Rápida Verificação de Exterminadores Usando o PGR Azul plasmídeo e Montagem Golden Gate

Resumo

Este protocolo utiliza o Golden Gate Assembly e o plasmídeo pGR-blue para quantificar rapidamente a resistência dos terminadores encontrados in silico.

Resumo

O objetivo deste protocolo é permitir a verificação rápida de terminadores identificados bioinformicamente. Além disso, o plasmídeo (pGR-Blue) é projetado especificamente para este protocolo e permite a quantificação da eficiência do terminador. Como prova de conceito, seis terminadores foram identificados bioinformaticamente no micobacteriófago Bernal13. Uma vez identificados, os terminadores foram feitos como oligonucleotídeos com as extremidades pegajosas apropriadas e recozidos juntos. Usando o Golden Gate Assembly (GGA), os terminadores foram então clonados em pGR-Blue. Sob luz visível, as colônias falsas positivas aparecem azuis e as colônias transformadas positivamente são brancas/amarelas. Após a indução de um promotor induzível por arabinose (pBad) com arabinose, a força da colônia pode ser determinada medindo a proporção de proteína fluorescente verde (GFP) produzida para proteína fluorescente vermelha (RFP) produzida. Com o pGR-Blue, o protocolo pode ser concluído em menos de três dias e é ideal em um ambiente educacional. Além disso, os resultados mostram que este protocolo é útil como um meio para entender as previsões in silico da eficiência do terminador relacionadas à regulação da transcrição.

Introdução

Grandes projetos de biologia sintética exigem o uso de terminadores de transcrição altamente eficazes para ajudar a regular a expressão gênica. A identificação de novos terminadores requer análise bioinformática de novos genomas. No entanto, à medida que quantidades crescentes de software de bioinformática são desenvolvidas, cada uma com um algoritmo exclusivo utilizado para previsão, ocorre mais discrepância entre os resultados putativos. Como esse processo é um tanto subjetivo e é feito in silico, essas previsões precisam de confirmação biológica. ¹ Além disso, o volume de terminadores putativos identificados por meio de análise in-silico requer o uso de estratégias de clonagem que podem ser concluídas em um período de tempo relativamente curto.

O plasmídeo PGR-Blue é uma modificação do plasmídeo PGR que foi redesenhado para usar o Golden Gate Assembly (GGA) para simplificar o procedimento de clonagem, permitindo que todas as etapas da reação sejam executadas simultaneamente em um tubo de microcentrífuga. ^2,3 A seleção de cores foi incorporada ao plasmídeo para aumentar a facilidade de identificação de colônias positivas. Uma ligadura bem-sucedida deve ser branca/amarela na luz visível e verde fluorescente sob luz azul (450 nm) ou ultravioleta (UV) quando cultivada em placas contendo arabinose. Como o pGR-blue não cortado contém uma cromoproteína azul (amilCP), as colônias contendo um plasmídeo não modificado são azuis sob luz visível. Essa simplificação, juntamente com o protocolo simplificado, permite que os pesquisadores prossigam da identificação bioinformática para a confirmação biológica em três a quatro dias. A natureza do design deste sistema pode ser benéfica tanto no laboratório de pesquisa quanto em ambientes educacionais.

O plasmídeo pGR-Blue permite a quantificação da força do terminador. ⁴ Um único promotor induzível por arabinose é usado para produzir proteína fluorescente verde (GFP) e proteína fluorescente vermelha (RFP). O terminador é clonado no plasmídeo após a sequência GFP, mas antes da sequência RFP, interrompendo assim a transcrição da proteína RFP. A resistência do terminador é determinada pela proporção de GFP produzida para RFP produzida.

O relatório Vision and Change⁵ sugeriu que a educação em Ciência, Tecnologia, Engenharia e Matemática (STEM) incorpora experiências baseadas em pesquisa na sala de aula. ⁶ No entanto, isso requer o desenvolvimento de protocolos que podem ser feitos por alunos com conjuntos de habilidades limitados em um período de tempo definido. Embora o protocolo possa ser realizado em menos de três dias, ele também foi projetado para que cada etapa principal pudesse ser realizada em um período de laboratório semanal separado (2-3 horas) para criar uma Experiência de Pesquisa do Curso (CRE). Quando usado dessa maneira, o procedimento levará entre três e seis semanas e é apropriado para cursos introdutórios e avançados em Genética, Biologia Celular ou Bioinformática.

