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Artigo de método

Modelando Myotonic distrofia 1 em células C2C12 de mioblastos

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DOI:

10.3791/54078

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29 de julho de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology and Biochemistry, University of Houston, 2Department of Economics, University of Houston, 3Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Nanchang University

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

Neste protocolo, apresentamos os procedimentos para o estabelecimento de modelos de mioblastos distrofia miotônica 1, incluindo otimizado manutenção C2C12 celular, transfecção gene / transdução e diferenciação dos miócitos.

Resumo

A distrofia miotônica 1 (DM1) é uma forma comum de distrofia muscular. Embora vários modelos animais foram estabelecidos para DM1, modelos celular de mioblastos ainda são importantes porque eles oferecem uma alternativa eficiente celular para estudar eventos celulares e moleculares. Embora as células C2C12 de mioblastos tem sido amplamente utilizado para estudar a miogenese, a resistência à transfecção do gene, ou a transdução virai, dificulta a pesquisa em células C2C12. Aqui, descrevemos um protocolo otimizado que inclui procedimentos de manutenção diária, transfecção e transdução para introduzir genes em mioblastos C2C12 e a indução de diferenciação dos miócitos. Colectivamente, estes processos permitem melhores eficiências de transfecção / transdução, bem como os resultados consistentes de diferenciação. O protocolo descrito no estabelecimento de modelos de mioblastos DM1 celulares beneficiaria o estudo de distrofia miotónica, bem como outras doenças musculares.

Introdução

Distrofia miotônica (DM) é uma doença autossômica dominante que afeta vários sistemas, principalmente músculos cardíacos e esqueléticos 1. Existem dois subtipos da doença, DM1 e DM2. DM1 é mais comum e tem uma manifestação mais grave do DM2 2. A mutação genética subjacente DM1 é uma expansão de repetições de tripletos CUG localizado na região não traduzida 3 '(UTR) do gene da proteína quinase MS (DMPK) 3. O número de repetição CUG em indivíduos não afectados varia de 5 a 37. Por outro lado, aumenta a mais de 50, e, por vezes, até milhares em doentes DM1 4. Como resultado, as proteínas de ligação a ARN, tais como muscleblind-like 1 (MBNL1), CUGBP, e elav-1 como família (Celf1), são desregulada. Devido ao sequestro nas repetições CUG expandidas, MBNL1 perde a sua capacidade de regular a splicing alternativo 5. Celf1, por outro lado, é sobre-regulada 6,7. A sobre-expressão de Celf1 está associada com a perda de músculoe fraqueza, que não são atribuídos a perda da função MBNL1. Os modelos animais simulando alterações relacionadas-DM1, incluindo DMPK 3'-UTR expansão CUG, perda de MBNL1, e superexpressão de Celf1, foram estabelecidas. No entanto, a modelagem DM1 em mioblastos oferece uma alternativa eficiente, especialmente para dissecar eventos celulares e moleculares relacionados-DM1.

A linha celular de mioblastos C2C12 foi isolado pela primeira vez a partir de músculo de rato C3H feridos e amplamente utilizado para estudar diferenciação 8,9 miogénica. células C2C12 proliferam rapidamente em soro fetal bovino (FBS) molecular contendo meios e prontamente sofrer diferenciação de FBS quando se esgota. No entanto, usando este modelo de diferenciação de mioblastos apresenta dois desafios: células C2C12 são muitas vezes resistentes a transfecção de genes / transdução viral; e pequenas variações na manipulação celular e processo de diferenciação pode levar a alterações marcadas na formação de miotubos.

Nosso laboratório utiliza rotineiramente mioblastos C2C12 como acmodelo ell e desenvolveu protocolos que efetivamente entregar genes por transfecção de plasmídeo, transdução retroviral, e transdução lentiviral em linha celular C2C12 10. No vídeo, demonstramos os procedimentos otimizados para transfecção / transdução C2C12 células e manter a consistência diferenciação no estabelecimento de modelos de mioblastos DM1.

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Protocolo

1. Cultura celular C2C12

  1. Manter mioblastos de ratinho C2C12 em uma placa de 100 mm de meio de crescimento (meio de Eagle modificado por Dulbecco (DMEM)) suplementado com soro de bovino fetal a 20%, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina. Permitir células C2C12 passadas para tornar-se cerca de 50 - 60% confluentes.
  2. Descartar o meio de crescimento e células C2C12 lavar com solução salina de 3 ml à temperatura ambiente de fosfato tamponada (PBS). Remover o PBS e adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina-EDTA para desprender as células. Colocar a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 3-5 min.
  3. Neutralizar a tripsina, adicionando meio de crescimento de 3 ml. Pipetar 6 - 8 vezes para suspender as células. Adicionar 1 ml de suspensão de células para uma nova placa de 100 mm e incubar a 37 ° C, 5% de CO 2.

