Artigo de método

Isolation and Cellular fenotipagem de células-tronco mesenquimais derivadas do líquido sinovial e Medula Óssea de miniporcos

DOI:

10.3791/54077

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2 de julho de 2016

 ,  ,  ,  ,  ,  ,  , 
1College of Veterinary Medicine, Gyeongsang National University, 2PWG Genetics Pte Ltd.

Neste artigo

Resumo

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Um protocolo que estabelece células-tronco mesenquimais (MSCs) isoladas do líquido sinovial e da medula óssea de miniporcos e coletadas de forma não invasiva por aspiração com seringa é apresentado. A fenotipagem celular foi realizada por citometria de fluxo após isolamento celular e cultivo in vitro de medula óssea e fluidos sinoviais derivados de MSCs.

Resumo

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As células-tronco mesenquimais (MSCs) foram estabelecidas após o isolamento de várias fontes de tecido, incluindo medula óssea e líquido sinovial. Recentemente, foi relatado que as MSCs derivadas do líquido sinovial têm potencial de diferenciação de múltiplas linhagens e características imunomoduladoras, o que indica que essas células podem ser usadas para engenharia de tecidos e tratamentos sistêmicos. Este estudo apresenta um protocolo para isolamento simples e não invasivo de CTMs derivadas da medula óssea e líquido sinovial de minipigs para análise de marcadores de superfície celular para fenotipagem celular e cultura in vitro. Usando miniporcos de seis meses de idade sexualmente maduros, a medula óssea foi extraída do osso da crista ilíaca usando um extrator de medula óssea e o líquido sinovial foi aspirado da articulação femorotibial. Os procedimentos para a coleta de amostras de ambas as fontes foram não invasivos. São fornecidos os protocolos para o isolamento efetivo de MSCs de fontes de células colhidas e para a criação de condições de cultivo in vitro para expandir MSCs estáveis de minipigs e a aplicação de tratamentos autólogos sistêmicos. Para a fenotipagem celular, os marcadores de superfície celular de ambas as células foram analisados por citometria de fluxo. Nos resultados, as MSCs foram isoladas do líquido sinovial dos minipigs e mostraram que as MSCs derivadas do líquido sinovial têm morfologia e fenótipo celular semelhantes às MSCs derivadas da medula óssea. Portanto, o líquido sinovial obtido de forma não invasiva é uma fonte valiosa de MSCs.

Introdução

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As células-tronco mesenquimais (CTMs) multipotentes podem ser classificadas em linhagens de células mesenquimais, e as CTMs foram estabelecidas e isoladas de várias fontes teciduais, como medula óssea, cordões umbilicais, placentas, tecido adiposo, pele dérmica, músculo esquelético, folículos pilosos, membranas sinoviais e dentes1-5. Atualmente, a atenção tem sido dada às CTMs derivadas da sinovial, pois essas células podem ajudar a tratar doenças articulares, como fração óssea, osteoartrite e artrite reumatoide (AR), e devido ao potencial regenerativo das CTMs na cartilagem ou osso danificado, elas também podem ajudar a tratar a modulação imunológica ou doenças autoimunes6-8. A maioria das pesquisas de CTMs derivadas de fontes sinoviais empregou CTMs da membrana sinovial em vez de líquido sinovial2,9; assim, a compreensão biológica das MSCs derivadas do líquido sinovial é limitada.

O líquido sinovial é uma fonte facilmente acessível de MSCs, que pode ser aspirada durante os diagnósticos ou tratamentos de pacientes e durante confirmações diagnósticas de várias condições de artrite que não requerem procedimentos invasivos, como osteoartrite ou AR. A população de CTMs derivadas do líquido sinovial na cavidade sinovial é significativamente aumentada em pacientes artríticos em comparação com pacientes não artríticos10-12. Portanto, o líquido sinovial é uma excelente fonte candidata para MSCs, particularmente para terapia com células-tronco autólogas em pacientes com articulações inflamadas ou lesionadas. Além disso, as MSCs derivadas do líquido sinovial têm capacidade condrogênica, habilidades de imunomodulação e alta taxa de proliferação. Este estudo estabeleceu protocolos para extração de medula óssea e aspiração de líquido sinovial de miniporcos usando métodos não invasivos e para a expansão in vitro de células isoladas e análise de fenótipos celulares.

