornou uma tarefa desafiadora p.......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
< forte> Isolamento TEC< / forte>
70% Etanol	Decon Laboratories	2701 (1 Galão)	Etanol 200 Prova, água deionizada
Tesoura de dissecação, reta	Fine Science Tools, Inc.	91460-11
Pinça Graefe, reta	Fine Science Tools, Inc.	11053-10
Pinça Graefe, curva	Fine Science Tools, Inc.	11052-10
Solução			1x PBS, 0,1% BSA, 2  mM EDTA
1x PBS (Solução salina tamponada com fosfato)	Gibco	10010-023
BSA (Albumina de soro bovino)	Sigma	A1470-100G
EDTA (ácido etilenodiaminotetracético)	Invitrogen	15575-038
Solução			9 ml RPMI-1640, 0.025  mg/ml Liberase TM Grau de pesquisa, 10  mM HEPES, 0,2  mg/ml DNaseI
RPMI-1640	Gibco	11879-020
Liberase TM Grau de Pesquisa	Roche	05 401 127 001	referido como "colagenase purificada"
1  M HEPES	Lonza	17-737E
Dnase I	Roche	10 104 159 001
50  ml Tubo de centrífuga	Corning	430290
60  mm placa de cultura de tecidos	Falcon	353002
1/2  seringa de insulina cc U-100 28  1/2  G	Becton Dickinson	329461
5  ml Tubo de poliestireno de fundo redondo	Falcon	352058
5  ml pipeta de vidro	Fisher Healthcare	13-678-27E	Use para enxaguar os fragmentos tímicos. Fragmentos tímicos tendem a grudar na parede com pipetas de plástico.
Rotador de tubo MACSmix	Miltenyi	130-090-753
100  µ m Filtro de células	Falcon	352360
Gradiente de densidade médio: OptiPrep	Axis-Shield
Cell Sorting
5  ml Tubo de fundo redondo	de polipropileno Falcon	352063
Anti-mouse CD16/CD32 (Fc Block)	BD Biosciences	553142	Use como não diluído, 2  µ l por amostra
Anti-mouse CD45-PercpCy5.5	eBioscience	45-0451-80	Use a 1:150, 10  µ l por amostra
Anti-mouse CD326 (EpCAM)-PE	eBioscience	12-5791-82	Use a 1:100, 10  µ l por amostra
BD Influx	BD Biosciences
Software de análise de célula única	FlowJo
EAK Gel Assembly
Anti-His-Tag	AnaSpec	29673	"anti-His-Tag IgG"Anti-His-Tag IgG"
Purificado anti-rato CD326 (EpCAM)	BioLegend	118202	"anti-EpCAM IgG"
Proteína recombinante A/G	Pierce Biotechnology
1.5  ml Tubos de Safe-Lock, Biopur, Estéril	Fisher Healthcare	05-402-24B	referido como "1.5  ml tubo de microcentrífuga "
96 poços, placa de cultura de tecidos, fundo redondo com tampa de baixa evaporação	BD Falcon	353917
Plataforma de balanço: Nutator Mixer no.1105	BD Clay Adams
10% de sacarose	Sigma	S0389	Prepare com água destilada estéril
EAK16-II (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAK-CONH2)	American Peptide Company& nbsp;		sintetizado personalizado, 10  mg/ml
EAKIIH6 (AcNH-AEAEAKAKAEAEAKAKHHHHHH-CONH2)	American Peptide Company		sintetizado personalizado, 7.5  mg/ml
Meio			RPMI-1640, 10% FBS, 1% Pen/Strep, 1% L-glutamina, 1% NEAA, 5  mM HEPES, 50  µ M 2-Mercaptoetanol
RPMI-1640	Gibco	11879-020
FBS (Soro Fetal Bovino)	Atlanta Biologicals	S11150	Inativado por calor antes do uso
Pen/Strep	Gibco	15140-122
L-glutamina 200  mM (100x)	Gibco	25030-081
NEAA (aminoácido não essencial) 100x	Gibco	11140-050
1  M HEPES	BioWhittaker	17-737E
2-Mercaptoetanol (100x)	Millipore	ES-007-E
Agitador de plataforma: The Belly Dancer	Stovall Life Sciences Inc.	modelo: USBDbo

de lavagem de digestão completo