Engenharia de Tecidos por Intrínseca Vascularização numa In Vivo Câmara Engenharia de Tecidos

Resumo

Esta é uma diretriz para a construção de tecido vascularizado in vivo usando uma alça arteriovenosa microcirúrgica ou uma configuração de pedículo de fluxo dentro de uma câmara de engenharia de tecidos. Os tecidos vascularizados gerados podem ser empregados para regeneração de órgãos e substituição de defeitos teciduais, bem como para testes de drogas e modelagem de doenças.

Resumo

Na cirurgia de reconstrução, há uma necessidade clínica para uma alternativa aos actuais métodos de reconstrução autólogos, que são complexos, dispendiosos e de comércio um defeito para o outro. A engenharia de tecidos mantém a promessa de abordar esta demanda crescente. No entanto, a maioria das estratégias de engenharia de tecidos não conseguem gerar substitutos de tecidos estáveis ​​e funcionais por causa da má vascularização. Este artigo centra-se em um modelo de câmara in vivo engenharia de tecidos da vascularização intrínseca, onde uma artéria e uma veia perfusão ou como um loop arteriovenosa ou uma configuração pedículo flow-through é dirigido dentro de uma câmara oca protegida. Neste sistema baseado na câmara de germinação ocorre a partir angiogénico nos vasos arteriovenosas e este sistema atrai a migração celular endógeno isquémica e inflamatório accionado que preenche o espaço gradualmente câmara com tecido fibro-vascular. células exógena / implantação matriz no momento da construção da câmara aumenta sur celularvência e determina a especificidade dos tecidos de engenharia que se desenvolvem. Os nossos estudos demonstraram que este modelo de câmara pode gerar com êxito diferentes tecidos, tais como gordura, o músculo cardíaco, fígado e outros. No entanto, são necessárias modificações e refinamentos para assegurar a formação de tecido alvo é consistente e reproduzível. Este artigo descreve um protocolo normalizado para a fabricação de dois modelos de câmara engenharia de tecidos vascularizados diferentes in vivo.

Introdução

Fabricação de tecido vascularizado funcional, utilizando uma abordagem de engenharia de tecidos é um paradigma emergente na medicina regenerativa. ^1,2 Muitas abordagens para projetar o tecido novo e saudável para a substituição de tecido lesionado ou órgãos defeituosos têm sido desenvolvidos, ^3-6 experimentalmente em modelos animais pequenos com promissor potencial clínico ^7,8. No entanto, a vascularização continua a ser um dos maiores desafios para a engenharia de tecidos que limitam o seu potencial de crescimento de tecidos tamanho clinicamente relevante. ⁹

As abordagens actuais para vascularizar tecidos seguir qualquer uma via extrínseca, onde novos vasos crescem a partir do leito vascular destinatário e invadir durante todo o tecido implantado constrói ¹⁰ ou uma via de vascularização intrínseca, onde a vasculatura cresce e se expande em uníssono com o tecido acabado de desenvolvimento. ¹¹ A abordagem extrínseca tradicionalmente envolve as células de semeadura em um andaimein vitro e implantando a construção completa para o animal vivo com a expectativa de que os nutrientes, previamente fornecido pelo meio de cultura, será obtida a partir da circulação. ^12,13 O conceito é simplista como ingressos vascular é muito lento e apenas implantes muito finas (< 1-2 mm de espessura) permanecerá viável. Fornecendo nutrientes e oxigênio através de uma vascularização suficiente e rápida é o cerne de todas as tentativas de sucesso para crescer substitutos mais complexos e maiores da engenharia de tecidos, como ossos, músculos, gordura e órgãos sólidos. ^14,15 vascularização Intrinsic oferece o potencial para construções maiores para desenvolver pelo crescimento tecidual progressiva à altura do seu fornecimento de sangue em expansão. Um projeto é a implantação in vivo em uma câmara de um pedículo vascular, com ou sem um andaime semeado celular. ^5,6 Isso abriu o caminho para novos procedimentos para a geração de mais grossos tecidos intrinsecamente vascularizados ^16,17.

