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Bioengineering

एक में आंतरिक vascularization से ऊतक इंजीनियरिंग Published: May 30, 2016 doi: 10.3791/54099
Automatic Translation
*1, *1, 1,2,3, 1,2,3, 1,2
1O'Brien Institute Department, St Vincent's Institute of Medical Research, 2Department of Surgery, University of Melbourne, 3Faculty of Health Sciences, Australia Catholic University
* These authors contributed equally

Abstract

पुनर्निर्माण सर्जरी में है, जो जटिल, खर्चीला और किसी अन्य के लिए व्यापार एक दोष हैं ऑटोलॉगस पुनर्निर्माण के मौजूदा तरीकों के लिए एक विकल्प के लिए एक नैदानिक ​​जरूरत नहीं है। ऊतक इंजीनियरिंग इस बढ़ती मांग को संबोधित करने के लिए वादा है। हालांकि, ज्यादातर ऊतक इंजीनियरिंग रणनीतियों गरीब vascularization की वजह से स्थिर है और कार्यात्मक ऊतक के विकल्प उत्पन्न करने के लिए असफल। इस पत्र आंतरिक vascularization की एक में विवो ऊतक इंजीनियरिंग चैम्बर मॉडल जहां एक perfused धमनी और एक नस या तो एक धमनी पाश या एक प्रवाह के माध्यम से डंडी विन्यास के रूप में एक संरक्षित खोखले कक्ष के अंदर निर्देश दिया है पर केंद्रित है। इस कक्ष आधारित प्रणाली में एन्जियोजेनिक अंकुरण धमनी वाहिकाओं से होता है और इस प्रणाली के इस्कीमिक और भड़काऊ संचालित अंतर्जात सेल प्रवास जो धीरे-धीरे fibro संवहनी ऊतक के साथ चैम्बर अंतरिक्ष भरता आकर्षित करती है। Exogenous सेल / चैम्बर निर्माण के समय में मैट्रिक्स आरोपण सेल सुर को बढ़ाता हैvival और इंजीनियर के ऊतकों जो विकसित की विशिष्टता को निर्धारित करता है। हमारे अध्ययन से पता चला है कि इस कक्ष मॉडल को सफलतापूर्वक इस तरह के वसा, हृदय की मांसपेशी, जिगर और दूसरों के रूप में विभिन्न ऊतकों उत्पन्न कर सकते हैं। हालांकि, संशोधनों और शोधन के लक्ष्य ऊतक गठन सुसंगत और प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है सुनिश्चित करने के लिए आवश्यक हैं। यह लेख विवो में दो अलग अलग vascularized ऊतक इंजीनियरिंग चैम्बर मॉडल के निर्माण के लिए एक मानकीकृत प्रोटोकॉल का वर्णन है।

Introduction

एक ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण का उपयोग कर कार्यात्मक vascularized ऊतक fabricating पुनर्योजी चिकित्सा के क्षेत्र में एक उभरती हुई प्रतिमान है। 1,2 कई दृष्टिकोण घायल ऊतक या दोषपूर्ण अंगों के प्रतिस्थापन के लिए नए और स्वस्थ ऊतक इंजीनियर करने के लिए विकसित किया गया है, 3-6 प्रयोगात्मक में साथ छोटे पशु मॉडल होनहार नैदानिक ​​संभावित। 7,8 हालांकि, vascularization चिकित्सकीय प्रासंगिक आकार के ऊतकों विकसित करने के लिए अपनी क्षमता को सीमित ऊतक इंजीनियरिंग के लिए बड़ी चुनौतियों में से एक बनी हुई है। 9

वर्तमान दृष्टिकोण ऊतक vascularize करने के लिए या तो एक बाह्य मार्ग का अनुसरण जहां नए जहाजों प्राप्तकर्ता संवहनी बिस्तर से आगे बढ़ने और आक्रमण भर में प्रत्यारोपित ऊतक का निर्माण 10 या एक आंतरिक vascularization मार्ग जहां वाहिका बढ़ता है और नव विकसित ऊतक के साथ एक सुर में फैलता है। 11 बाह्य दृष्टिकोण पारंपरिक रूप से एक पाड़ पर बोने कोशिकाओं शामिलइन विट्रो और उम्मीद है कि पोषक तत्वों, पहले से संस्कृति मीडिया द्वारा आपूर्ति के साथ रहने वाले जानवर में पूरा निर्माण दाखिल में, प्रचलन से sourced किया जाएगा। 12,13 अवधारणा साधारण है के रूप में संवहनी अंतर्वृद्धि भी धीमी है और केवल बहुत पतली प्रत्यारोपण (< 1-2 मिमी मोटी) व्यवहार्य रहेगा। एक पर्याप्त और तेजी से vascularization के माध्यम से पोषक तत्वों और ऑक्सीजन प्रदान करने जैसे हड्डी, मांसपेशियों, वसा और ठोस अंगों के रूप में और अधिक जटिल और बड़े ऊतक इंजीनियर के विकल्प विकसित करने के लिए किसी भी सफल प्रयास के दिल में है। 14,15 आंतरिक vascularization के लिए क्षमता प्रदान करता है बड़े निर्माणों प्रगतिशील ऊतक वृद्धि अपनी विस्तार रक्त की आपूर्ति के अनुरूप द्वारा विकसित करने के लिए। एक डिजाइन 5,6 यह मोटा आंतरिक रूप से vascularized ऊतकों की पीढ़ी के लिए नई प्रक्रिया के लिए मार्ग प्रशस्त किया है के साथ या एक सेल वरीयता प्राप्त पाड़ के बिना एक नाड़ी डंडी के एक कक्ष में इन विवो आरोपण है।। 16,17 </ P>

