Uma abordagem para reforçar Alinhamento e mielinização do gânglio de raiz dorsal neurônios

Resumo

Este protocolo descreve o isolamento de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) isolados de ratos e a cultura de neurônios DRG em um sistema estático de cultura de células pré-esticadas para melhorar o alinhamento dos axônios, com subsequente co-cultura de células de Schwann (SCs) para promover a mielinização.

Resumo

A regeneração do axônio é um processo caótico devido em grande parte ao alinhamento desorganizado do axônio. Portanto, para que um número suficiente de axônios regenerados faça a ponte sobre o local da lesão, é necessário um alinhamento axonal adequadamente organizado. Como a desmielinização após lesão nervosa prejudica fortemente a capacidade condutora dos axônios sobreviventes, a remielinização é fundamental para o funcionamento bem-sucedido dos nervos regenerados. Anteriormente, demonstramos que as células-tronco mesenquimais (MSCs) se alinhavam em uma superfície anisotrópica induzida por pré-estiramento porque as células podem sentir uma rigidez efetiva maior na direção esticada do que na direção perpendicular. Também mostramos que uma superfície anisotrópica decorrente de uma superfície pré-esticada mecânica afeta de forma semelhante o alinhamento, bem como o crescimento e a mielinização dos axônios. Aqui, fornecemos um protocolo detalhado para preparar uma superfície anisotrópica pré-esticada, o isolamento e a cultura de neurônios do gânglio da raiz dorsal (DRG) em uma superfície pré-esticada e mostramos o comportamento de mielinização de uma co-cultura de neurônios DRG com células de Schwann (SCs) em uma superfície pré-esticada.

Introdução

Em lesões nervosas, os cotos proximal e distal do nervo são muitas vezes impedidos de realinhamento direta dos fascículos nervosos devido ao local da lesão ^1-2. Normalmente, intervalos de axônios são compostos por feixes altamente ordenadas e alinhadas de axônios, que formam complexas redes de conectividade. No entanto, a regeneração do nervo é um processo caótico devido ao alinhamento axônio mal organizado ^3-4. Por isso, para gerar um número suficiente de regeneração de axónios que preenchem o local da lesão, é necessário para induzir o alinhamento axonal bem organizada. Além disso, a desmielinização acompanha lesões nervosas devido à morte das células mielinizantes no local da lesão. Desde desmielinização prejudica fortemente a capacidade condutora de sobreviver axônios, os tratamentos visam desmielinização ou promover remielinização são significativos para a recuperação funcional após a lesão do nervo ^5. Assim, o objetivo deste protocolo é para ilustrar uma abordagem de engenharia que aborda estas duas questõesda regeneração do nervo.

Anisotropia de superfície, que é definido como a diferença, quando medida ao longo de eixos diferentes, nas propriedades físicas ou mecânicas de um material, tem sido aplicado para influenciar alinhamento de células, o crescimento, a migração e ^6-7. Além de topografia, existem outros métodos para induzir a anisotropia. Anteriormente, foi investigada anisotropia superfície induzida por processos mecânicos de pré-alongamento estático de poli-dimetil-siloxano (PDMS) de membrana. A teoria da "Super pequena deformação imposta em grande" previu que a rigidez efectiva das células sentir na direcção esticada difere da direcção perpendicular, e esta diferença de rigidez efectiva é devido à superfície de anisotropia ^8. As células estaminais mesenquimais (MSCs) cultivadas numa membrana pré-esticado PDMS são capazes de detectar a anisotropia puxando de forma activa à superfície e, como resultado, alinham na direcção pré-esticado ^9. Da mesma forma, uma superfície AR anisotrópicaisinger a partir de uma superfície pré-esticado mecânica afeta o alinhamento, assim como o crescimento e a mielinização do gânglio da raiz dorsal (DRG) axônios ^10. Aqui nós fornecemos um protocolo para a indução de anisotropia de superfície sobre um substrato pré-estirado estática PDMS para melhorar a regeneração do axônio ^10.

Para obter o alinhamento axônio, características topológicas com padrões desejados, relatou para fornecer orientação contato através de fibras e canais ^6,11-12 alinhados, foram demonstrados para facilitar o alinhamento axônio ^11,13. No entanto, relataram técnicas para induzir alinhamento axónio através características topológicas, tais como fibras, e canais de modelação, não foram capazes de prolongar e aumentar a espessura dos axónios. Em contraste, gradual estiramento mecânico levou ao alinhamento axónio na direcção do estiramento, com axónios compridas e espessas, que aumentaram com a magnitude do troço ^14. No entanto, com dispositivo de motor movido in vivo não éfactível. Em contraste, anisotropia induzida pré-esticado estática é menos complicado e pode ser mais facilmente incorporados em futuros desenhos de andaime para aplicações in vivo.