Protocolo

1. Projecção e Ordenação oligonucleótidos com as apropriadas pegajosas Termina

1. Identificar potenciais terminadores independente de rho através da análise genômica usando programas que estão livremente disponíveis online ^7.
2. Quando se trabalha com o ADN de cadeia dupla, determinar a orientação do terminador para ser testado. ⁷ O plasmídeo PGR-azul apenas verifica terminadores ligados na direcção 5 'para 3' na parte superior (vertente para a frente).
   1. Converter um fio terminator inferior (reverso) para o seu complemento revertida para reorientar a sequência de ensaios in PGR-azul usando software livre online, por exemplo, APE.
3. Após a orientação é determinada para ser correta, adicionar a extremidade coesiva "5'- CGAC-3 '" para a extremidade 5' da cadeia superior. Adicionar a extremidade coesiva "5'- CCGC-3 '" para a extremidade 5' da cadeia inferior. ⁸ Isto irá assegurar que pastilha ligado irá ser inserido no adequadoorientação usando GGA.
4. Uma vez que as sequências são determinadas, pedir como oligonucleotídeos de cadeia simples comercialmente.

2. Annealing oligonucleotídeos (aplica apenas para liofilizadas DNA)

1. Re-suspender oligonucleótidos individuais em água livre de nuclease, a uma concentração de 100 uM.
2. Adicione 10x tampão de emparelhamento: NaCl 1 M e Tris-HCl 100 mM pH 7,4. tampão de emparelhamento pode ser armazenado a 4 ° C durante várias semanas. Uma vez que é feita de tampão de recozimento e os oligonucleótidos são re-suspensas, iniciar o recozimento ^8.
3. Para cada terminador a ser testado, adicionar 16 ul de água ultra-pura para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
4. Adicionar 2 l de 10x tampão de têmpera a cada tubo de microcentrífuga.
5. Adicionar 1 ml de topo oligonucleótido cadeia (100 um) a partir do terminador desejado.
6. Adicionar 1 ml de oligonucleótido inferior cadeia (100 um) a partir do terminador desejado.
7. Criar uma ebulição ba de águath utilizando um copo de 1000 ml contendo cerca de 400 ml de água da torneira e coloque em um prato quente.
8. Coloque os tubos de microcentrífuga a partir do passo 2.6 em uma bóia e deixe ferver por 4 min. Após 4 min, desligue o calor de placas, mas deixar o tubo e flutuar no banho de água para arrefecer lentamente O / N (18 hr) ^8. Armazenar os terminadores recozido à temperatura de -20 ° C.

3. Montagem Golden Gate (Mix Standard - Custo Eficiente)

1. Fazer uma diluição de 40 nM dos terminadores recozidos. Adicionar 124 mL de água livre de nuclease para 1 ml de mistura terminadores recozido (100 M).
   1. Centrifugar as amostras durante 30 segundos a 10.000 xg e armazenar no gelo.
2. Em uma nova adequada do tubo para o termociclador sendo usado, adicionar 6 mL de água livre de nuclease.
3. Adicionar 1 mL de tampão de ligase de ADN comercial [Tris-HCl 300 (pH 7,7-7,8), _MgCl2 100 mM, DTT 100 mM e 10 mM de ATP]. Execute todas as etapas subsequentes no gelo.
4. Adicionar1 ul de PGR-Azul (35-50 ng / ul) do plasmídeo de destino para o tubo de microcentrífuga.
5. Adicionar 1 mL do 40 nm terminadores emparelhado com o tubo de microcentrífuga.
6. Adicionar 0,5 uL de endonuclease de restrição comercial de alta fidelidade BSAI ao tubo de microcentrífuga.
7. Adicionar 0,5 uL de ligase de ADN comercial para o tubo de microcentrífuga.
8. Centrifugar a mistura reaccional a 10.000 xg, durante 120 segundos. Em seguida, coloque o tubo diretamente no termociclador.
9. Executar o programa de termociclador: 20 ciclos de 1 min a 37 ° C, seguido de 1 min a 16 ° C, seguido de 1 ciclo de 15 min a 37 ° C. Use amostras imediatamente ou congelar e armazenar a -20 ° C. ⁸