2. C2C12 transfecção celular / transdução e Seleção

  1. C2C12 transfecção de plasmídeo
    1. 24 h antes da transfecção, pfinal 7,0 x 10 5 células C2C12 para um poço de uma placa de seis poços para cada transfecção.
      Nota: Isto conduz a 50 - 60% de confluência no momento da transfecção.
    2. Permitir que o reagente de transfecção de vir até à temperatura ambiente antes de usar.
    3. Adicionar 2 ug de ADN de plasmídeo (GFP-CUG5 ou GFP-CUG200) em 200 ul de pré-aquecido meio isento de soro e vortex brevemente. Adiciona-se reagente de transfecção 6 ul para a forma e misturar imediatamente durante 30 segundos usando um vórtice. Incubar a mistura durante 30 min à temperatura ambiente.
    4. Mudar os meios de comunicação das células C2C12 de 2,5 ml de meio de crescimento isento de soro. Adicionar a mistura de transfecção às células após a incubação. Devolver as placas para um 5% de CO2, 37 ° C incubadora.
    5. Manter as células em meio de crescimento da mistura de transfecção / isento de soro durante 4 horas ou até a noite. Mudança de mídia de volta para os meios de crescimento no dia seguinte ou quando citotoxicidade é aparente.
      Nota: A citotoxicidade é avaliada através de inspecção microscópica da cells. Observar as mudanças na morfologia celular e descolamento celular. Enquanto não existe uma citotoxicidade evidente, incubação durante a noite em meio de crescimento isento de soro aumenta a transfecção.
    6. Seleccionar as células 48 horas após a transfecção por adição de 1,2-1,6 mg / ml de G418 para ~ 10 dias até que a cultura de controlo (transfectadas sem os plasmídeos) não tem células vivas. Alterar os meios de comunicação a cada dois dias com meio de crescimento suplementado com G418.
    7. Manter as células resistentes a G418 em meio de crescimento e 5% de CO2 a 37 ° C para as experiências subsequentes.
  2. preparação de retrovírus e transdução retroviral C2C12
    1. Prepare meio de cultura de células HEK 293, completando DMEM de alto teor de glucose com 10% de soro fetal bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina.
      1. Aproximadamente 24 horas antes da transfecção, 4,0 x 10 placa 6 células de empacotamento ecotrópicas HEK 293 com base em uma placa de 100 milímetros (80% de confluência em transfecção) Cmeio de cultura celular ontaining.
    2. Permitir que o reagente de transfecção de vir até à temperatura ambiente antes de usar.
    3. Misturar 15 ug de ADN plasmídeo (pMSCV-puro ou pMSCV-Celf1Flag-Puro) em 1 ml de meio de crescimento isento de soro. brevemente Vortex. Adicionar 30 ul de reagente de transfecção a partir do passo 2.2.2 para dentro do tubo de meio de crescimento de DNA / isento de soro, e misture bem com vórtex. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Adicionar gota a gota, a mistura de transfecção das células de empacotamento ecotrópico HEK 293 com base em. Agite suavemente as placas e devolvê-los de volta para o CO2 a 5%, 37 ° C incubadora. Após 24 h, alterar os meios de comunicação para meio de crescimento fresco 10 ml de pré-aquecido.
    5. Colher o sobrenadante (contendo retrovírus) 48 horas após a transfecção utilizando uma pipeta e transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 ml. Adicionar 10 ml de novas mídias quentes para a placa e devolvê-lo para a incubadora. Manter o sobrenadante a 4 ° C.
      Nota: A mídia é adicionado delicadamente para tele lado do poço de modo a não perturbar a monocamada celular.
    6. Colher o segundo lote de sobrenadante 60 horas ap a transfeco e permitir a sua com o sobrenadante a partir de 2.2.5. Centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 min para remover os detritos celulares.
    7. Transferir o sobrenadante para um novo tubo de centrífuga de 50 ml. Use retrovírus para transduzir células C2C12 neste ponto por prosseguir para o passo 2.2.9 ou aliquota e armazenar o sobrenadante a -20 ° C para uso futuro.
    8. Descongelar o retrovírus de 2.2.7, à temperatura ambiente, se um lote congelado é usado aqui.