Neste protocolo, um sistema de cultura de células pré-esticado estático é usado para induzir a anisotropia superfície sem características topológicas. O sistema de cultura de pré-esticado é constituído por uma membrana de PDMS, um quadro esticável e uma etapa de alongamento, após o que a membrana é fixada sobre a armação e um troço magnitude predeterminada é aplicada sobre a fase de alongamento. neurónios DRG isoladas de fresco de cultura na superfície pré-esticado por até 21 dias são monitorados para o alinhamento axónio e espessura. Posteriormente, as células de Schwann (SCs) co-cultivadas com os axônios alinhados são monitorados para a mielinização. Ao incorporar pré-estiramento induzido anisotropia superfície fomos capazes de aumentar a célula Alinhamento de diferenciação e axônio Alinhamento de crescimento de MSCs e neurônios DRG ^9-10, respectivamente.

Protocolo

Todos os procedimentos para o isolamento das células foram aprovados pelo Comitê Cuidado e Uso Institucional Animal da Universidade Estadual de Michigan.

1. Preparação de pré-esticado superfície anisotrópica

1. Misturar a 10: solução de base e um agente de cura e verter a mistura em um prato de cultura de tecidos (12 cm de diâmetro). Use 4,900 mg de base e 490 mg de agente de cura para a mistura total de reticulação.
2. Manter a mistura de gel sob vácuo durante 20 min para remover as bolhas de ar.
3. Coloque a mistura de gel no forno de cura durante a noite a 60 ° C.
4. Após a cura da membrana PDMS, tratar a superfície com plasma de oxigénio utilizando um sistema de limpeza / gravação por plasma durante 3 min a 165 mTorr 65 e fluxo sccm de _O2.
5. Corte um pedaço de membrana rectangular (5 × 3,5 cm) do prato, ao ser consciente de que lado é tratada com oxigênio, verifique se o lado tratado com oxigênio é voltado para cima e fixar em um quadro de alongamento. Coloque o quadro em uma alongamento fase e esticar uniformemente girando o botão na fase até atingir 10% de alongamento (ou algum outro extensível pré-determinado, o alongamento pode ser lida directamente a partir da fase de alongamento), em relação ao maior eixo ^9. Corrigir o estiramento, apertando os parafusos da moldura.
6. Retire a armação do palco. Certifique-se de superfície da membrana é seca e livre de poeira, em seguida, coloque uma câmara de silicone para a membrana permitindo que o lado adesivo da câmara para prender firmemente à membrana.
   Nota: A câmara de silicone fornece um poço para reter o meio de células na membrana de PDMS. O design do dispositivo é mostrado na Figura 1.
7. Esterilizar a superfície com UV durante 10 min.
8. Adicionar 1 ml de poli-L-lisina (PLL) (0,01% em tampão fosfato salino) para a superfície de PDMS no interior da câmara, dentro de seis horas de tratamento com plasma e incubar durante 2 horas a 37 ° C antes de semear os neurónios DRG. Isto aumenta a fixação das células.