हाल ही में, रणनीतियों पूर्व vascularize ऊतक ग्राफ्ट, दाखिल करने से पहले करने के लिए विकसित किया गया है। ये शामिल रक्त वाहिका नेटवर्क 18 आरोपण पर मेजबान वाहिकाओं को एक पूर्ण रक्त की आपूर्ति में तेजी से प्रावधान एक प्रतिरोपित मोटी ऊतक भ्रष्टाचार के सभी भागों के अस्तित्व में सुधार करने के लिए अनुमति के साथ जोड़ देना करने के उद्देश्य से कर रहे हैं।

हम छोटे जानवरों में एक विवो vascularized ऊतक इंजीनियरिंग मॉडल है कि एक subcutaneously प्रत्यारोपित अर्द्ध कठोर संलग्न चैम्बर एक perfused संवहनी डंडी और सेल युक्त biomaterials युक्त शामिल बीड़ा उठाया है। चैम्बर एक इस्कीमिक वातावरण है कि प्रत्यारोपित वाहिकाओं से एन्जियोजेनिक अंकुरण को उत्तेजित करता है बनाता है। 3 संवहनी डंडी या तो एक खंगाला धमनी पाश या एक अक्षुण्ण प्रवाह के माध्यम से धमनी और शिरा हो सकता है। 3-6,19 यह नाड़ी डंडी अंकुरित एक कामकाज और व्यापक arterio -capillary-शिरापरक नेटवर्क है कि दोनों कला में लिंकeriole और शिरापरक इसके अलावा संवहनी डंडी के साथ समाप्त होता है। 3,20, आसपास के खोखले समर्थन चैम्बर संभावित यांत्रिक बलों विरूपण से विकासशील ऊतक रक्षा करता है और इस्कीमिक ड्राइव prolongs vascularization बढ़ाने के लिए। 3,21,22 पोत डंडी बस में प्रत्यारोपित किया जाता है तो सामान्य ऊतकों और न चैम्बर के संरक्षित अंतरिक्ष के अंदर, एन्जियोजेनिक अंकुरण के साथ एक सामान्य घाव और कोई नए ऊतक डंडी के आसपास जमा करेंगे के रूप में एक ही समय रहता है। जांचकर्ता इस विवो विन्यास का इस्तेमाल किया है और चिकित्सकीय प्रासंगिक आकार का समर्थन वाहिका के साथ तीन आयामी कार्यात्मक vascularized ऊतक निर्माणों का उत्पादन। 4,23 इसके अलावा, अपने बरकरार संवहनी डंडी के साथ इंजीनियर vascularized ऊतक निर्माणों चोट साइट पर बाद में प्रत्यारोपण के लिए काटा जा सकता है । 24,25 एक और अधिक चिकित्सकीय संभव परिदृश्य पुनर्निर्माण एस के लिए निश्चित स्थल पर चैम्बर का निर्माण किया जाएगास्तन के रूप में uch। इस प्रकार, इस नए सिरे से ऊतक इंजीनियरिंग दृष्टिकोण पुनर्निर्माण सर्जरी के लिए कार्यात्मक लक्ष्य ऊतक का एक नया स्रोत प्रदान करने के लिए नैदानिक ​​संभावित हो सकता था। 26-28

निम्नलिखित प्रोटोकॉल चूहा है, जो विभिन्न पशु मॉडल में रूपांतरित किया जा सकता है और angiogenesis, मैट्रिक्स उत्पादन, और सेलुलर प्रवास और भेदभाव की जटिल प्रक्रियाओं की जांच करने के लिए कार्यरत एक विवो vascularized ऊतक इंजीनियरिंग कक्ष के निर्माण के लिए एक सामान्य मार्गदर्शन प्रदान करेगा।

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Protocol

प्रोटोकॉल यहाँ वर्णित सेंट विन्सेंट अस्पताल मेलबर्न, ऑस्ट्रेलिया के पशु आचार समिति द्वारा अनुमोदित किया गया है, और ऑस्ट्रेलियाई राष्ट्रीय स्वास्थ्य और चिकित्सा अनुसंधान परिषद के दिशा निर्देशों का कड़ाई से पालन के तहत आयोजित की गई।

नोट: दो कक्ष प्रोटोकॉल नीचे वर्णित हैं। दो अलग अलग मॉडल और उनके विशिष्ट कक्ष डिजाइन चित्रा 1 में सचित्र हैं। चैंबर (1) पॉली कार्बोनेट (चूहा धमनी पाश चैम्बर मॉडल के लिए) से बना है। यह एक आंतरिक व्यास 13 मिमी और ऊंचाई 4 मिमी के साथ बेलनाकार है। दीवार में एक बिंदु पर एक खिड़की डंडी के लिए बेरोक पहुँच देता है। दूसरे मॉडल (चूहा प्रवाह के माध्यम से डंडी चैम्बर मॉडल के लिए) में, चैम्बर polyacrylic से बना है और आयताकार (10 x 8 x 4 मिमी 3 आंतरिक आयाम) है। यह और्विक धमनी और शिरा को समायोजित करने के रूप में वे चैम्बर लांघा विपरीत दिशा में दो 1.5 मिमी उद्घाटन के लिए है।

1. चूहा धमनी लूप चैंबर मॉडल (एक चामप्रति पशु संख्या)

नोट: सर्जरी शुरू करने से पहले, सुनिश्चित करें कि सभी उपकरणों को ठीक से निष्फल कर दिया गया है। इसी तरह, बाँझ तौलिए पर उपकरणों बाकी को सुनिश्चित करने और प्रक्रिया के दौरान संक्रमण से बचने के लिए शल्य चिकित्सा क्षेत्र से एक उचित दूरी पर हैं।