Mais recentemente, as estratégias têm sido desenvolvidos para enxertos de tecidos, antes da implantação-vascularizar previamente. Estas redes de vasos sanguíneos incorporados são destinados a unir com os vasos do hospedeiro ao implante permitindo o rápido fornecimento de um suprimento de sangue completo para melhorar a sobrevivência de todas as partes de um enxerto de tecido grosso transplantado ^18.

Nós pioneira um modelo de engenharia de tecidos in vivo vascularizado em pequenos animais que envolve uma câmara fechada semi-rígida implantadas subcutaneamente contendo um pedículo vascular perfundido e biomateriais contendo as células. A câmara cria um ambiente isquémico que estimula a germinação angiogénica dos vasos implantados. ³ O pedículo vascular pode ser um circuito arteriovenoso reconstruída ou uma artéria de fluxo intacto e veia. ^3-6,19 A vasculares couves pediculares um funcionamento e um grande artério rede -capillary-venosa que liga tanto a arteeriole e venosa termina com o pedículo vascular. ^3,20 Além disso, a câmara de suporte oco envolvente protege o tecido em desenvolvimento de potencialmente deformando forças mecânicas e prolonga a unidade isquêmico para melhorar a vascularização. ^3,21,22 Se o pedículo embarcação é simplesmente implantados em tecido normal e não dentro do espaço protegido da câmara, surgimento angiogênico deixa ao longo da mesma linha do tempo como uma ferida normal e nenhum novo tecido irá acumular em torno do pedículo. Os investigadores usaram esta configuração in vivo para produzir tridimensionais construções de tecido vascularizado funcionais com vasculatura de suporte e de tamanho clinicamente relevante. ^4,23 Além disso, as construções de tecido vascularizado artificiais, com a sua pedículo vascular intacta pode ser colhida para transplante subsequente no local da lesão ^24,25. Um cenário mais clinicamente viável seria a criação da câmara no local definitivo para a reconstrução sdominam vários como o da mama. Assim, este novo abordagem de engenharia de tecidos pode ter um potencial clínico para proporcionar uma nova fonte de tecido alvo funcional para cirurgia reconstrutiva. ^26-28

O protocolo que se segue irá fornecer um guia geral para a construção de uma câmara de engenharia de tecidos vascularizados in vivo no rato, que pode ser adaptada em diferentes modelos animais e utilizados para examinar o intrincado processo de angiogénese, a produção da matriz, e a migração e diferenciação celular.

Protocolo

Os protocolos aqui descritos foram aprovados pelo Comitê de Ética Animal de St. Vincent Hospital Melbourne, Austrália, e foram conduzidos em estrita observância às orientações australianos Conselho Nacional de Saúde e Pesquisa Médica.

NOTA: Dois protocolos de câmara são descritos abaixo. Os dois modelos diferentes e os seus modelos específicos de câmara são ilustradas na Figura 1. Câmara (1) é feita de policarbonato (para o modelo de rato câmara anelar arteriovenosa). Ele é cilíndrico com um diâmetro interno de 13 mm e altura de 4 mm. Uma janela em um ponto na parede permite o acesso desimpedido para o pedículo. No segundo modelo (por fluxo através de rato modelo de câmara de pedículo), a câmara é feita de poliacrílico e é rectangular (10 x as dimensões de 8 x 4 ^mm3 internos). Ele tem duas aberturas de 1,5 mm em lados opostos para acomodar a artéria e veia femoral à medida que a câmara de transgredir.

1. Modelo Câmara Rat arteriovenosa Loop (Uma Chamber por animal)

NOTA: Antes de iniciar a cirurgia, certifique-se de todos os instrumentos foram devidamente esterilizados. Da mesma forma, garantir o resto instrumentos em toalhas estéreis e estão a uma distância razoável do campo cirúrgico para evitar a contaminação durante o procedimento.