      Nota: Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento.
    9. Placa células C2C12 no mesmo dia de transdução apontando para 30 - 40% de confluência.
      1. Descartar o meio de crescimento e células C2C12 lavar com 3 ml de PBS temperatura ambiente. Remover o PBS, adicionar 500 mL de 0,25% de tripsina-EDTA, e incuba-se a placa num banho a 37 ° C, 5% de CO 2 incubadora durante 3-5 min.
      2. Neutraliza-se a tripsina por adição de 3 mL de crescimento Medio. Pipetar 6 - 8 vezes para suspender as células. Contagem de células utilizando um hemocitómetro e adicionar 8,0 x 10 5 células C2C12 para uma placa de 60 mm.
    10. Adicionar 0,5 ml de retrovírus para infectar uma placa 60 milímetros de células em 3 media ml crescimento. Retornar a placa para a incubadora.
    11. Substituir com 3 ml de meios frescos completados com antibiótico de selecção (puromicina 1-3 ug / ml) 48 h após a infecção. Substitua 3 ml de meio com antibióticos todos os dias para a 5 dias até que a cultura de controle C2C12 não transduzidas morre.
  3. preparação lentivírus e transdução lentiviral C2C12
    Nota: Execute todos os procedimentos relacionados com o lentivírus no Nível de Biossegurança 2 gabinete e seguir as orientações de segurança biológica. resíduos líquidos contendo o vírus devem ser desinfectados antes de serem eliminados.
    1. Placa de 4,0 x 10 6 células 293T em uma placa de 100 mm (~ 80% de confluência no dia da transfecção) com células HEK 293 de meio de cultura celular (DMEM de alto teor de glucose, suplementado com 10% de fetalde soro bovino, 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, e 2 mM de L-glutamina) 24 h antes da transfecção.
    2. Aquecer o reagente de transfecção até à temperatura ambiente. Misturar os vectores de embalagem lentiviral (4 ug pMD2.G e 6 ug psPAX2) em conjunto com o vector de transferência de 8 ug de lentivírus (Celf1 shRNA controlo scrambled ou shRNA) em 1 ml de meio de cultura de células sem soro. brevemente Vortex.
    3. Adicionar 36 ul de reagente de transfecção pré-aquecido para o tubo de DNA / DMEM e misturar bem por vórtice. Incubar a mistura à temperatura ambiente durante 30 min.
    4. Remover as células 293T da incubadora e adicionar a mistura de transfecção para a placa. Agite suavemente a placa e devolvê-lo de volta para 5% de CO2, 37 ° C incubadora. Após 24 horas, substitui-se a mistura de transfecção com 10 ml de meio de cultura fresco.
    5. Recolhe-se o sobrenadante contendo lentivírus 48 h após a transfecção e transferi-lo para um tubo de centrífuga de 50 ml. Adicionar 10 ml quentes novos meios para a placa e devolvê-lopara incubadora. Armazenar o sobrenadante a 4 ° C.
    6. Recolhe-se o segundo lote de sobrenadante 60 horas ap a transfeco e combiná-la com o sobrenadante a partir de 2.3.5. brevemente centrifugar a 500 xg, 4 ° C durante 7 min.
    7. Transferir o sobrenadante para um tubo de centrífuga de 50 ml fresco. Se estiver usando vírus fresco, avance para o passo 2.3.9. No futuro, a loja de vírus contendo o sobrenadante a -20 ° C em alíquotas de 10 ml.
    8. Descongelar o vírus a partir de 2.3.7, à temperatura ambiente antes da sua utilização, se um lote congelado é usado.
      Nota: Evite vários ciclos de congelamento e descongelamento.
    9. células de chapa de C2C12-CUG200 (obtida na Secção 2.1), tal como descrito em 2.2.9, no mesmo dia da transdução.
      Nota: Apontar para 30 - 40% de confluência.
    10. Adicionar 0,5 ml de vírus para infectar uma placa de 60 mm de C2C12-CUG200 e devolver a placa à incubadora.
    11. Substituir o meio de cultura com meio fresco suplementado com o antibiótico de selecção (puromicina 1-3 ug / ml) 72 horas após a transdução.Atualizar meios de cultura todos os dias com o antibiótico de seleção para a 5 dias até que toda a cultura de controle C2C12-CUG200 não transduzidas morre.
    12. Use Western blot para verificar a knockdown Celf1 em células transfectadas GFP-CUG200.