  1. सर्जरी के लिए पशु की तैयारी
    1. चूहों का प्रयोग धमनी पाश के निर्माण के लिए जहाजों के अपने बड़े आकार के लिए वजन कम से कम 250 ग्राम।
    2. 4% isoflurane साँस लेना के साथ पशु चतनाशून्य। पैर के अंगूठे चुटकी करने के लिए unresponsiveness का आकलन करने से संज्ञाहरण की पर्याप्त गहराई की पुष्टि। संज्ञाहरण के बाद, पशु पर्याप्त रूप से 2% isoflurane के साथ प्रक्रिया के दौरान anesthetized रखने के लिए।
    3. एक वार्मिंग पैड पर एक लापरवाह स्थिति में पशु रखें और सर्जरी के दौरान सुखाना को रोकने के लिए आंखों को बाँझ स्नेहक लागू होते हैं।
    4. एक बिजली के रेजर का प्रयोग, दोनों groins दाढ़ी और नम धुंध का एक टुकड़ा के साथ बालों को हटा दें।
    5. chlorhexidine के साथ शल्य साइटों तैयारी/ 70% इथेनॉल समाधान और बाँझ तौलिये के साथ पशु कपड़ा। एक भी एनाल्जेसिक के रूप में Carprofen की खुराक (5 मिलीग्राम / किलो, subcutaneously) प्रशासन।
  2. ऊरु नस भ्रष्टाचार के हार्वेस्ट
    1. एक # 15 ब्लेड का प्रयोग, वंक्षण बंधन के लिए छोड़ दिया कमर समानांतर पर एक 4 सेमी लंबा त्वचा चीरा बनाते हैं। इस वंक्षण वसा पैड को उजागर करता है।
    2. कैंची यह अधिजठर वाहिकाओं के आधार पर अपनी नाड़ी डंडी से जुड़ी छोड़ने के साथ circumferentially वसा पैड के माध्यम से कट।
    3. सूक्ष्म कैंची का प्रयोग, पेट की दीवार और अंतर्निहित ऊरु वाहिकाओं के बीच फिल्मी संयोजी ऊतक adhesions मुक्त।
    4. पेट की दीवार पर एक प्रतिकर्षक रखें और मध्यवर्ती खींच। इस वंक्षण बंधन और ऊरु वाहिकाओं की पूरी लंबाई को उजागर करता है।
    5. सूक्ष्म संदंश का प्रयोग और घुमावदार कैंची अधिजठर नस काटना और धीरे से खींच रहा है और काटने से उसके आसपास वसा से अलग। यह नस जब पाश का निर्माण एक तार के रूप में कार्य करता है।
    6. usinजी माइक्रो संदंश और घुमावदार सूक्ष्म कैंची ऊरु वाहिकाओं और तंत्रिका अधिजठर शाखा करने के लिए अपने विभाजन के बाहर करने के लिए वंक्षण बंधन से सभी तरह से युक्त परिवाहकीय म्यान खुला।
    7. सूक्ष्म संदंश का प्रयोग, इसकी adventitia द्वारा ऊरु नस उठा और धीरे आसपास के ऊतकों से अलग और धमनी के साथ। सूक्ष्म संदंश और ऊतक के अलावा खींच रहा है और इसके माध्यम से काटने से घुमावदार राउंड बताया सूक्ष्म कैंची से यह मत करो।
      नोट: कभी नस दीवार की मोटाई पूरे हड़पने के रूप में यह है कि यह थ्रोम्बोसिस होने का खतरा बना intima को आघात का कारण बन सकता है।
    8. Ligate पक्ष शाखाओं 10/0 नायलॉन सीवन के साथ विच्छेदन के दौरान पाया गया या उन्हें एक द्विध्रुवी coagulator साथ जमना।
    9. ऊरु नस पूरी तरह से मुक्त के साथ, 4/0 रेशम टांके के साथ अपने समीपस्थ और बाहर समाप्त होता ligate। कम से कम 10 मिमी लंबाई की एक नस भ्रष्टाचार प्राप्त करने के लिए सुनिश्चित करें और लगभग अधिजठर शाखा के 0.5 सेमी लंबाई पुरुष रस्सी बांधने की रस्सी के रूप में इस्तेमाल किया जा करने के लिए शामिलपाश कक्ष में खुला रखने के लिए।
    10. सूक्ष्म संदंश और सीधे सूक्ष्म कैंची का प्रयोग, धीरे खींच रहा है और काटने से भ्रष्टाचार के छोर से adventitia ट्रिम। यह भी बाद में किया जा सकता है, microsurgical anastomoses से पहले।
    11. heparinized खारा समाधान (10 यू / हेपरिन के एमएल) के साथ नस भ्रष्टाचार फ्लश और समाधान में आराम करने के लिए छोड़ दें। निरंतर चल रहा है 4/0 रेशम सीवन के साथ साथ दो या तीन अतिरिक्त साधारण बाधित टांके का उपयोग कर घाव को बंद करें।
  3. धमनी लूप और चैंबर के आरोपण का निर्माण
    1. दोहराएँ कदम 1.2.1 contralateral अंग पर ठीक उसी तरह से 1.2.4 के लिए।
    2. सूक्ष्म संदंश का प्रयोग, काटना और दोनों अधिजठर धमनी अलग और नस आसपास वसा पैड के रूप में। धीरे वाहिकाओं से दूर ऊतक खींच कर यह मत करो
    3. सूक्ष्म संदंश का प्रयोग, आसपास के ऊतकों से अपने adventitia द्वारा और्विक धमनी और यह मुफ़्त उठाओ। सूक्ष्म संदंश और घुमावदार दौर उठाई mic के साथ यह मत करोऊतक के अलावा खींच रहा है और इसके माध्यम से काटने से ro कैंची। Ligate या उसके पक्ष शाखाओं जमना।
    4. और्विक धमनी ligate और 4/0 रेशम सीवन का उपयोग अधिजठर वाहिकाओं के उद्भव के लिए बाहर का नस।
    5. और्विक धमनी और शिरा में से प्रत्येक पर proximally एक भी दबाना रखें। एक तेज सीधे सूक्ष्म कैंची का उपयोग करना, एक साफ अनुप्रस्थ अधिजठर शाखाओं के उद्भव के लिए प्रत्येक पोत बाहर में कटौती करें। जहाजों के तहत एक बाँझ प्लास्टिक विपरीत पृष्ठभूमि रखें।
    6. heparinized खारा के उदार मात्रा के साथ सख्ती वाहिकाओं फ्लश जब तक सभी रक्त लुमेन से निकाल दिया जाता है।
    7. सहकारी क्षेत्र में नस भ्रष्टाचार लाने के लिए और कदम 1.2.10 के अनुसार 'जहाजों छोर से किसी भी बेमानी adventitia हटाने अगर जरूरत है।
    8. 10/0 नायलॉन सीवन के साथ दोनों microsurgical anastomoses प्रदर्शन करना। ऊरु नस और और्विक धमनी के लिए बाहर का अंत करने के लिए नस भ्रष्टाचार के समीपस्थ अंत Anastomose। यह रक्त के प्रवाह के लिए अनुमति देगा चनस भ्रष्टाचार के अंदर वाल्व से प्रतिरोध के बिना शिरापरक तरफ करने के लिए धमनी ROM।
      नोट: किसी भी लपेटने के बिना ऊरु वाहिकाओं और उनके प्राकृतिक स्थिति में नस भ्रष्टाचार बाकी सुनिश्चित करें।
    9. दोनों anastomotic साइटों पर लीक के लिए जाँच करें। छोटे लीक, जो गैर pulsating रक्त anastomotic साइट से बाहर आने की तरह लग संकल्प, शीर्ष पर वसा का एक छोटा सा टुकड़ा रखने और धीरे से 5-10 मिनट के लिए compressing द्वारा। बड़ी धमाकेदार लीक है कि तेजी से पूरे क्षेत्र में बाढ़ अतिरिक्त टांके की आवश्यकता होगी।
    10. धमनी पाश की प्रत्यक्षता की जाँच करें। और्विक धमनी की कोमल रोड़ा यह हटना जबकि ऊरु नस में ही यह लालच से खाना चाहिए बनाना चाहिए।
    11. ऊतक इंजीनियरिंग चैम्बर के आधार लपेटने या सनक के बिना अपनी प्राकृतिक स्थिति में बाद के आराम के साथ धमनी पाश के नीचे रखें।
    12. वंक्षण बंधन और 6/0 नायलॉन टांके के साथ अंतर्निहित मांसपेशियों प्रावरणी को चैम्बर के आधार सुरक्षित।
    13. पर ढक्कन की जगहआधार इतना है कि ऊरु वाहिकाओं (चैम्बर के पक्ष में विंडो) एक पायदान के माध्यम से कक्ष में प्रवेश। जब ढक्कन बंद, यकीन है कि यह अधिजठर शाखाओं पकड़ता है, चैम्बर आधार और ढक्कन, जो कार्य के रूप में tethers स्थिति में धमनी पाश धारण करने के लिए बीच में हैं।
    14. निरंतर चल रहा है 4/0 रेशम सीवन के साथ साथ दो या तीन अतिरिक्त साधारण बाधित टांके का उपयोग कर घाव को बंद करें।
    15. जानवर एक वार्मिंग पैड पर संज्ञाहरण से उबरने के लिए अनुमति दें।
    16. पशु छोड़ पहुंच से बाहर है जब तक यह पर्याप्त होश आ गया है स्टर्नल लेटना बनाए रखने के लिए नहीं है। इसी तरह, एक जानवर जब तक पूरी तरह से ठीक है कि अन्य जानवरों की कंपनी के लिए सर्जरी आया है वापस नहीं है। 24 घंटा बाद, एक और एक एनाल्जेसिक के रूप में Carprofen की खुराक (5 मिलीग्राम / किलो, subcutaneously) प्रशासन।
    17. 5 दिनों के लिए सामयिक एंटीबायोटिक मलहम साथ घाव का इलाज। घाव को खोला जाता है, तो 1.1.5 के माध्यम से कदम 1.1.2 में के रूप में पशु anesthetize और 1.3 के रूप में घाव बंद.14। दैनिक जानवर के स्वास्थ्य की निगरानी। (23 जी सुई से 0.25 मिलीलीटर में 163 मिलीग्राम / किग्रा) intraperitoneal lethabarb इंजेक्शन की एक घातक खुराक का उपयोग कर यदि पशु inacitivity, गरीब भूख, वजन घटाने और रंग के नुकसान के एक से अधिक मध्यम लक्षण दिखाता पशु euthanize।