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Protocolo

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Experimentos em animais foram autorizados pelo Centro animal for Biomedical Experimentação da Universidade Nacional de Gyeongsang.

1. Preparativos para o Procedimento de animal

  1. Prepara-se o adulto porquinhos do sexo feminino para a recolha não-invasivo de MSCs a partir de medula óssea e no fluido sinovial. Realizar o exame clínico dos porquinhos um dia antes da anestesia e coleta de amostras.
    1. Fornecer animais clinicamente normais de exames físicos, que incluem a temperatura corporal, freqüência respiratória e freqüência cardíaca, e pela observação do comportamento e hematológicos status dos porcos, utilizando hemograma completo.
      Nota: intervalos de parâmetros para miniporcos clinicamente saudáveis ​​são 11-29 / min para a taxa de respiração, 68-98 / min para o ritmo cardíaco, e 37-38 ° C para a temperatura do corpo.
  2. Remover todas as camas comestível da gaiola durante o período de jejum pré-operatório de 6 - prio 12 hrr para a administração de anestesia para jovens e adultos minipigs, 3 horas de jejum deve ser observado para os recém-nascidos. Fornecer água potável até o momento da anestesia.

2. Preparação dos animais para anestesia

  1. Medicar os porquinhos antes da administração da anestesia com acepromazina (0,1 mg / kg), medetomidina (0,03 mg / kg), e atropina (0,04 mg / kg).
    1. Injectar todos os medicamentos por via intramuscular (IM) utilizando uma agulha G 21 com um comprimento de pelo menos 30 mm para porquinhos adultos. Realizar a injecção IM 1-3 cm atrás da orelha no músculo cervical lateral ou no músculo da coxa.
      Nota: Execute todos os procedimentos, sem provocar medo ou estresse nos animais ou que exijam manuseio brusco para injetar com segurança a pré-medicação.
  2. Coloque os porquinhos em posição dorsal-deitada.
  3. Quinze minutos após a administração da medicação pré-anestésica, iniciar a anestesia utilizando 1,5% de administração de isofluranoregis- por inalação.
    1. Continuar a inalação de isoflurano (1,5%) através de um tubo endotraqueal, seguido de um aumento na concentração de 2,5%, com o oxigénio (1,5 L / min) como o gás portador.
  4. Monitorar continuamente a frequência cardíaca, temperatura corporal, e saturação de oxigênio no sangue percutânea (SpO2) dos porquinhos durante a anestesia. Usar um cobertor de água em circulação a uma temperatura de 38-39 ° C para manter a temperatura corporal. Aplicar uma pomada oftalmológica para proteger os olhos de secar durante a anestesia.
  5. Siga classificação de Guedel para avaliar a profundidade da anestesia 13.

3. Preparativos para o isolamento de células e Cultivo

  1. Para cultivar as MSC derivadas de medula óssea e de fluido sinovial, preparar 500 ml de meio de Dulbecco modificado avançada águia (ADMEM) suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% Glutamax, 10 ng / mL de crescimento de fibroblastos básico factoR (bFGF), e 1,0% de penicilina-estreptomicina (10.000 UI e 10000 ng / mL, respectivamente, Pen-Strep).
    1. Incubar a ADMEM a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 num incubador de CO 2.
  2. Preparar 500 ml de solução salina de tampão de fosfato de Dulbecco (DPBS) de acordo com as instruções do fabricante para o isolamento de células e de lavar roupa.

4. Recolha de Medula Óssea a partir do miniporcos

  1. Seleccionar uma área de aproximadamente 15 x 15 cm de tamanho na crista ilíaca (Figura 1), e remover o cabelo a partir desta área usando lâminas de barbear de segurança esterilizados ou corta-eléctricos. Uma vez que o minipig está posicionado, alternadamente esfregar o local procedimento três vezes com os seguintes agentes de esterilização: iodopovidona e 70% de etanol. Depois que a área está completamente seco, aplique campos estéreis.
  2. Pré-revestimento da seringa de 10 ml com 100 U / ml de heparina, enxaguando-a com 3 - 4 ml de heparina antes ejecting o agente anti-coagulante.
    Nota: Execute esta etapa para evitar a coagulação na seringa durante a aspiração de medula óssea.
  3. Extrair um mínimo de 5 ml de medula óssea a partir do osso da crista ilíaca de minipig sob anestesia, utilizando um extractor de medula óssea (3,0 × 100 mm) firmemente ligado à heparina pré-revestidos seringa de 10 ml.