3. Diferenciação Celular C2C12

  1. Placa 2 X 10 6 células em um poço de uma placa de 6 poços em 2,5 ml de meio de crescimento 24 h antes do início da diferenciação.
    Nota: A densidade de revestimento pode ser ajustada de modo que confluência completa é atingida em 24 horas.
    1. Lavar as células confluentes com PBS e adicionar 2,5 ml de meio de baixa diferenciação de soro (meio de Eagle modificado suplementado com 2% de soro de equino, penicilina 100 U / ml de Dulbecco, 100 ug / ml de estreptomicina, 2 mM de L-glutamina, e 1? M de insulina) . Substituir o meio de dois em dois dias.
      Nota: Mantenha a insulina estoque congelado e adicioná-lo para a mídia em cada mudança de meio.
  2. Durante a diferenciação C2C12, coleta de amostras para quanquan- RT-PCR (ver secção 4) nos seguintes momentos: Day0, 1, 2, 4 e 6. Processo de cultura para a imunocoloração no dia 6-8 (ver secção 5).

4. Isolamento de ARN e RT-PCR quantitativo

  1. Use o protocolo do fabricante para isolamento de RNA. Após o isolamento, ressuspender o sedimento de ARN em 30 de água livre de RNase mL e pipeta cima e para baixo várias vezes.
    Nota: As amostras podem prosseguir para RT-PCR quantitativo, ou pode ser armazenado a -80 ° C.
  2. Use um kit de RT qPCR para RT-PCR quantitativa 10 e siga as instruções do fabricante. Preparar a mistura de reacção de acordo com a Tabela 1.
Componente Volume (uL) concentração final
tampão de reacção 2x 10 1x
iniciador directo 0,5 200 nM
iniciador inverso 0,5 200 nM
Probe 0,5 200 nM
Transcriptase reversa e RNase Inhibitor 0,1 0,25 U / ml
Modelo 1 100 ng de ARN total
RNase água livre 7,4 N / D
Mix total 20

Tabela 1. RT-PCR quantitativo mestre preparação da mistura de

  1. Execute a 20 mL de reação RT-qPCR utilizando perfil térmico Tabela 2.
passo de transcrição reversa 30 min, 48 ° C
polímero de DNAactivação ase / inactivação transcriptase reversa 10 min, 95 ° C
40 ciclos 15 seg, 95 ° C
1 min, 60 ° C

Tabela perfil térmico 2. RT-PCR quantitativo

5. A imunocoloração

  1. Fixar a cultura em monocamada em 2,5 mL preparada de fresco paraformaldeído a 4% / PBS à temperatura ambiente durante 10 min.
  2. Permeabilizar as amostras em 2,5 ml de 0,1% de Triton X-100 / PBS durante 30 min à temperatura ambiente.
  3. Transferir as amostras para uma câmara humidif içada. Bloquear as amostras em 2,5 ml de tampão (0,1% de surfactante não iónico / PBS, 10% soro normal de cabra) de bloqueio durante 30 minutos a 37 ° C.
  4. Descartar o tampão de bloqueio e aplicar primário 800 ul de anticorpo contra a cadeia pesada da miosina diluída em tampão (1: 100) de bloqueio. Incubar durante a noite numa câmara humidificada à temperatura ambiente.
  5. Lave a placa 3 timES (10 min cada) com 2,5 ml de tampão de lavagem (0,1% de polisorbato 20 / PBS) no dia 2.
  6. Remover o tampão de lavagem e aplicar 800 ul de anticorpo secundário (IgG de cabra anti-ratinho, 1: 500 diluído em PBS). Incubar numa câmara humidificada à temperatura ambiente durante 1 h.
  7. Lavar duas vezes (10 min cada) com 2,5 ml de tampão de lavagem.
  8. Incubar com DAPI 800 ul (1 ug / ml, diluiu-se em água destilada desionizada H2O) durante 5 min.
  9. Lava-se com 2,5 ml de tampão de lavagem mais uma vez durante 10 min.
  10. Mudar o tampão de lavagem de 2,5 ml de PBS e usar um microscópio fluorescente para capturar as imagens.