2. प्रवाह के माध्यम से डंडी चैंबर (दो पशु प्रति मंडलों)

  1. सर्जरी के लिए पशु की तैयारी
    1. दोहराएँ 1.1.4 के माध्यम से 1.1.1 कदम। दो कक्षों एक भी चूहा के दोनों कमर क्षेत्रों में प्रत्यारोपित किया जा सकता है।
  2. ऊरु वेसल्स के अलगाव और चैंबर के निवेशन
    1. दोहराएँ 1.2.8 के माध्यम से 1.2.1 कदम।
    2. दोनों धमनी और पूरी तरह से आसपास के ऊतकों और अपनी शाखाओं ligated से मुक्त नस के साथ, सहकारी क्षेत्र में चैम्बर लाने के लिए।
    3. बरकरार ऊरु वाहिकाओं के प्रत्येक कक्ष आधार यकीन है कि कोई लपेटने या सनक देखते हैं बनाने के लिए इसी भट्ठा पर रखें।
    4. attachi द्वारा चैम्बर बंदआधार के लिए ढक्कन एनजी। निरंतर चल रहा है 4/0 रेशम सीवन के साथ साथ दो या तीन अतिरिक्त साधारण बाधित टांके का उपयोग कर घाव को बंद और पशु के रूप में पहले से वर्णित ठीक करने के लिए अनुमति देते हैं।