le "> 2. Isolamento de DRG

1. Prepare meio de crescimento padrão para os neurônios do GRD.
2. Antes do isolamento, autoclave o equipamento e os reagentes de isolamento de filtro. Adicionar 5 ml de tampão de isolamento para um poço de uma placa de 6 poços, e colocar a placa em gelo. Preparar 10 ml de meio de dissociação por adição de 1 ml de colagenase A (500 U / ml) a 9 ml de 0,05% de tripsina-EDTA (1 mg / ml), filtra-se as soluções com um filtro de 0,22 um e colocar em gelo.
3. Use dez a doze 5-7 velhos ratos Sprague-Dawley 'dias para o isolamento. Pulverize os filhotes com 75% isopropanol, e sacrifício por decapitação.
4. Cortar a pele que recobre a medula espinhal da parte de trás e remover qualquer excesso de tecido em torno da coluna. Sob uma lupa cirúrgica com as luzes do ponto cirúrgicos em, fazer a primeira incisão do pescoço e, em seguida, um corte ao longo da coluna em ambos os lados com uma tesoura. Retire a coluna vertebral do corpo dos filhotes e remover os músculos em excesso. Em seguida, use uma tesoura para cortar ao longo da long eixo da coluna vertebral e utilizar uma pinça para abrir completamente a coluna vertebral e extrair o cord.Remove a ponta de uma pipeta para criar uma abertura maior para a transferência de DRG com tampão de isolamento para um tubo estéril de 15 ml.
5. Usando um belo par de pinças, retire o gânglio do bolso óssea e recolher cerca de 10-16 DRG de ambos os lados. Aparar as raizes nervosas e transferir os gânglios para o tampão de isolamento arrefecido em gelo.
6. Remover a ponta de uma pipeta para criar uma abertura maior para a transferência de DRG com tampão de isolamento para um tubo estéril de 15 ml. Após a dissociação química, centrifugar a 900 xg em gânglios e 4 ° C durante 5 min.
7. Deixe os tecidos assentar no fundo do tubo suavemente e remover o tampão de isolamento na parte superior e adicionar 10 ml de meio de dissociação para dentro do tubo.
8. Incubar os tecidos dissecados no meio de dissociação, em um banho de água a 37 ° C durante 1 h enquanto se agita o tubo a cada 5-10 min.
9. Depois dea dissociação química, centrifugar a 900 xg em gânglios e 4 ° C durante 5 min.
10. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 10 ml de meio de crescimento standard e vortex.
11. Centrifugar as células dissociadas como indicado na secção 2.9, mais uma vez.
12. Remover o sobrenadante, re-suspender o sedimento em 12 ml de meio de crescimento standard e vortex.

3. Cultura do DRG na superfície pré-esticado

1. Antes de semear as células, as soluções remover PLL a partir da câmara e lavar a superfície de PDMS com água estéril e seca ao ar.
2. Depois de re-suspender as células, deixar que o conjunto de suspensão de 1 - 2 minutos para permitir que os detritos assentem no fundo do tubo. Adicionar 1,5 ml de suspensão de células em cada câmara de estiramento e incubar a 37 ° C em 5% de CO _2.
3. Para eliminar as células gliais, com 1 dia in vitro (DIV), adicionar 10 ul (ou 15 ul) de uma mistura de 2-fluoro-desoxi uridina e uridina (FDU-L) da solutiem (Ver Tabela de Materiais) para cada poço. Após 7 h, substituir este meio com meio de crescimento fresco padrão e colocar o dispositivo de cultura pré-esticado numa incubadora a 37 ° C com 5% de CO _2.
4. Durante o período de cultura de células (2 - 3 semanas), alterar o suporte de dois em dois dias, substituindo metade do meio gasto com meio fresco. Nota: Após cultura nas superfícies estiradas e não estiradas de 2 semanas, SCs purificados são adicionados à câmara e cultivadas durante mais uma semana (fase 4.7).

4. Co-cultura de células de Schwann (SCS) com DRG neurônios na superfície pré-esticado

1. Isolar SCs como descrito por grupo previamente ¹⁵ do Dr. Campana.
   1. Resumidamente, isolar o SCs de um filhote de cachorro 1 dia de idade. Coletar e dissociar o nervo ciático tanto química (tripsina-EDTA e colagenase A) e mecanicamente (18 gauge agulha / seringa de 10 ml) ^15.
   2. Semear as células dissociadas em poli-D-lisina (PDL) coATED balão T25 e a cultura a 37 ° C em 5% de CO _2. No dia 5, purificar as células através de selecção de anticorpos utilizando anti-thy 1,1 de anticorpo e complemento de coelho e subcultura das células purificadas a passagem 2 - 4. média Utilização de cultura contendo de Dulbecco Modified Eagle Médium (DMEM), soro bovino fetal a 10% (FBS) , 1% de penicilina / estreptomicina (pen / Strep), 21 ug / ml de pituitária de bovino Extracto (BPE), e 4 | iM Forskolin.
2. Remover o meio de cultura a partir do SC, e adicionam-se 5 ml de 0,05% de tripsina-EDTA para o balão. Incubar as células a 37 ° C em _CO2 5% durante 2-3 min.
3. Verificar as células ao microscópio óptico usando uma objectiva de 10X para ver se eles levantam a partir do frasco, em seguida, adicionam-se 5 ml de meio de cultura e misturar com as células do frasco.
4. Adicionar a suspensão de células para um tubo de centrífuga de 15 ml e centrifugar a 200 xg e 20 ° C durante 5 min.
5. Remover o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 7 ml med crescimento DRG padrãoI a.
6. Tomar 10 ul de suspensão de células para um tubo de microcentrífuga de 0,5 mL, misturar com 10 uL de azul de tripano, e depois contar o número de células utilizando um hemocitómetro sob microscopia óptica utilizando uma objectiva de 10X. Dilui-se a suspensão de células a 5000 células por ml pela adição de meio de crescimento DRG.
7. Retirar 0,5 mL de meio de cultura a partir do DRG na câmara esticada e adicionar 0,5 ml de suspensão de SC para a cultura de DRG.
8. Cultura as células durante 1 semana a 37 ° C e 5% de CO _2. Alterar os meios de comunicação a cada dois dias, substituindo metade do meio gasto com meio de crescimento padrão fresco para DRG. Após co-cultura uma semana, o processo as células por imuno-histoquímica ^10.