5. Isolamento de células extraídas da medula óssea e cultivo in vitro

  1. Isolar as células da medula óssea extraída.
    1. Dilui-se a medula é extraída com um volume igual de DPBS num tubo cónico de 15 ml à temperatura ambiente.
    2. Adicionar 3 ml de meio de centrifugação de densidade (Ficoll-Paque) para o tubo de 15 ml.
    3. Dilui-se uma camada de 4 ml de medula óssea com DPBS, que é colocado no suporte de centrifugação de densidade, sem misturar, e centrifuga-se que a 400 x g durante 40 min à temperatura ambiente.
    4. Colher a camada de células mononucleares(PTM) do creme leucocitário entre as duas camadas contendo o plasma (camada superior) e os meios de centrifugação de densidade (camada inferior), e transferir as multinacionais em um tubo de 15 ml.
    5. Diluir os EMNs transferidos com 7 - 8 mL de DPBS e centrifugar-los a 500 × g durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com DPBS.
    6. Suspende-se o sedimento celular em 2 ml de ADMEM e transferi-lo para um prato de cultura de tecidos de 35 mm. Incubar a placa de cultura a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2.
  2. O cultivo in vitro de células isoladas a partir de medula óssea.
    1. Após 48 horas, aspirar o meio com as células que não se ligaram aos prato, e substitui a 2 ml de ADMEM e incubar-lo a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Alterar o meio em cada três dias.
    2. Na 70 - 80% de confluência, lavar as células com DPBS, dissociar-los com 1 ml de 0,25%tripsina / EDTA, e incubar a 37 ° C durante 3-5 minutos até que as células de separar.
    3. Colher as células por meio de 10 ml de ADMEM, transferi-los para um tubo de 15 ml e centrifugar-los em 300 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante.
    4. Suspender as células colhidas em 1 ml de ADMEM fresco e contá-los usando um hemocitômetro.
    5. Colocar as células em de 5 - 7,5 x 10 5 / 25T balão contendo 4 ml de ADMEM e incubar a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2. Mudar o meio cada três dias.

6. Recolha de líquido sinovial das miniporcos

  1. Semelhante ao procedimento de aspiração da medula óssea, selecione uma área adequada de aproximadamente 15 x 10 cm (comprimento / largura) sobre a articulação femoral, e remover o cabelo usando lâminas de barbear de segurança esterilizados ou clippers elétricos, siga por procedimentos de higienização (passo 4.1).
  2. Inserir uma seringa de 3 ml com um 23 Gagulha na articulação após os marcos de palpação (patela e da crista da tíbia).
    1. Aplicar sucção suave para as seringas para a aspiração do líquido sinovial na articulação. O volume aproximado de fluido sinovial recolhidas de uma junta é de 0,5 - 1 ml, mas isto varia de acordo com o tamanho do minipig ou da articulação. Lave através DPBS na cavidade sinovial, se o volume recolhido de fluido sinovial é muito pequeno.
    2. retirar imediatamente a seringa para evitar a contaminação com sangue.

7. cela de isolamento do Collected líquido sinovial e cultivo in vitro

  1. Isolar as células do fluido sinovial aspirado.
    1. Dilui-se o fluido sinovial aspirado com um volume igual de DPBS em um tubo de 15 ml à temperatura ambiente.
    2. Para remover os detritos, filtrar o fluido sinovial diluída usando um coador de células de nylon de 40? M.
    3. Adicionar 10 ml de DPBS para o tubo contendo o filtrado sinovialfluido e centrifugar-lo a 400 x g durante 10 min à temperatura ambiente. Descartar o sobrenadante e lavar as células duas vezes com DPBS.
    4. Suspende-se o sedimento celular em 2 ml de ADMEM, colocar as células em um 2 - prato de cultura de tecidos de 3 x 10 5 células / 35 mm, com 2 ml de ADMEM, e incubar a 38,5 ° C numa atmosfera humidificada de 5% de CO 2 .
  2. Repita o passo 5.2 para o cultivo in vitro de MSCs derivadas do líquido sinovial isoladas.