3. मंडलों और ऊतक प्रसंस्करण की फसल

  1. एक बार प्रयोग के समय अंक (4-6 सप्ताह के बाद आरोपण) पर पहुंच रहे हैं, कदम 1.1.2 में के रूप में पशु anesthetize और 1.1.5 के माध्यम से कदम 1.1.3 दोहराएँ।
  2. एक # 15 ब्लेड का उपयोग घाव खोलें और कैंची से ऊतकों के माध्यम से कटौती जब तक चैम्बर पूरी तरह से अवगत कराया है।
  3. निर्माण और नाड़ी प्रत्यक्षता के लिए परीक्षण करने के लिए समीपस्थ ऊरु वाहिकाओं का पर्दाफाश: धीरे दो microforceps के साथ पोत रोक देना है, तो एक बाहर का दिशा में रक्त दूध और अंत में समीपस्थ संदंश जारी। पोत फिर खून से भर जाता है, तो इस प्रत्यक्षता पुष्टि करता है। ऊरु वाहिकाओं proximally धमनी लूप के मामले में और दोनों proximally और distally वीं के मामले में ligateई प्रवाह के माध्यम से विन्यास, और युक्त ऊतक गुट एन के साथ कक्षों को हटा दें।
  4. प्रयोग के अंत में, (23 जी सुई से 0.25 मिलीलीटर में 163 मिलीग्राम / किग्रा) जानवर intraperitoneal lethobarb इंजेक्शन की एक घातक खुराक का उपयोग कर euthanize।
  5. 24 घंटे के लिए कमरे के तापमान पर 4% paraformaldehyde में ऊतकों को ठीक करें। कई अनुप्रस्थ वर्गों में विभाजित ऊतकों (1-2 मिमी मोटी) और क्रमश: पैराफिन मोम या इष्टतम काटने तापमान यौगिक आयल वर्गों के लिए (5 माइक्रोन) या फ्रोजन वर्गों (10 माइक्रोन) में एम्बेड। 3,4,8,17,22, 24
  6. ऊतकों के सामान्य आकृति विज्ञान की जांच करने के लिए इस तरह के hematoxylin और eosin के रूप में नियमित ऊतकीय धुंधला प्रदर्शन करना। Cardiomyocytes के लिए उदाहरण के हृदय ट्रोपोनिन टी immunostaining के लिए ब्याज की सेल प्रकार, 3,4,8,17,22,24,29 की पहचान के लिए विशिष्ट एंटीबॉडी के साथ immunohistochemical धुंधला प्रदर्शन करना।

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Representative Results

ऊतक इंजीनियरिंग कक्षों के निर्माण के microsurgical ऊपर प्रोटोकॉल के रूप में वर्णित किया गया था। कक्षों के अंदर उत्पन्न ऊतकों प्रोटोकॉल कदम में वर्णन के रूप में 3. विभिन्न प्रकार के ऊतकों को सफलतापूर्वक इन विवो vascularized कक्ष (चित्रा 2) का उपयोग कर इंजीनियर किया गया है histologically की जांच की जा सकती है। ये नवजात चूहे cardiomyocytes (2A चित्रा), चूहे कंकाल myoblasts (चित्रा 2 बी), और वसा ऊतकों एक हाइड्रोजेल वसा ऊतकों बाह्य मैट्रिक्स (चित्रा -2) से व्युत्पन्न के साथ साथ मांसपेशियों के ऊतकों के साथ हृदय के ऊतकों में शामिल हैं।

ऊतकों के morphometric मूल्यांकन या तो एक स्टीरियो अन्वेषक प्रणाली या ImageJ सॉफ्टवेयर के साथ किया जा सकता है। 3,4,8,17,22,29 विभिन्न ऊतक घटकों के गुणात्मक मूल्यांकन के अलावा, Stereology प्रणाली को भी निष्पक्ष quanti के लिए अनुमति देता हैविशिष्ट ऊतक मात्रा की दिखाएं। उदाहरण के लिए, लेक्टिन (कृंतक endothelial कोशिकाओं के लिए एक मार्कर) अनुप्रस्थ वर्गों (चित्रा 3) Stereology प्रणाली के साथ वीडियो माइक्रोस्कोपी का उपयोग काटा ऊतक निर्माणों की नाड़ी की मात्रा का अनुमान किया जा सकता है दाग। इसी मात्रा का ठहराव तरीकों अन्य प्रकार के ऊतकों की मात्रा का आकलन करने के लिए लागू किया जा सकता है।

ऊतक इंजीनियरिंग कक्षों भी विवो आरोपण में निम्नलिखित सेल भाग्य ट्रैक करने के लिए नियोजित किया जा सकता है। कोशिकाओं DiI, PKH26 या क्वांटम डॉट्स आरोपण से पहले के रूप में फ्लोरोसेंट रंगों के साथ पूर्व में चिह्नित किया जा सकता है। उदाहरण के लिए, नवजात चूहे cardiomyocytes DiI साथ पूर्व लेबल 3 दिन बाद आरोपण (चित्रा 4 ए) में काटा ऊतक निर्माणों में पता लगाया जा सकता है। हम भी सफलतापूर्वक प्रत्यारोपित कोशिकाओं है कि किया गया है DiI के साथ 4 सप्ताह के बाद आरोपण के लिए पूर्व लेबल पर नज़र रखी है। वैकल्पिक रूप से, प्रजातियों विशिष्ट एंटीबॉडी मैं करने के लिए इस्तेमाल किया जा सकताxenotransplantation अध्ययन में प्रत्यारोपित कोशिकाओं dentify। उदाहरण के लिए, मानव प्रेरित pluripotent स्टेम immunocompromized चूहों में ऊतक इंजीनियरिंग कक्षों के अंदर प्रत्यारोपित कोशिकाओं मानव विशिष्ट Ku80 एंटीबॉडी (चित्रा 4 बी) के साथ immunostaining द्वारा काटा ऊतक निर्माणों में पहचाना जा सकता है।