Resultados

O sistema de cultura de células pré-esticado promovido DRG alinhamento ¹⁰ axónio. neurónios DRG foram cultivadas em superfícies pré-esticado e não estiradas durante 12 dias. Os axónios foram corados para β-III-tubulina para demonstrar o seu alinhamento. A Figura 2 compara a orientação axonal nas PDMS pré-esticado e não estiradas substratos após 12 dias de cultura. Os axónios DRG alinhados paralelamente à direcção esticada, enquanto que eles mostraram alinhamen...

Discussão

Para induzir o alinhamento axónio na superfície pré-esticado, existem dois passos essenciais: 1) a membrana PDMS tem de ser plana e de espessura homogénea; e 2) células gliais deve ser removido a partir do DRG. Depois de misturar os PDMS e agente de reticulação e cura em um forno, o gel PDMS reticulado deve ser mantido no topo de uma bancada plana e manuseadas com cuidado para evitar qualquer inclinação. O tratamento com plasma de oxigénio da membrana PDMS deve ser seguido dentro de 6 horas por revestimento de PLL, uma ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Meio Neurobasal 1x	GibcoBRL	21103-049
B27 Suplemento 50x	GibcoBRL	17504-044
Glutamax-I 100x	GibcoBRL	35050-061
Albumax-I	GibcoBRL	11020-021
Fator de Crescimento Nervoso-7S	Invitrogen	13290-010
Penicilina-estreptomicina	GibcoBRL	15140-122
0,05% Tripsina-EDTA/1 mM EDTA	GibcoBRL	25300-054
Poli-L-Lisina	Trevigen	3438-100-01
Poli-D-Lisina	Sigma	p-6407
Fluoro-2 desoxi-uridina	Sigma	F0503
Uridine	Sigma	U3003
Hank' s Solução salina balanceada (HBSS)	Invitrogen	14170-112	Tampão de isolamento
tipo I colagenase	Worthington	LS004196
DMEM	Gibco	11885
Hyclone	de soro bovino fetal inativado por calor	SH30080.03
	BPE Clonetics	CC-4009
Forskolin	Calbiochem	344270
Câmara de silicone	Greiner bio-one	FlexiPERM
Sistema de limpeza/gravação de plasma	March Instruments	PX-250
Anticorpo Anti-Thy 1.1	Sigma- Aldrich	M7898
Complemento de Coelho	Sigma- Aldrich	S-7764
Meio			de crescimento padrãoPara 500 ml de meio neurobasal 1x, adicione 10 ml de B-27 50x, 5 ml de Glutamax-I 100x, 2,5 ml de penicilina / estreptomicina (Penn / Strep), 1 ml de Albumax-I e 1 μ l de NGF-- 7S (50 μ g/ml).
FDU Solução-mãe			FDU 100 mg em 10 ml de ddH2O (10 mg/ml), filtrar no exaustor e dividido em 500 μ l alíquotas e conservar a -20 &C. Uridina 5 g em 166,7 ml de ddH2O (33 mg/ml), filtrar no capô, dividir em 200 μ l alíquotas e armazenar a -20 ºC. Pegue 61,5 μ l de FDU (10 mg/ml) e 20,5 μ l de uridina(33 mg/ml) e adicionar 4.918 μ l de ddH2O até uma concentração final de matéria-prima, dividir em alíquotas de 1 ml e conservar a -20 °C.

de uridina