Modelando Myotonic distrofia 1 em células C2C12 de mioblastos

Resumo

Neste protocolo, apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de modelos de mioblastos distrofia miotônica 1, incluindo otimizado manutenção C2C12 celular, transfecção gene / transdução e diferenciação dos miócitos.

Resumo

A distrofia miotônica 1 (DM1) é uma forma comum de distrofia muscular. Embora vários modelos animais foram estabelecidos para DM1, modelos celular de mioblastos ainda são importantes porque eles oferecem uma alternativa eficiente celular para estudar eventos celulares e moleculares. Embora as células C2C12 de mioblastos tem sido amplamente utilizado para estudar a miogenese, a resistência à transfecção do gene, ou a transdução virai, dificulta a pesquisa em células C2C12. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado que inclui procedimentos de manutenção diária, transfecção e transdução para introduzir genes em mioblastos C2C12 e a indução de diferenciação dos miócitos. Colectivamente, estes processos permitem melhores eficiências de transfecção / transdução, bem como os resultados consistentes de diferenciação. O protocolo descrito no estabelecimento de modelos de mioblastos DM1 celulares beneficiaria o estudo de distrofia miotónica, bem como outras doenças musculares.

Introdução

Distrofia miotônica (DM) é uma doença autossômica dominante que afeta vários sistemas, principalmente músculos cardíacos e esqueléticos ^1. Existem dois subtipos da doença, DM1 e DM2. DM1 é mais comum e tem uma manifestação mais grave do DM2 ^2. A mutação genética subjacente DM1 é uma expansão de repetições de tripletos CUG localizado na região não traduzida 3 '(UTR) do gene da proteína quinase MS (DMPK) ^3. O número de repetição CUG em indivíduos não afectados varia de 5 a 37. Por outro lado, aumenta a mais de 50, e, por vezes, até milhares em doentes DM1 ^4. Como resultado, as proteínas de ligação a ARN, tais como muscleb....

Protocolo

1. Cultura celular C2C12

1. Manter mioblastos de ratinho C2C12 em uma placa de 100 mm de meio de crescimento (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) suplementado com soro de bovino fetal a 20%, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina. Permitir células C2C12 passadas para tornar-se cerca de 50 - 60% confluentes.
2. Descartar o meio de crescimento e células C2C12 lavar com solução salina de 3 ml à temperatura ambiente de fosfato tamponada (PBS). Remover o PBS e adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina-EDTA para desprender as células. Colocar a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO ₂ incubadora durante 3-....

Resultados

células C2C12 foram transfectadas com GFP-CUG5 ou GFP-CUG200. Após a selecção de resistência a drogas, estáveis ​​piscinas foram estabelecidas, que podem ser visualizados por expressão da GFP (Figura 1A). Formação de miotubos diferenciadas nos mioblastos foi detectado por imunocoloração miosina de cadeia pesada ¹⁰ (Figura 1B). A quantificação de formação de miotubos demonstrou que os índices de fusão foram diminuiu de 35,4 ± 4,1% para 2,6 ± 1,.......

Discussão

A linha de células C2C12 foi usado como um modelo para estudar miogénese ^11-14. Estas células manter uma aparência do tipo fibroblastos, proliferam rapidamente em meios contendo 20% de soro fetal bovino e facilmente diferenciar em meio contendo 2% de soro equino ^15. O rápido crescimento e diferenciação são características vantajosas em um modelo de célula miogénese. Aqui, demonstramos a utilização de plasmídeo, retroviral, e vectores lentivirais para introduzir ADNc, 3'-UTR, e shRNA em células .......

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
DMEM, glicose alta	Life Technologies	11965-084	para meio de cultura
Soro Fetal Bovino - Premium	Atlanta Biologicals	S11150	para meio de cultura
Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x)	Life Technologies	10378-016	para meio
de cultura Insulina do pâncreas bovino	Sigma Aldrich	I6634-100MG	para meio de diferenciação
equino soro	Atlanta Biologicals	S12150	para meio de diferenciação
FuGENE  Reagente de Transfecção HD	Promega	E2311	para transfecção
Sulfato G418	Gold Biotechnology	G-418-10	para seleção resistente a medicamentos
Cloridrato de puromicina	Sigma Aldrich	sc-108071	para seleção resistente a medicamentos
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 poços	Life Technologies	NP0323BOX	para western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x)	Life Technologies	NP00061	para western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)	Life Technologies	NP0002	para western blot
Amersham Protran Suportado 0,2 NC, 300 mm x 4 m	GE saúde ciências da vida	10600015	para western blot
MF 20	Banco de Hibridoma de Desenvolvimento	MF 20	Ab primário para imunocoloração
Anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra anti-rato, conjugado Texas Red-X Thermo	Fisher Scientific	T-862	secundário Ab para imunocoloração
Uma etapa qRT-PCR MasterMix	AnaSpec	05-QPRT-032X	para qRT-PCR
TriPure Reagente	de isolamento Roche	11667165001	para isolamento de RNA
CUG-BP1 Anticorpo (3B1)	santa cruz	sc-20003	primário Ab western blot
Actin Anticorpo	santa cruz	sc-1615	cabra policlonal IgG para controle de carga
293T Ecopack	Células 631507 Clontech		para preparação de retrovírus
pMSCV-puro	Clontech	634401	vetor retroviral vazio para preparação de retrovírus
pMSCV-Celf1Flag-puro	construído em casa	não disponível	codificação de vetor retroviral Celf1Flag, usado na preparação de retrovírus
psPAX2	presente de Didier Trono	não disponível	para preparação de lentivírus
Presente pMD2.G	de Didier Trono	não disponível	para preparação de lentivírus
Presente GFP-CUG5	de M.S. Mahadevan	não disponível	detalhes na referência 10
Presente GFP- CUG200	de M.S. Mahadevan	não disponível	detalhes na referência 10
Tritão  X-100	Sigma Aldrich	X100	para imunocoloração
de paraformaldeído	Sigma Aldrich	P6148	para imunocoloração
TWEEN  20	Sigma Aldrich	P9416	para imunocoloração
DAPI	Sigma Aldrich	D9542	para imunocoloração