आकृति 1
चित्रा 1: इन विवो vascularized चैम्बर के साथ हृदय ऊतक इंजीनियरिंग धमनी पाश चैम्बर मॉडल और प्रवाह के माध्यम से डंडी चैम्बर मॉडल के साथ आंतरिक vascularization दृष्टिकोण।। कक्षों या तो पॉली कार्बोनेट या polyacrylic से किए गए थे, इन सामग्रियों गैर भड़काऊ और vivo में गैर विषैले होने के लिए परीक्षण किया गया। स्केल बार = 5 मिमी। पुन: मुद्रित 30 से अनुमति के साथ। प्ली एसई यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्र 2
चित्रा 2:। विवो vascularized कक्षों से इंजीनियर ऊतकों (ए) नवजात चूहे cardiomyocytes साथ हृदय के ऊतकों। Cardiomyocytes हृदय ट्रोपोनिन टी एंटीबॉडी (ब्राउन) के साथ immunostained गया। (बी) के चूहे कंकाल myoblasts के साथ मांसपेशियों के ऊतकों। स्नायु कोशिकाओं desmin एंटीबॉडी (ब्राउन) के साथ immunostained गया। एक हाइड्रोजेल वसा ऊतकों बाह्य मैट्रिक्स से व्युत्पन्न के साथ (सी) वसा ऊतकों। 31 Haematoxylin और eosin धुंधला हो जाना। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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चित्रा 3: 4 हफ्तों के बाद आरोपण में काटा एक ऊतक निर्माणों की वैस्कुलैरिटी लेक्टिन से सना हुआ वर्गों के प्रतिनिधि छवियाँ।। और्विक धमनी (*) से अंकुरण रक्त वाहिकाओं लेक्टिन (ब्राउन) के साथ लेबल रहे थे। स्केल बार = 200 माइक्रोन (बाएं) और 100 माइक्रोन (दाएं)। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

चित्रा 4
चित्रा 4:। ऊतक निर्माणों में प्रतिरोपित कोशिकाओं की पहचान (ए) DiI लेबल नवजात चूहे cardiomyocytes (लाल और सफेद तीर) एक चूहे ऊतक 3 दिन बाद आरोपण पर काटा निर्माण में। (बी) के एक ऊतक का निर्माण का एक प्रतिनिधि मानव विशिष्ट Ku80 दाग ऊतक विज्ञान छवि एक चूहे Tissu से काटाई इंजीनियरिंग चैम्बर 28 दिनों के बाद आरोपण में मानव प्रेरित pluripotent स्टेम कोशिकाओं के साथ प्रत्यारोपित किया। मानव नाभिक थे इम्युनो लेबल भूरा और immunocompromized चूहे मानव कोशिकाओं की अस्वीकृति को रोकने के लिए इस्तेमाल किया गया था। स्केल बार = 50 माइक्रोन। यह आंकड़ा का एक बड़ा संस्करण देखने के लिए यहां क्लिक करें।

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Discussion

microcirculation के इंजीनियरिंग वर्तमान में दो दृष्टिकोण के माध्यम से अनिवार्य रूप से जांच की जा रही है। ताकि जब प्रत्यारोपित पहले इन विट्रो में निर्माण के भीतर एक अत्यधिक परस्पर संवहनी नेटवर्क विकसित करना शामिल है, मेजबान संवहनी बिस्तर से केशिकाओं के उन लोगों के साथ कनेक्ट एक प्रक्रिया बुलाया inosculation के माध्यम से निर्माण, इस प्रकार के पोषक तत्वों का वितरण सुनिश्चित करने प्रत्यारोपित न केवल परिधि के लिए, लेकिन यह भी कोर। 21,32,33 के लिए इस पूर्व vascularization कहा जाता है। इतना है कि केशिका अंकुरण या तो पहले या समन्वित रूप से प्रत्यारोपित सेल भेदभाव और ऊतक वृद्धि के साथ होता है दूसरा दृष्टिकोण, विवो में सीधे मेजबान की खुद की वाहिका को बढ़ाने के लिए प्रयास करता है। 17,34

इन विवो ऊतक इंजीनियरिंग चैम्बर यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल एक धमनी और एक नस रखकर उत्तरार्द्ध अवधारणा कारनामे, या तो एक धमनी पाश या एक प्रवाह के माध्यम से डंडी विन्यास के रूप में,एक संरक्षित खाली जगह, महत्वपूर्ण अंकुरण और समय के साथ नए केशिकाओं के गठन की अनुमति के अंदर चैम्बर के 3 लाभ में शामिल है (1) इन विट्रो जोड़तोड़ के अभाव। (2) एक पूरी तरह से ऑटोलॉगस संवहनी नेटवर्क है जो मेजबान द्वारा अस्वीकार नहीं किया जाएगा पीढ़ी; और (3) तथ्य यह है कि यह एक inosculation जिस अवधि के 1 से 7 दिनों के बीच ले जा सकते हैं प्रतिपादन ऊतक ischemia होने का खतरा निर्माण की जरूरत नहीं है। 35,36

फिर भी, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि यह महत्वपूर्ण केशिका के लिए होते हैं, एक अवधि के दौरान जो प्रत्यारोपित ऊतक भी खराब आपूर्ति की है अंकुरण के लिए चारों ओर 3-7 दिन लगते हैं। चैम्बर एक बार 3 विलंबित सेल आरोपण के लिए पर्याप्त रूप से vascularized है वास्तव में दिखाया गया है कि सुधार अस्तित्व। 17 एक और लाभ यह biocompatibility और कक्षों 'सामग्री के गैर प्रतिरक्षाजनकता (यानी पॉली कार्बोनेट और polyacrylic) शामिल हैं। इसके अलावा, कठोर गैर सिमटने चामबेर के ऊतक और वाहिका विलय और आसपास के वातावरण, जो अन्यथा विस्तार में बाधा और नवगठित ऊतक की फसल मुश्किल होगा के साथ एकीकृत करने के बिना विकसित करने के लिए एक सुरक्षित स्थान प्रदान करता है। इसके विपरित्त तथ्य यह है कि कक्षों बंद हो जाती हैं ऊतक विकास को सीमित कर सकता है। यह, हालांकि, धमनी पाश मॉडल है, जो अब एक छिद्रित चैम्बर कि ऊतक बंद एक से अधिक प्रभावी ढंग से विकसित करने के लिए दिखाया गया है का उपयोग करता है में संबोधित किया गया है। 37