1. Preparação do animal para a cirurgia
   1. Use ratos pesando pelo menos 250 g por seu grande tamanho dos vasos para a criação da alça arteriovenosa.
   2. Anestesiar os animais com 4% inalação de isoflurano. Corroboram profundidade adequada da anestesia, avaliando a ausência de resposta aos pés-pitada. Após a anestesia, o animal manter adequadamente anestesiados durante todo o procedimento com 2% de isoflurano.
   3. Colocar o animal numa posição supina sobre uma almofada de aquecimento e aplicar lubrificante estéril para os olhos para prevenir a dessecação durante a cirurgia.
   4. Usando um barbeador elétrico, fazer a barba ambos os virilhas e remover o cabelo com um pedaço de gaze úmida.
   5. Preparar os locais cirúrgicos com clorexidinasolução de etanol / 70% e armar o animal com toalhas estéreis. Administrar uma dose única de carprofeno (5 mg / kg, subcutaneamente) como analgésico.
2. Colheita da veia femoral do enxerto
   1. Usando uma lâmina # 15, fazer uma incisão na pele de 4 cm de comprimento na virilha esquerdo paralelo ao ligamento inguinal. Isso expõe a almofada de gordura inguinal.
   2. Cortar a almofada de gordura em circunferência com uma tesoura deixá-lo ligado ao seu pedículo vascular baseado nos vasos epigástricos.
   3. Usando micro tesouras, libertar os filmy aderências do tecido conjuntivo entre a parede abdominal e os vasos femorais subjacentes.
   4. Coloque um afastador na parede abdominal e puxe medial. Isso expõe o ligamento inguinal e de todo o comprimento dos vasos femorais.
   5. Usando micro pinça e tesoura curva dissecar a veia epigástrica e isolá-lo a partir da sua gordura ao redor puxando e corte com cuidado. Esta veia atua como uma corda ao construir o loop.
   6. using micro fórceps e curvas tesoura micro abrir a bainha perivascular contendo os vasos femorais e nervo todo o caminho desde o ligamento inguinal à sua distal bifurcação para o ramo epigástrica.
   7. Usando micro fórceps, pegar a veia femoral pela sua adventícia e gentilmente separá-lo dos tecidos circundantes e acompanhando artéria. Faça isso com micro fórceps e curvas tesoura micro apontou-redondas, puxando o tecido distante e cortando-o.
      NOTA: Não agarrar toda a espessura da parede da veia, pois isso poderia causar trauma para a íntima tornando-se propensos a trombose.
   8. ramos laterais ligar encontrados durante a dissecção com sutura 10/0 nylon ou coagular-los com um coagulador bipolar.
   9. Com a veia femoral completamente livre, ligar sua extremidades proximal e distal com suturas de seda 4/0. Certifique-se de obter um enxerto de veia de comprimento, pelo menos, 10 mm e incluem aproximadamente 0,5 cm de comprimento do ramo epigástrica para ser utilizado como um grupo de ancoragem cara cordapara manter a malha aberta na câmara.
   10. Usando micro fórceps e micro tesoura reta, cortar a adventícia das extremidades do enxerto puxando e corte com cuidado. Isso também pode ser feito mais tarde, antes de anastomoses microcirúrgicas.
   11. Lave o enxerto de veia com solução salina heparinizada (10 U / ml de heparina) e deixe-a descansar na solução. Fechar a ferida usando corrida contínua 4/0 fio de seda e mais dois ou três pontos isolados simples adicionais.
3. Criação de arteriovenosa laço e Implantação de Câmara
   1. Repita os passos 1.2.1 a 1.2.4 no exatamente da mesma maneira no membro contralateral.
   2. Usando micro fórceps, dissecar e isolar tanto a artéria epigástrica e veia formar a almofada de gordura ao redor. Para fazer isso, puxando suavemente o tecido longe dos vasos