8. pós-procedimento Cuidado dos miniporcos

  1. Se necessário, fechar a pele no local da injecção extractor de medula óssea com um único fio de sutura com agrafos da pele, após a recolha de medula óssea.
  2. Após o processo é completado, administrar uma injecção intramuscular de enrofloxacina (5 mg / kg) e meloxicam (0,2 mg / kg) para os porquinhos uma vez por dia durante 3 dias.
  3. Após o processo é completado, desinfectar a medula óssea e o local de recolha de fluido sinovialcom 0,1% de iodo povidona, uma vez por dia durante 3 dias. Observe cuidadosamente diariamente para monitorar os sinais de complicações (por exemplo, inchaço, pus ou vermelhidão).

9. A fenotipagem celular utilizando Citometria de Fluxo

  1. Quando as MSCs são de 70 - 80% confluentes em passagens 3 - 5, lavar as células com DPBS e tratá-los com 1 ml de 0,25% (v / v) de tripsina / EDTA. Em seguida, incubam-los a 37 ° C durante 3-5 minutos até que as células são separadas.
  2. Colher as células utilizando 10 mL de DPBS, transferi-los para um tubo de 15 ml e centrifugar-los em 300 × g durante 5 min à temperatura ambiente. Descartar a solução sobrenadante.
  3. Para fixar as células, suspender o sedimento celular em 10 ml de uma solução de formaldeído a 3,7% e mantê-los a 4 ° C durante um dia antes da análise.
    1. Um dia após a fixação, lavar as células duas vezes com DPBS utilizando centrifugação a 300 x g durante 5 min de cada vez. Descartar a solução sobrenadante.
    2. Suspende-se o sedimento de células em 4 mlde DPBS, que é suplementado com 1% (w / v) de albumina de soro bovino (BSA), e incuba-se o sedimento durante 1 hora a 4 ° C para bloquear interacções não específicas mediada por Fc.
    3. Distribuir alíquotas de 500 ul da suspensão de células em tubos de 1,5 ml.
    4. Para os anticorpos não conjugados (CD29 e vimentina), lavar as células por centrifugação a 300 x g durante 3 min. Descartar a solução sobrenadante.
    5. Suspende-se o sedimento celular em 500 ul de uma diluição de 1: 100 do anticorpo primário e incubar por 1 h a 4 ° C.
    6. Lavar as células duas vezes com 1% de albumina de soro bovino por centrifugação a 300 x g durante 5 min de cada vez. Descartar a solução sobrenadante.
    7. Suspende-se o sedimento celular em 500 ul de uma diluição 1: 100 de conjugado de isotiocianato de fluoresceína (FITC) -conjugated anticorpo secundário e incubar-lo durante 1 hora no escuro a 4 ° C.
  4. Para os anticorpos conjugados com FITC (de isotipo, CD34, CD44 e CD45), lavar as células por centrifugação a 300 x g durante 3 min. Descartar a solução sobrenadante.
    1. Suspende-se o sedimento celular em 500 uL de anticorpo a 1: 100 conjugado com FITC e incubar-lo durante 1 hora no escuro a 4 ° C.
    2. Para ambas as condições de coloração, lavar as células duas vezes com DPBS por centrifugação a 300 x g durante 5 min de cada vez. Descartar a solução sobrenadante.
    3. Suspender as células em 500 ul de DPBS, transferi-los para um tubo de 5 ml de fundo redondo, e analisar os resultados usando um citómetro de fluxo 8.

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Resultados

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Estabelecimento de MSCs derivadas da medula óssea e do fluido sinovial de miniporcos

MSCs foram isolados com sucesso a partir da medula óssea e das articulações sinoviais articulares dos porquinhos e expandidas in vitro (Figura 2). Seringa de aspiração de fluido sinovial é simples, e é possível obter células aderentes suficientes durante a cultura in vitro das células primári...

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Discussão

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Miniporcos foram utilizados para estabelecer o isolamento MSCs a partir de medula óssea e no fluido sinovial. Para eliminar várias condições fisiológicas, tais como idade, sexo, e as doenças, minipigs de isog�nicas doadores fundo foram escolhidos para avaliar com precisão a caracterização depende fonte de células. Os porcos são conhecidos por serem anatomicamente, fisiologicamente, e geneticamente semelhantes aos seres humanos, e em particular, podem produzir miniporcos órgãos pareados por tamanho; portanto, eles pode...