ऊतक इंजीनियरिंग चैम्बर यहाँ प्रस्तुत प्रोटोकॉल अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य हैं, लेकिन यह जोर दिया जाना चाहिए कि कक्षों शायद ही कभी पूरा करने के लिए आम तौर पर भरने के बारे में 70% की क्षमता है। अनुरूप परिणाम प्राप्त कर रहे हैं प्रदान की है कि कुछ महत्वपूर्ण कदम और तकनीकी मुद्दों को ध्यान में रखा जाता है। डंडी प्रत्यक्षता खासकर अगर microsurgical anastomoses प्रदर्शन कर रहे हैं, जब रक्त वाहिकाओं के साथ काम कर परम उद्देश्य है। हम लगातार पाया है कोई ऊतक vasc यदि बढ़ता हैular डंडी thromboses जल्दी के बाद सर्जरी। प्रत्यक्षता प्रभावित करने वाले कारक मोटे तौर पर चार श्रेणियों, अर्थात् शल्य तकनीकी, रक्त प्रवाह, घनास्त्रता और ऐंठन में बांटा जा सकता है।

सबसे पहले, एक नाजुक सर्जिकल तकनीक की सफलता की कुंजी है। इस अर्थ में, यह ध्यान दिया जाना चाहिए कि इन प्रक्रियाओं, विशेष रूप से एक एक धमनी पाश के सृजन से जुड़े जो आसानी से निर्जीव मॉडल में और निम्न बाद में चूहे की ऊरु वाहिकाओं में पहला अभ्यास द्वारा प्राप्त किया जा सकता शल्य कौशल का एक निश्चित स्तर की आवश्यकता सिद्धांतों और तकनीकों जहाजों की उचित हैंडलिंग, जो कभी नहीं पोत दीवार का पूरा मोटाई हथियाने, खींच अत्यधिक, विवेकपूर्ण रोकने शामिल द्वारा यहाँ और कहीं वर्णित है। हर समय पोत दीवार, विशेष रूप से intima 38 नुकसान से बचा जाना चाहिए द्विध्रुवी coagulator का उपयोग करते हैं, और धमनी लूप के मामले में, जटिल और atraumatic microsurgical anastomoses का प्रदर्शन। हालांकि heparinized खारा के साथ निस्तब्धता थक्के रोकने में मदद करता है, यह एक अच्छा सर्जिकल तकनीक की जगह कभी नहीं होगा। दूसरा, रक्त का प्रवाह कारकों मुख्य रूप से अशांति और ठहराव से संबंधित हैं। अशांत प्रवाह लपेटने के लिए माध्यमिक, झुकता है या जहाजों की सनक thrombus गठन को बढ़ावा देता है। इसलिए एक कारगर अप्रतिबंधित प्रवाह दोनों धमनी पाश और प्रवाह के माध्यम से मॉडल में सुनिश्चित किया जाना चाहिए। इस अर्थ में, धमनी पाश मॉडल में अधिजठर शाखाओं के टेदरिंग प्रभाव झुकने को रोकने के लिए आवश्यक है, यदि किसी भी कारण से इन शाखाओं का इस्तेमाल नहीं किया जा सकता है, आसपास के ऊतकों को पोत दीवार से सरल 10/0 नायलॉन टांके ध्यान बजाय रखा जाना चाहिए। धमनी पाश प्रक्रिया के दौरान anastomotic स्थल पर स्टेटिक खून भी अत्यधिक thrombogenic है और heparinized खारा पहले और सम्मिलन भर साथ सख्ती पोत निस्तब्धता से रोका जाना चाहिए। इस तरह के सहकारी क्षेत्र और सबसे importa से contaminants के रूप में तीसरा, समर्थक थ्रोम्बोटिक कारकोंntly सम्मिलन के अंदर adventitia के टुकड़े की उपस्थिति से परहेज किया जाता है। पोत तैयारी सही ढंग से microsurgical suturing और क्षेत्र और सम्मिलन साफ ​​महत्वपूर्ण पहलुओं जब धमनी पाश के निर्माण पर विचार करने के लिए रखने के लिए नियमित रूप से कर रहे हैं निस्तब्धता से पहले समाप्त हो जाती है। पिछले नहीं बल्कि कम से कम, वहाँ पोत ऐंठन का मुद्दा है। हालांकि पोत ऐंठन के pathophysiology पूरी तरह से स्पष्ट नहीं किया गया है, यह दोनों स्थानीय और प्रणालीगत कारकों की वजह से होने की संभावना है। स्थानीय कारकों पोत आघात, सहकारी क्षेत्र और ऊतकों को सुखाना में रक्त की उपस्थिति में शामिल हैं। प्रणालीगत कारकों, दूसरे हाथ पर, कम कोर तापमान, हाइपरटेंशन और दर्द के प्रति सहानुभूति प्रतिक्रिया शामिल हैं। 38

इस प्रकार, दोनों धमनी पाश और प्रवाह के माध्यम से मॉडल, उचित हैंडलिंग और एक नाजुक सर्जिकल तकनीक के साथ साथ पशु की तैयारी में overemphasized नहीं किया जा सकता है। ऐंठन हल करने के लिए रणनीतियाँ गर्म नमकीन या undiluted साथ सिंचाई शामिल1% xylocaine और 5-10 मिनट की एक आराम की अवधि वाले। वाहिका फैलाव और adventitia के स्ट्रिपिंग भी microsurgical anastomoses और तकनीकी चुनौती का तात्पर्य यह प्रदर्शन करने की जरूरत नाकाम करने के लिए अपने स्थानीय sympathectomy प्रभाव के कारण ऐंठन को राहत देने के लिए मदद कर सकते हैं। 38, कफ तकनीक के रूप में कहीं वर्णित नियोजित किया जा सकता। 39 इस तकनीक होते हैं के पोत से एक डालने एक कफ में समाप्त होता है, यह एवर्ट और एक परिधीय 6/0 नायलॉन सीवन के साथ सुरक्षित। अगले, अन्य पोत अंत कफ अधिक गिरावट और एक समान तरीके से सुरक्षित है।