4. Montagem Golden Gate (Comercial Mix Master - tempo eficiente)

1. Adicionar 124 uL de água livre de nuclease e 1 uL de 100 uM terminadores criados no passo 2. Este dilui a concentração de ADN de 40 nM terminador recozidos.Execute esta etapa em uma nova, rotulados 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
2. Em uma nova adequada do tubo para o termociclador, adicione 14 mL de água livre de nuclease. Verifique se o novo tubo é rotulado em conformidade.
3. Adicionar 2 mL de Commercial Mestre Mix Buffer para o tubo de microcentrífuga.
4. Adicionar 1 ml de PGR Azul plasmídeo (35-50 ng / ul) ao tubo de microcentrífuga.
5. Adicionar 2 mL da 40 nM terminadores emparelhado com o tubo de microcentrífuga.
6. Adicionar 1 ml de Commercial Master Mix ao tubo de microcentrífuga.
7. Centrifuga-se o tubo de 40 nm a 10000 xg durante 120 seg. Em seguida, coloque o tubo diretamente no termociclador.
8. Executar o programa de termociclador: 1 ciclo de 60 min a 37 ° C, seguido de 1 ciclo de 15 min a 55 ° C. Use amostras imediatamente ou congelar e armazenar a -20 ° C.

5. Transformação e Selecção Colony

1. Prepare Luria Base (LB) agar placas de Petri contendo concentrat 1 mMion de ampicilina (Amp) e uma concentração de 10 mM de arabinose (ARB). Preparar pelo menos 10 ml de uma solução M de L da -arabinose porque esta solução de reserva vai ser usado em passos posteriores.
2. Use qualquer alta eficiência (10 ⁸ - 10 ⁹ transformantes / mg) E. quimicamente competente coli (JM109), as células para a transformação. ^9, para obter os melhores resultados, adicionar 3-5 uL da reacção de ligação a 50 ul de células competentes. Quando se utiliza células competentes químicos, seguir o protocolo de transformação específica para as células a ser usadas.
3. Espalhe metade (25 ul) das células transformadas em LB pré-aquecido (Amp / ARB) placas de agar utilizando uma forma de L "stick de hóquei" estéril e incubar O / N a 37 ° C. Devido à rápida taxa de ampicilina de decomposição, não se incubar a 37 ° C ao longo de 24 h.
4. Realizar a seleção de colónia com base na cor por inspeção visual. A ligadura de sucesso deve ser branco / amarelo na luz visível e fluorescência verde undeazul r (450 nm) ou luz UV. Uma ligação bem sucedida irá produzir uma colônia que é de cor azul sob luz visível após 18-20 horas.

6. Verificação e Quantificação de Terminator

1. Prepare 5 ml estéreis tubos de caldo LB com ampicilina 1 mM e 10 mM de arabinose. O número de tubos necessário é dependente do número de terminais a ser testado, mais controlos (células com resistência à ampicilina que não apresentam fluorescência e as células contendo o plasmídeo PGR-azul não cortadas).
2. Sob a luz visível pegar 2-3 colónias branco / amarelo (passo 5.4) usando um loop estéril. Deixar as amostras a incubar em caldos num agitador a 37 ° C e 160 rpm durante 16-18 horas. Não incubar as amostras durante mais de 24 horas.
   1. Opcionalmente, utilizar um espectrofotómetro para determinar a densidade celular óptica a 600 nm _(DO600) para garantir o crescimento celular adequado. Geralmente, uma DO ₆₀₀ de 0,8-1,0 ~ é observada após 16-18 horas de crescimento.
3. Usaruma placa de 96 poços estéreis para as etapas restantes. Realizar estas etapas num ambiente asséptico e em triplicado. Adicionar 199 ul de estéril LB + Amp caldo / arabinose (1 mM de ampicilina / arabinose a 10 mM) a cada poço. Incluir quarto na placa por três controles separados.
   1. Use os três controlos seguintes: somente um poço (1) contendo LB + Amp / arabinose caldo e um poço (2) para células competentes não transformadas (em branco) para servir como um espaço em branco. Para a quantificação (3) da força terminador, as células que contêm PGR originais sem cortes ou contendo PGR-azul ligado com uma sequência não-terminating deve ser incluído (controlo de referência para a quantificação). Veja a Figura 1 para o layout do leitor de placas.
4. Pipetar 1 mL da solução de células a partir de O / N caldos em poços individuais da placa de 96 poços.
5. placas de vedação com uma cobertura respirável e agitar durante 18-20 horas a 37 ° C e 160 rpm.
6. Utilizando um leitor de placa, determinar pela leitura _OD600absorvância a 600 nm. Medir a fluorescência de GFP, como se segue: 395 de excitação e emissão de fluorescência 509. Medida RFP como se segue: 575 de excitação e de emissão 605. Após 18-20 horas, o OD ₆₀₀ deve ser de aproximadamente 0,5.
7. Para normalizar as variações em crescimento, a utilização da equação: tanto para GFP e RFP.
8. Após a normalização, determinar a força terminator relativa usando a equação

