Descrevemos um método baseado em sequenciamento de RNA direcionado que inclui a preparação de bibliotecas de cDNA indexadas, hibridização e captura com sondas personalizadas e análise de dados para interrogar transcritos selecionados quanto à expressão gênica, mutações e fusões gênicas. O RNAseq direcionado permite uma avaliação rápida e econômica de transcritos selecionados em um sequenciador de desktop.
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Artigo de método
Targeted RNA Sequenciação Ensaio para Caracterizar expressão gênica e genômica Alterações
Neste artigo
Resumo
Resumo
sequenciação de ARN (RNA-Seq) é um método versátil que pode ser utilizado para detectar e caracterizar a expressão do gene, mutações, fusões de genes, e RNAs não codificantes. Padrão RNA-Seq requer 30-100.000.000 sequenciamento lê e pode incluir vários produtos de RNA, tais como mRNA e RNAs não codificantes. Demonstramos como alvejado RNA-Seq (captura) permite um estudo focado em produtos de RNA selecionados usando um sequenciador de desktop. captura de RNA-Seq pode caracterizar transcrições não anotadas, baixa ou transitoriamente expressas que podem de outra forma ser atendidas através de métodos RNA-Seq tradicionais. Aqui nós descrevemos a extração de RNA a partir de linhas celulares, depleção de RNA ribossomal, síntese de cDNA, a preparação de bibliotecas de código de barras, hibridação e captura de transcritos alvo e sequenciamento multiplex num sequenciador desktop. Nós também destacar o pipeline de análise computacional, que inclui a avaliação de controle de qualidade, o alinhamento, a detecção de fusão, a quantificação expressão genética e identificação de único nucvariantes leotide. Este ensaio permite a sequenciação transcrição direccionada para caracterizar a expressão do gene, fusões de genes e mutações.
Introdução
O transcriptoma completo ou sequenciamento de RNA (RNAseq) é um método de sequenciamento imparcial para avaliar todos os produtos de RNA. O objetivo do RNAseq direcionado (captura) é uma avaliação focada de transcritos selecionados com maior sensibilidade, faixa dinâmica, custo ou escala reduzida e maior rendimento em comparação com o RNAseq padrão. Semelhante ao RNAseq padrão, abordagens de enriquecimento direcionadas podem ser usadas para avaliar a expressão gênica, várias espécies de RNA, como mRNA, microRNA (miRNA), lncRNA1, outros RNAs não codificantes2, fusões gênicas3 e mutações4-6.
A captu....
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Protocolo
Nota: Este protocolo descreve o processamento ea análise de quatro amostras em simultâneo. Este método é compatível com ARN isolado a partir de células, tecidos congelados frescos e tecido embebido em parafina e fixado em formalina (FFPE). Esse protocolo começa com 50 - 1000 ng (250 ng recomendado) a partir da entrada de ARN para cada amostra.
1. rRNA Exaustão e fragmentação de RNA Procedimento
- rRNA Esgotamento
- Remover eluto, prima, mistura fragmento, mix de remoção de rRNA, tampão de ligação rRNA e tampão de ressuspensão de -20 ° C e descongelar à temperatura ambiente. Remover o tampão de eluição, grâ....
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Resultados
A destacando esquemática passos chave na captura de RNA-Seq é mostrado na Figura 1. Quatro linhas celulares de cancro com mutações conhecidas foram usadas para demonstrar a eficácia da técnica de captura de RNA-Seq (K562 com ABL1 fusão, LC2 com fusão Ret, EOL1 com PDGFRalpha fusão e RT- 4 com a fusão FGFR3). As quatro amostras foram reunidas e sequenciados com 2x 100 pb lê num sequenciador de desktop, que gera arquivos FASTQ. arquivos .......
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Discussão
RNA-Seq Capture é uma estratégia intermediária entre RNA-Seq e microarray abordagens para avaliar uma parte selecionada do transcriptoma. As vantagens de captura incluem o custo, tempo de resposta rápido reduzida num sequenciador de mesa, de alto rendimento, e a detecção de alterações genómicas. O método pode ser adaptado para caracterizar ARN não codificadoras 23, um único nucleótido detectar variantes 4-6, examinar o RNA splicing, e para identificar fusões de genes ou de rearranjos estruturais
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Divulgações
S.R. recebe financiamento da Novartis e da Ariad Pharmaceuticals para a realização de ensaios clínicos. Os membros da família imediata de SR possuem ações da Johnson and Johnson.