   3. Usando micro fórceps, pegar a artéria femoral pela sua adventícia e libertá-la dos tecidos circundantes. Faça isso com micro fórceps e mic pontas round-curvadatesouras ro puxando o tecido distante e cortando-o. Ligadura ou coagular seus ramos laterais.
   4. Ligar a artéria e veia femoral distai para o surgimento dos vasos epigástricas usando sutura de seda 4/0.
   5. Colocar uma única braçadeira proximal em cada uma das artéria e veia femorais. Usando um micro tesoura reta afiada, faça um transversal limpo cortado em cada distal navio para a emergência dos ramos epigástrica. Coloque um fundo de contraste de plástico estéril sob os vasos.
   6. Lave os vasos vigorosamente com generosas quantidades de soro fisiológico heparinizado até que todo o sangue é removido a partir do lúmen.
   7. Trazer o enxerto de veia no campo operatório e remover qualquer adventícia redundante das extremidades dos navios, como por etapa 1.2.10, se necessário.
   8. Realizar as duas anastomoses microcirúrgicas com sutura 10/0 nylon. Anastomose da extremidade proximal do enxerto de veia para a veia femoral e a extremidade distai à artéria femoral. Isto irá permitir que o sangue flua fROM arterial para o lado venoso sem resistência de válvulas no interior do enxerto de veia.
      NOTA: Certifique-se os vasos femorais e o enxerto de veia resto na sua posição natural, sem quaisquer torções.
   9. Verifique se há vazamentos em ambos os locais de anastomose. Resolver pequenos vazamentos, que parecem não pulsátil de sangue que sai do local da anastomose, colocando um pequeno pedaço de gordura na parte superior e que comprime suavemente durante 5-10 min. Maiores vazamentos pulsantes que rapidamente inundar o campo inteiro vai precisar de pontos adicionais.
   10. Verifique desobstrução da alça arteriovenosa. oclusão suave da artéria femural deve torná-lo enquanto o mesmo encolher na veia femural deve absorver lo.
   11. Coloque a base da câmara de engenharia de tecidos sob o loop arteriovenosa com este último na sua posição de repouso natural, sem torções ou torções.
   12. Fixe a base da câmara ao ligamento inguinal e da fáscia muscular subjacente com 6/0 suturas de nylon.
   13. Coloque a tampa sobre obase, de modo que os vasos femorais entrar na câmara através de um entalhe (janela no lado da câmara). Ao fechar a tampa, certifique-se que ele pega os ramos epigástricas, entre a base da câmara e tampa, que agem como amarras para segurar a alça arteriovenosa na posição.
   14. Fechar a ferida usando corrida contínua 4/0 fio de seda e mais dois ou três pontos isolados simples adicionais.
   15. Permitir ao animal recuperar da anestesia em uma almofada de aquecimento.
   16. Não deixe o animal sem supervisão até que tenha recuperado a consciência suficiente para manter decúbito esternal. Da mesma forma, não devolva um animal que foi submetido a uma cirurgia para a companhia de outros animais até que esteja totalmente recuperado. 24 horas mais tarde, administrar outra dose única de carprofeno (5 mg / kg, subcutaneamente) como analgésico.
   17. Tratar a ferida com pomada antibiótica tópica durante 5 dias. Se a ferida é aberta, anestesiar o animal como no passo 1.1.2 1.1.5 através e fechar a ferida como no ponto 1.3.14. Monitorar a saúde de animais diariamente. Eutanásia do animal utilizando uma dose letal de injecção lethabarb intraperitoneal (163 mg / kg, em 0,25 ml de 23 agulha G) se o animal apresentar mais do que um dos sinais moderados inacitivity, falta de apetite, perda de peso e perda de cor.