Resultados

Este protocolo irá produzir células que contêm PGR-azul com um terminador ligado entre GFP e RFP usando Golden Gate Assembly (Figura 2). As colónias positivas contendo inserção ligado pode ser seleccionado com base na cor. À luz visível colónias positivas será branco / amarelo e falsos positivos irá produzir colónias azuis após 18-20 horas de incubação a 37 ° C (Figura 3).

Após selecção de col...

Discussão

O passo mais importante neste protocolo é design oligonucleotídeo adequada antes de pedir. Os oligonucleótidos devem ter as extremidades coesivas apropriadas para adicionado extremidades 5 'da parte superior e inferior cadeias para assegurar que GGA incorporação é possível. Além disso, é importante para mudar a orientação da terminadores virada para a esquerda (terminadores que param de transcrição na cadeia inferior) ao do direito virado (termina a transcrição na parte superior fio) terminadores porque GFP e RFP ex...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
pGR-Blue Plasmid	Addgene	68374
pGR-Plasmid	Addgene	46002
AeraSeal-(Folhas Estéreis)	Excel Scientific	BS-25	Folhas Estéreis apenas
10x T4 DNA ligase Buffer	NEB
BsaI-HF	NEB	R3535S	A enzima não-HF funcionará, mas é menos estável ao calor.
NEB Golden Gate Assembly Mix	NEB	E1600S	Commerial Master Mix referido no protocolo.
T4 DNA ligase	NEB	M0202S
Microcentrífuga redonda Rack flutuante	Nova Tech International	F18875-6401
Sal de ampicilina de sódio	Sigma Aldrich	A9518
L-(+)-Arabinose	Sigma Aldrich	A-3256	D-Arabinose não induzirá o promotor pBAD
Luria Base (LB) - Caldo, Miller	Sigma Aldrich	L1900
Luria Base (LB) - Ágar, Miller	Sigma Aldrich	L2025
Tecan-Infinite M200 Leitor de Placas	Tecan
Mix & Go Competent Cells - Cepa JM109	Zymo Research	T3005	Use o protocolo de transformação recomendado pela empresa
ApE: Um software editor de plasmídeo	http://biologylabs.utah.edu/jorgensen/wayned/ape/
Tris-HCl, Cloreto	Promega	H5121
Molecular (Cristalino/Biológico, Certificado)	Fisher Chemical	S671
Tecnologias integradas comerciais do ADN da síntese do oligonucleotide	(IDT)		http://www.idtdna.com/site
placas da cultura de tecidos do microteste - 96 poço (estéril)	Falcon	35-3072
micobacteriófago "Bernal13"	Banco de genegramas	KJ510413
a água livre da nuclease	Tecnologias integradas do ADN (IDT)	IDT004
Estéril, L-dado forma Hockey-Stick Cell	Life Science Products	6444-S1
Nano-Drop 2000c UV-Vis Spectrometer	Thermo Scientific	2000c
ARNold: uma ferramenta web para a previsão de terminadores de transcrição independentes de Rho.