Agradecimentos
Agradecemos especialmente a Ezra Lyon, Eliot Zhu, Michele Wing, Esko Kautto e Eric Samorodnitsky pelo suporte técnico. Também gostaríamos de agradecer a Jenny Badillo por seu apoio administrativo à nossa equipe. Agradecemos ao Ohio Supercomputer Center (OSC) por fornecer espaço em disco, capacidade de processamento e suporte para executar nossas análises. Agradecemos ao Comprehensive Cancer Center (CCC) do Wexner Medical Center da Ohio State University por seu apoio administrativo a este trabalho. SR e equipe são apoiados pela American Cancer Society (MRSG-12-194-01-TBG), um Prêmio Jovem Investigador da Prostate Cancer Foundation, NHGRI (UM1HG006508-01A1), Fore Cance....
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Thermomixer R | Eppendorf | 21516-166 | |
| Centrífuga 5417R | Eppendorf | 5417R | |
| miRNeasy Mini Kit | Qiagen | 217004 | |
| Etanol de Grau de Biologia Molecular | Sigma Aldrich | E7023-6X500ML | |
| Thermoblock 24 x 1.5 ml | Eppendorf | 21516-166 | |
| Kit de Reagentes MiSeq v2 (300- ciclos) | Sequenciador | Illumina MS-102-2002 | |
| Controle Illumina | |||
| PhiX v3 | Illumina | FC-110-3001 | |
| TruSeq com Conjunto de Ouro RiboZero Illumina | RS-122-2301 | ||
| 25 rxn xGen® Bloqueio Universal Oligo - TS-p5 | IDT | 127040822 | |
| 25 rxn xGen® Bloqueio Universal Oligo - TS-p7(6nt) | IDT | 127040823 | |
| 25 rxn xGen® Bloqueio Universal Oligo - TS-p7(8nt) | IDT | 127040824 | |
| Agencourt® AMPure® XP - Esferas de purificação PCR | Beckman-Coulter | A63880 | |
| Dynabeads® M-270 Streptavidin | Life Technologies | 65305 | |
| COT DNA Humano, Grau Fluorométrico, 1 mg | Roche Applied Science | 05480647001 | |
| Qubit® Tubos de Ensaio | Life Technologies | Q32856 | |
| Qubit® dsDNA HS Kit de Ensaio | Life Technologies | Q32851 | |
| SeqCap® Kits de Hibridização e Lavagem EZ (24 ou 96 reações) | Roche NimbleGen | 05634261001 ou 05634253001 | |
| Fluorômetro Qubit® 2.0 | Life Technologies | Q32866 | |
| 10 x 2 ml IDTE pH 8.0 (1x TE Solution) | IDT | ||
| Tween20 BioXtra | Sigma | P7949-500ML | |
| Água Livre de Nuclease | Life Technologies | AM9937 | |
| C1000 Touch™ Termociclador com 96– Módulo de Reconstrução Rápida | Biorad | 185-1196 | |
| SeqCap EZ Kits de Hibridização e Lavagem | Roche Applied Science | 05634253001 | |
| SuperScript II Transcrição Reversa 200 U/μ l | Life Technologies | 18064-014 | |
| D1000 ScreenTape | Agilent Technol. Inc. | 5067-5582 | |
| Agencourt RNAClean XP - 40 ml | Beckman Coulter Inc | A63987 | |
| Fita de Tela de RNA | Agilent Technol. Inc. | 5067-5576 | |
| Escada de Tela de RNA | Agilent Technol. Inc. | 5067-5578 | |
| Tampão de amostra de fita de tela de RNA | Agilent Technol. Inc. | 5067-5577 | |
| Hidróxido de Sódio | Sigma | 72068-100ML | |
| DynaBeads MyOne Streptavidin T1 | Life Technologies | 65602 | |
| DYNAMAG -96 LADO CADA | Life Technologies | 12331D | |
| Clorofórmio | Sigma | C2432-1L | |
| KAPA HotStart ReadyMix | KAPA Biosystems | KK2602 | |
| Espectrofotômetro NanoDrop 2000 | Thermo Scientific | ||
| My Block Mini Banho Seco | Benchmark | BSH200 | |
| D1000 Reagentes | Agilent Technol. Inc. | 5067- 5583 | |
| Vacufuge Plus | Eppendorf | 022829861 |
Referências
- Wang, Z., Gerstein, M., Snyder, M. RNA-Seq: a revolutionary tool for transcriptomics. Nat Rev Genet. 10, 57-63 (2009).
- Mercer, T. R., et al. Targeted sequencing for gene discovery and quantification using RNA CaptureSeq. Nat Protoc. 9, 989-1009 (2014....
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Reimpressões e permissões