2. flow-through Pedicle Câmara (duas câmaras por animal)

1. Preparação do animal para a cirurgia
   1. Repita os passos 1.1.1 até 1.1.4. Duas câmaras pode ser implantado em ambas as regiões inguinais de um único rato.
2. Isolamento de vasos femorais e Inserção da Câmara
   1. Repita os passos 1.2.1 através de 1.2.8.
   2. Com ambos artéria e veia completamente livre de tecidos circundantes e seus ramos ligados, traga a câmara para o campo operatório.
   3. Coloque cada um dos vasos femorais intactas na fenda correspondente da base da câmara de certificando-se de que não haja torções ou torções.
   4. Feche a câmara por attaching a tampa à base. Fechar a ferida usando uma corrida contínua 4/0 sutura de seda mais dois ou três pontos separados adicionais simples e permitir que o animal recuperar, como descrito anteriormente.

3. Colheita de Chambers e processamento de tecidos

1. Uma vez que os pontos de tempo do experimento (4-6 semanas pós-implantação) são atingidas, anestesiar o animal como no passo 1.1.2 e repita os passos 1.1.3 através de 1.1.5.
2. Abrir a ferida usando uma lâmina de # 15 e a atravessar os tecidos com tesouras até que a câmara está completamente exposta.
3. Expor os vasos femorais proximais para a construção e teste de permeabilidade vascular: suavemente ocluir o vaso com duas micropinças, em seguida, o leite do sangue numa direcção distal e finalmente soltar a pinça proximal. Se o navio se enche de sangue novo, isto confirma a permeabilidade. Ligadura os vasos femorais proximalmente no caso de o circuito arteriovenoso e proximal e distalmente no caso de the por escoamento de configuração e eliminar as câmaras com o tecido contendo em bloco.
4. No final da experiência, a eutanásia dos animais utilizando uma dose letal de injecção lethobarb intraperitoneal (163 mg / kg em 0,25 ml por 23 L de agulha).
5. Fix tecidos em 4% de paraformaldeído à temperatura ambiente durante 24 h. Divide tecidos em várias secções transversais (1-2 mm de espessura) e incorporar em cera de parafina ou composto óptima temperatura de corte de secções de parafina (5 uM) ou secções congeladas (10 fim), respectivamente. ^{3,4,8,17,22, 24}
6. Realizar a coloração histológica de rotina, tais como hematoxilina e eosina para examinar a morfologia geral de tecidos. Execute coloração imuno-histoquímica com anticorpo específico para identificar o tipo de célula de interesse, ^{3,4,8,17,22,24,29} para a imunocoloração T exemplo troponina em cardiomiócitos.

Resultados

A criação de câmaras microcirúrgico em engenharia de tecido foi realizado como descrito no protocolo acima. Os tecidos geradas dentro das câmaras podem ser examinados histologicamente como descrito no passo 3. protocolo Vários tipos de tecido foram projetados com sucesso utilizando a câmara de vascularizado in vivo (Figura 2). Estas incluem tecido cardíaco com cardiomiócitos neonatais de rato (Figura 2a), o tecido do músculo esquelético de rato ...

Discussão

Engenharia da microcirculação está sendo investigado, essencialmente através de duas abordagens. A primeira envolve o desenvolvimento de uma rede vascular altamente interligada dentro da construção in vitro de modo a que, quando implantados, os capilares do leito vascular hospedeiro ligar com aqueles do transplantado construir através de um processo chamado inosculation, garantindo assim a entrega de nutrientes, não só para a periferia mas também para o núcleo. ^21,32,33 Isto é chamado de pré-vascular...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
1 Bisturi de 15 Lâminas	Braun	BB515
1 Fórceps Adson Dentado	Braun	BD527R
1 Porta-agulha	Braun	BM201R
1 Coagulador Bipolar	Braun	US335
1 Micro Porta-agulhas B-15-8.3	S & T	00763
1 Micro Pinça Dilatadora D-5a.2	S & T	00125
1 Micro Pinça de Joalheiro JF-5	S & T	00108
1 Micro Tesoura - Reta SAS-11	S & T	00098
1 Micro Tesoura - Curvado SDC-11	S & T	00090
2 Grampos Simples B-3	S & T	00400
2 10/0 sutura de nylon	S & T	03199
1 6/0 sutura de nylon	Braun	G2095469
2 4/0 Suturas de seda	Braun	C0760145
Xilocaína 1%	Dealmed	150733	10 mg/ml
Heparina Sódica	Dealmed	272301	5.000 UI/ml
Ringer Lactato	Baxter	JB2323	500 ml
1 engenharia de tecidos em forma de cúpula câmara	feita
1 câmara de fluxo	feito sob medida
Lectina I, Griffonia Simplicifolia	Vector Laboratories	B-1105	1.67 μ g / ml
de anticorpo de troponina T	Abcam	Ab8295	4 μ g/ml
Anticorpo Ku80 específico para humanos	Abcam	Ab80592	0,06 μ g/ml
Desmin anticorpo	Dako	M0760	2.55 μ g/ml
Cell Tracker CM-DiI corante	Thermo Fisher Scientific	C-7000	3 mg/106 células
Lethabarb (pentobarbital sódico)	Virbac Animal Health	LETHA450	325 mg/ml
Almofada térmica flexible	Aquecimento de zona vermelha	RZ/Médio