Nós apresentamos técnicas simples para isolar gigantes cromossomos lampbrush transcricionalmente ativos a partir de oócitos de rãs e salamandras vivo. Nós descrevemos como observar esses cromossomos "vivo" por contraste de fase ou contraste de interferência diferencial, e como corrigi-los para hibridação in situ fluorescente ou coloração de imunofluorescência.
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Artigo de método
Isolamento de gigante lampbrush Cromossomos de Living oócitos de rãs e salamandras
Neste artigo
Resumo
Resumo
Nós descrevemos métodos para estudar os cromossomos gigantes transcricionalmente ativos lampbrush (lbcs) encontrados no oócito ou ovo unlaid, de rãs e salamandras. Lbcs individuais pode ser de até 1 mm de comprimento e que residam num núcleo gigantesca, em si até 0,5 mm de diâmetro. O grande tamanho dos cromossomas permite observações inigualáveis de genes activos por microscopia óptica de luz, mas, ao mesmo tempo técnicas especiais são necessárias para o isolamento do núcleo, retirando o envelope nuclear, e espalhando os cromossomas numa lâmina de microscópio. O núcleo do oócito, também chamado de vesícula germinal (GV), é isolado num meio que permite que a gelificação parcial da actina nuclear e preserva a estrutura delicada das lbcs. Esta etapa é efectuada manualmente, sob um microscópio de dissecação com uma pinça de joalheiro. Em seguida, o envelope nuclear é removido, mais uma vez manualmente com uma pinça de joalheiro. O conteúdo nucleares são rapidamente transferidos para um meio que disperses o gel actina e permite que os lbcs não danificados para liquidar sobre uma lâmina de microscópio. Neste ponto, os lbcs e outras organelas nucleares pode ser visto por contraste de fase ou microscopia de contraste de interferência diferencial, embora mais pequenos detalhes são obscurecidos por movimento browniano. Por observação microscópica alta resolução ou a análise molecular, toda a preparação é centrifugada para prender os delicados lbcs firmemente à corrediça. Uma breve fixação em paraformaldeído é seguida por coloração de imunofluorescência ou hibridação in situ. Lbcs estão em um estado transcricionalmente ativo e seu enorme tamanho permite a análise molecular ao nível do gene individual usando microscopia de super-resolução confocal ou.
Introdução
A maioria dos vertebrados, com a notável exceção de marsupiais e mamíferos placentários, produzem ovos grandes vitelinados. Apesar de seu tamanho, por vezes enorme, esses ovos são células isoladas que atingem a sua dimensão final, enquanto ainda no ovário da fêmea. Ovos do ovário são chamados de ovócitos e cada normalmente contém um único núcleo gigante, conhecido desde o início do século 19 como a vesícula germinal ou simplesmente GV. 1 oócitos de rãs de laboratório comuns, Xenopus laevis e Xenopus tropicalis, atingir um diâmetro máximo de 1,2 milímetros e 0,8 mm, respectivamente (Figura 1). Os GVs de oócitos ....
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Protocolo
Informações gerais sobre rãs e salamandras, bem como fontes de animais, podem ser encontrados nos seguintes sites: Xenbase (http://www.xenbase.org) e Sal-Site (http://www.ambystoma.org). Este protocolo segue as diretrizes de cuidados de animais do Departamento de Embriologia do Instituto Carnegie para a Ciência.
1. Soluções
- Faça 10 L "sapo água": Adicionar 10 ml de 1 M de CaCl2 e 10 mL de 1 M NaHCO3 a 10 L deionizada ou H 2 O sem cloro com agitação.
- Adicione 1 L de 20% de paraformaldeído: Adicione 1 L de 4 mM de Na 2 CO 3. Num capuz química adicionar 200 g de para....
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Resultados
Para examinar os cromossomos lampbrush gigantes começa isolando oócitos de uma rã ou salamandra. A Figura 1 mostra um grupo de oócitos maduros em uma solução salina tamponada, após remoção a partir do ovário da rã, Xenopus. Tais oócitos permanecem em boas condições para dias à temperatura ambiente. O núcleo (ou vesícula germinal) é então removido a partir de um ovócito com um fórceps de joalheiro, quer numa solução salina (Figura 2) ou em óleo <.......
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Discussão
As primeiras observações de lbcs "vivos" de GVs isolado mão de rãs e salamandras foram feitas quase 80 anos pelo biólogo norte-americano William Duryee, 19 antes da introdução de contraste de fase e microscopia DIC, antes de imuno fluorescente, e antes de FISH. As vantagens de lbcs para investigar detalhes da estrutura dos cromossomas e transcrição ao nível do gene indivíduo necessário desenvolvimento de técnicas para prender os lbcs para lâminas de vidro, para corrigi-los de uma forma realista, e a.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
A pesquisa relatada nesta publicação foi apoiada pelo Instituto Nacional de Ciências Médicas Gerais dos Institutos Nacionais de Saúde sob o número de concessão R01 GM33397. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais dos Institutos Nacionais de Saúde. J.G.G. é professor de genética do desenvolvimento da American Cancer Society.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Paraformaldeído (grau reagente, cristalino) | Sigma-Aldrich | P6148-500G | Apesar das advertências em muitos protocolos, uma solução concentrada pode ser armazenada indefinidamente em RT |
| Etil 3-aminobenzoato de metanossulfonato | Sigma-Aldrich | A5040-100G | Às vezes referido como MS-222 |
| Ethicon RB-1 1/2 ponto de conicidade circular 3-0 suturas | VWR | 95057-000 | |
| Paraplast (cera de parafina) | Sigma-Aldrich | P3558-1KG | |
| em>p-Fenilenodiamina | Gelatina Sigma-Aldrich | P6001 | |
| Gelatina | Mercearia | Comercial Knox funciona bem | |
| ProLong Gold antifade mountant | ThermoFisher Scientific | P10144 | |
| Tampa de vidro Gold Seal 22 x 22 mm #1 1/2 (0.16 - 0.19 mm de espessura) | Electron Microscopy Sciences | 63786-01 | Estas lamínulas têm a espessura recomendada para microscopia de superresolução |
| Pinça Dumont #5 | Electron Microscopy Sciences | 72700-D | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/tweezers/dumont_positive_action.aspx |
| Óleo de parafina (leve) | EMD Chemicals | PX0047-1 | Para isolar GVs em óleo |
| Adesivo in situ PCR e câmaras de hibridização (25 µ L) | Câmaras | deslizantes BioRad Frame-Seal #SLF0201 | http://www.bio-rad.com/en-us/sku/slf0201-frame-seal-slide-chambers |
| Isoladores de silicone | Grace-Biolabs | select from catalog link | http://www.gracebio.com/life-science-products/microfluidics/silicone-isolators.html |
| Frascos Coplin e pratos de coloração | Electron Microscopy Sciences | select from catalog link | http://www.emsdiasum.com/microscopy/products/histology/staining.aspx |
Referências
- Purkinje, J. E. Symbolae ad ovi avium historiam ante incubationem. , Leopold Vossi. (1830).
- Rückert, J. E. Zur Entwickelungsgeschichte des Ovarialeies bei Selachiern. Anat. Anz. 7, 107-158 (1892).
- Callan, H. G.
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Reimpressões e permissões