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Resultados

células C2C12 foram transfectadas com GFP-CUG5 ou GFP-CUG200. Após a selecção de resistência a drogas, estáveis ​​piscinas foram estabelecidas, que podem ser visualizados por expressão da GFP (Figura 1A). Formação de miotubos diferenciadas nos mioblastos foi detectado por imunocoloração miosina de cadeia pesada 10 (Figura 1B). A quantificação de formação de miotubos demonstrou que os índices de fusão foram diminuiu de 35,4 ± 4,1% para 2,6 ± 1,...

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Discussão

A linha de células C2C12 foi usado como um modelo para estudar miogénese 11-14. Estas células manter uma aparência do tipo fibroblastos, proliferam rapidamente em meios contendo 20% de soro fetal bovino e facilmente diferenciar em meio contendo 2% de soro equino 15. O rápido crescimento e diferenciação são características vantajosas em um modelo de célula miogénese. Aqui, demonstramos a utilização de plasmídeo, retroviral, e vectores lentivirais para introduzir ADNc, 3'-UTR, e shRNA em células ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Agradecemos aos Drs. Tom Cooper do Baylor College of Medicine, Mani S. Mahadevan da Universidade de Wisconsin-Madison e Didier Trono da Universidade de Genebra pelos reagentes. Este trabalho é apoiado por um fundo inicial da Universidade de Houston (YL), uma bolsa da American Heart Association (YL, 11SDG5260033) e a Fundação Nacional de Ciências Naturais da China (XP, 81460047).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
DMEM, glicose altaLife Technologies11965-084para meio de cultura
Soro Fetal Bovino - PremiumAtlanta BiologicalsS11150para meio de cultura
Penicilina-Estreptomicina-Glutamina (100x)Life Technologies10378-016para meio
de cultura Insulina do pâncreas bovinoSigma AldrichI6634-100MGpara meio de diferenciação
equino soroAtlanta BiologicalsS12150para meio de diferenciação
FuGENE  Reagente de Transfecção HDPromegaE2311 para transfecção
Sulfato G418Gold BiotechnologyG-418-10para seleção resistente a medicamentos
Cloridrato de puromicinaSigma Aldrichsc-108071para seleção resistente a medicamentos
NuPAGE Novex 4 - 12% Bis-Tris Protein Gels, 1,0 mm, 15 poçosLife TechnologiesNP0323BOXpara western blot
NuPAGE Transfer Buffer (20x)Life TechnologiesNP00061para western blot
NuPAGE MES SDS Running Buffer (20x)Life TechnologiesNP0002para western blot
Amersham Protran Suportado 0,2 NC, 300 mm x 4 mGE saúde ciências da vida10600015para western blot
MF 20Banco de Hibridoma de DesenvolvimentoMF 20Ab primário para imunocoloração
Anticorpo secundário IgG (H+L) de cabra anti-rato, conjugado Texas Red-X ThermoFisher ScientificT-862secundário Ab para imunocoloração
Uma etapa qRT-PCR MasterMixAnaSpec05-QPRT-032Xpara qRT-PCR
TriPure Reagentede isolamento Roche11667165001para isolamento de RNA
CUG-BP1 Anticorpo (3B1)santa cruzsc-20003primário Ab western blot
Actin Anticorposanta cruzsc-1615cabra policlonal IgG para controle de carga
293T EcopackCélulas 631507 Clontechpara preparação de retrovírus
pMSCV-puroClontech634401vetor retroviral vazio para preparação de retrovírus
pMSCV-Celf1Flag-puroconstruído em casanão disponívelcodificação de vetor retroviral Celf1Flag, usado na preparação de retrovírus
psPAX2presente de Didier Trononão disponívelpara preparação de lentivírus
Presente pMD2.Gde Didier Trononão disponívelpara preparação de lentivírus
Presente GFP-CUG5de M.S. Mahadevannão disponíveldetalhes na referência 10 
Presente GFP- CUG200de M.S. Mahadevannão disponíveldetalhes na referência 10 
Tritão  X-100Sigma AldrichX100para imunocoloração
de paraformaldeídoSigma AldrichP6148para imunocoloração
TWEEN  20Sigma AldrichP9416para imunocoloração
DAPISigma AldrichD9542para imunocoloração

Referências

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  17. Koshelev, M., Sarma, S., Price, R. E., Wehrens, X. H. T., Cooper, T. A. Heart-specific overexpression of CUGBP1 reproduces functional and molecular abnormalities of myotonic dystrophy type 1. Hum Mol Genet. 19 (6), 1066-1075 (2010).

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Reimpressões e permissões

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