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Divulgações

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Os autores declaram não ter conflito de interesses.

Agradecimentos

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Reconhecemos com gratidão o apoio financeiro fornecido pelo Programa Next-Generation BioGreen 21 (No. PJ007969), Administração de Desenvolvimento Rural e a Fundação Nacional de Pesquisa (concessão nº. NRF-2015R1D1A1A01056639) da República da Coreia.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Dulbecco Avançado' s meio de águia modificado (ADMEM)Gibco12491-023MSC meio
de cultura Dulbecco' s solução salina tamponada com fosfato (DPBS)Gibco14190-144Meio de lavagem celular, livre de Ca2+/Mg2+
Soro bovino fetal (FBS)Gibco16000-044Componente do meio MSCs
GlutamaxGibco35050-061Componente do meio MSCs
Penicilina/estreptomicinaGibco10378-016Componente do meio MSCs
Fator de crescimento básico de fibroblastos (bFGF)SimgaF0291Componente de MSCs meio
Albumina de soro bovino (BSA)SigmaA6003Componente de MSCs meio
Tripsina-EDTAGibco25200-072Reagente de dissociação celular 
β-mercaptoetanolSigmaM7522Componente do meio MSCs
Anticorpo isotípicoBD PharmingenBD 550616Controle de isotipo
CD29 anticorpoBD PharmingenBD 552369Integrina beta-1 MSCs marcador
CD44 anticorpoBD PharmingenBD 553133Glicoproteína de superfície celular MSCs marcador
CD45 anticorpoBD PharmingenBD 340664Marcador de células-tronco hematopoiéticas
anticorpo CD34BD PharmingenBD 555821Marcador de células-tronco hematopoiéticas
anticorpo CD90BD PharmingenBD 555595Marcador de glicoproteína de membrana Thy-1 MSCs MHC
Anticorpo Classe IISanta CruzSC-32247 Marcador decélulas apresentadoras de antígeno
Anticorpo VimentinaSigma Sigma-S6389Marcador de MSCs de filamento intermediário tipo III
Fosfatase alcalinaPromegaS3841Mistura de 5-bromo-4-cloro-3-indolil-fosfato (BCIP) e nitro azul de tetrazólio (NBT)
Ficoll-PaqueGE Healthcare17-1440-02Centrifugação com gradiente de densidade
Filtro de célulasBD Falcon35234040 µ m filtro de células de nylon
tubo cônico de poliestireno de 15 mlBD Falcon351095Coleta de amostras e isolamento celular
Placas de 35 mmNunc153066Placa de cultura de células
Extrator de medula ósseaGmbH Medizintechnologie, Alemanha1145-1W010TrokaBone, 3,0 x 100 mm
Câmara de hematócritoMarinfeld640130Câmara
AtropinaJeil Pharmaceutical Co, CoreiaSulfato de Atropina Hidrato
AcepromazinaSamu Median, CoreiaMedicamento pré-anestésico sedativo e antiemético
MedetomidinaPfizerAnestésico e analgésico
EnrofloxacinaBayer Healthcare, AlemanhaAntibióticos
MeloxicamSobre Medicina Veterinária, ArgentinaAnti-inflamatório e analgésico
IsofluranoHana pharm, CoreiaAnestesia inalatória
Povidona iodo Korea Pharma, CoreiaAgente de esterilização
EtanolSigmaE7023Agente de esterilização
HeparinaSigmaH3393Agente anticoagulante
FormaldeídoSigmaF8775Agente de fixação celular
Pomada oftalmológica PfizerOxitetraciclina HCl com sulfato de polimixina B Manta
de água circulanteGaymar IndustriesSistema de aquecimento durante e após a anestesia
Grampeador de peleCovidien, EUASutura fechamento da pele
CO2 IncubadoraThermo Forma3111Equipamento de cultura de células
Citômetro de fluxoBD BiosciencesAnalisador celular
MinipigPWG Genetics Korea, Ltd.Porco miniaturatipo T
de contagem de células do Sul do Sul do Sul do Sul

Referências

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