ऊतक इंजीनियरिंग चैम्बर प्रायोगिक अनुसंधान के क्षेत्र में संभावनाओं की एक नई खिड़की खोल दिया है और तेजी से एक संभावित नैदानिक ​​उद्देश्य की दिशा में आगे बढ़ रहा है। अब तक, यहाँ प्रस्तुत मॉडल विभिन्न प्रजातियों के ऊतकों की पीढ़ी के लिए मुख्य रूप से इस्तेमाल किया गया है। 4,7,8,17,22, 24,25,27-29,37,40 फिर भी, वे का एक नंबर है अन्य संभावित अनुप्रयोगों। उदाहरण के लिए, हम हाइस प्रकार मानव प्रेरित pluripotent स्टेम सेल के आरोपण के बाद टेराटोमा गठन के लिए एक प्रभावी और अपेक्षाकृत तेजी से मॉडल के रूप में प्रवाह के माध्यम से चैम्बर का उपयोग किया है। 41,42, इस दृष्टिकोण ट्यूमर मुक्त ऊतक इंजीनियरिंग प्राप्त करने के लिए एक "गुणवत्ता नियंत्रण" उपकरण के रूप में इस्तेमाल किया जा सकता है स्टेम कोशिकाओं के साथ। इसके अलावा, दवा विष विज्ञान के अध्ययन कक्ष के अंदर उगाया मानव ऊतकों में पता लगाया जा सकता है। इसी तरह, वैकृत ऊतक की पीढ़ी रोग मॉडलिंग और औषधि परीक्षण की दिशा में एक दिलचस्प दृष्टिकोण उपज सकता है। अंत में, ऊतक इंजीनियरिंग चैम्बर भी विवो में और सेल भाग्य के ऊतक के विकास ट्रैकिंग अध्ययन करने के लिए एक संभावित मॉडल बन सकता है।

अंत में, हम दो अलग अलग दृष्टिकोण के माध्यम से एक प्रोटोकॉल पशुओं में एक चमड़े के नीचे कक्ष की नियुक्ति से जुड़े वर्णन किया है: एक microsurgical धमनी पाश, या एक प्रवाह के माध्यम से डंडी विन्यास का उपयोग कर। तकनीक अत्यधिक प्रतिलिपि प्रस्तुत करने योग्य है और अनुरूप परिणाम अर्जित करता है। इसका उपयोग जके रूप में ऊतक इंजीनियरिंग के क्षेत्र में अब तक मुख्य रूप से शोषण किया गया, हालांकि, अन्य संभावित अनुसंधान क्षेत्रों जिसके लिए इन कक्षों महान आवेदन की हो सकती हैं।

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Disclosures

लेखक गण घोषित करते हैं कि कोई प्रतिस्पर्धी हित नहीं हैं।

Acknowledgments

इस काम NHMRC और स्टेफोर्ड फॉक्स मेडिकल फाउंडेशन से अनुदान धन से समर्थन किया था। लेखकों के खिलाफ मुकदमा मैके, लिलियाना पेपे, अन्ना Deftereos और प्रायोगिक मेडिकल की अमांडा रिक्सन और सर्जिकल यूनिट, सेंट विन्सेंट अस्पताल, मेलबॉर्न की शल्य चिकित्सा सहायता स्वीकार करते हैं। समर्थन भी अभिनव, उद्योग के विक्टोरियन राज्य सरकार के विभाग और क्षेत्रीय विकास के परिचालन बुनियादी सुविधाओं सहायता कार्यक्रम द्वारा प्रदान की जाती है।

Materials

Name Company Catalog Number Comments
1 15 Blade Scalpel Braun BB515
1 Toothed Adson Forceps Braun BD527R
1 Needle Holder Braun BM201R
1 Bipolar Coagulator  Braun US335
1 Micro Needle Holder B-15-8.3 S & T 00763
1 Micro Dilator Forceps D-5a.2 S & T 00125
1 Micro Jeweler's Forceps JF-5 S & T 00108
1 Micro Scissors - Straight SAS-11 S & T 00098
1 Micro Scissors - Curved SDC-11 S & T 00090
2 Single Clamps B-3 S & T 00400
2 10/0 nylon suture S & T 03199
1 6/0 nylon suture Braun G2095469
2 4/0 Silk Sutures Braun C0760145
Xilocaine 1% Dealmed 150733 10 mg/ml
Heparin Sodium Dealmed 272301 5,000 UI/ml
Ringer Lactate Baxter JB2323 500 ml
1 dome-shaped tissue engineering chamber custom made
1 flow-through chamber custom made
Lectin I, Griffonia Simplicifolia  Vector Laboratories B-1105 1.67 μg/ml
Troponin T antibody Abcam Ab8295 4 μg/ml
Human-specific Ku80 antibody Abcam Ab80592 0.06 μg/ml
Desmin antibody Dako M0760 2.55 μg/ml
Cell Tracker CM-DiI dye Thermo Fisher Scientific C-7000 3 mg/106 cells
Lethabarb (sodium pentobarbitone) Virbac Animal Health LETHA450 325 mg/ml
Heat pad flexible Redzone Heating RZ/Medium

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References

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एक में आंतरिक vascularization से ऊतक इंजीनियरिंग<em&gt; Vivo</em&gt; टिशू इंजीनियरिंग चैंबर
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Zhan, W., Marre, D., Mitchell, G. M., Morrison, W. A., Lim, S. Y. Tissue Engineering by Intrinsic Vascularization in an In Vivo Tissue Engineering Chamber. J. Vis. Exp. (111), e54099, doi:10.3791/54099 (2016).

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