Descrevemos aqui os últimos avanços no isolamento viral para a caracterização de novos genótipos de Faustovirus, uma nova linhagem de vírus gigantes relacionada ao asfarvirus. Este protocolo pode ser aplicado ao isolamento de alto rendimento de vírus, especialmente vírus gigantes que infectam ameba.
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Artigo de método
Uma estratégia rápida para o isolamento de novos Faustoviruses de amostras ambientais Usando
Neste artigo
Resumo
Resumo
O isolamento do vírus gigantes é de grande interesse nesta nova era de virologia, especialmente desde que estes vírus gigantes estão relacionados com protistas. vírus gigantes podem ser potencialmente patogênicos para muitas espécies de protistas. Eles pertencem à ordem descrita recentemente de Megavirales. A nova linhagem Faustovirus que foi isolado a partir de amostras de esgoto está distantemente relacionado com o agente patogénico de mamífero suíno Africano vírus da peste. Este vírus também é específico para o seu hospedeiro amébica, vermiformis Vermamoeba, um protista comuns em sistemas de água de cuidados de saúde. É crucial para continuar a isolar novos genótipos Faustovirus, a fim de ampliar sua coleção genótipo e estudar a sua pan-genoma. Nós desenvolvemos novas estratégias para o isolamento de estirpes adicionais, melhorando a utilização de combinações de antibióticos e antifúngicos, a fim de evitar as contaminações bacterianas e fúngicas da co-cultura ameba e favorecendo a multiplicação do vírus. Além disso, implementamos um novo starvation forma a manter V. vermiformis em condições óptimas para vírus co-cultura. Finalmente, utilizou-se citometria de fluxo em vez de observação microscópica, o que é moroso, para detectar o efeito citopatogénico. Obtivemos dois isolados de amostras de esgoto, comprovando a eficiência deste método e alargando, assim, a coleção de Faustoviruses, para entender melhor seu ambiente, especificidade do hospedeiro e conteúdo genético.
Introdução
A descoberta de vírus gigantes, especialmente aquelas que pertencem à ordem Megavirales, mudou completamente o mundo dos vírus em termos de tamanho de partícula e a complexidade do genoma. Os vírus foram previamente pensado para ser pequenas entidades, ea Mimivírus apareceu para quebrar todas as regras. 1 dados metagenômica sugere a ubiquidade dos vírus gigantes não só no ambiente, 2-5, mas também em seres humanos. 6 Portanto, ainda há uma necessidade de pesquisa para estes vírus em grande escala. A diversidade destes vírus gigantes foi avaliada por amostragem não só uma variedade de ambientes aquáticos e dos seus sedimentos associado....
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Protocolo
Coleção 1. Amostra
- Colete 70 amostras de diferentes ambientes e regiões. Neste caso, use os seguintes: 5 amostras de água sujas da aldeia de Saint Pierre de Meyzoargues (França), 15 amostras do lago em Parc Borély em Marselha (França); 15 amostras de água do mar com sedimentos das enseadas rochosas em Samena em Marselha (França), 25 amostras de água do rio dos Alpes (França), e, finalmente, 10 amostras de esgoto em La Ciotat (França).
- amostras vortex por homogeneização antes de inocular, durante um minuto à temperatura ambiente, sem qualquer tratamento.
2. Processo de isolamento
- Hospedar Preparação pa....
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Resultados
O sistema estudado neste manuscrito validado a sua prova de conceito, isolando dois novos Faustoviruses. Das 70 amostras testadas, dois episódios de lise foi detectada, em contraste com os controlos negativos fiáveis. O controlo negativo para a lise continha uma população ameba 86%. Em contraste, as amostras positivas (ST1 para Saint Pierre de Meyzoargues), e (LC9 para a amostra de La Ciotat 9) mostraram um declínio dramático no amebas fechado; mais de 60% de amebas foram lisadas com a m.......
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Discussão
A possibilidade de que poderia ser Faustovirus o primeiro membro de uma nova família Megavirales perto de VPSA foi primeiro sugerida por Reteno et al., 19, mas algumas diferenças ainda pode ser distinguida. Parece claro se Faustovirus deve se juntar à família Asfarviridae ou se deve, em vez formar uma nova família viral putativo. Este problema vai exigir uma investigação mais aprofundada, em particular, uma caracterização mais abrangente de sua morfologia, gama de hospedeiros, o ciclo de replicação e.......
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Divulgações
Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.
Agradecimentos
Os autores não têm agradecimentos a fazer.
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Citômetro LSR FORTESSA | BD Biosciences | França | Nº 649225B4 |
| TECNAI G2 F20 | FEI | Alemanha | Rolamento 5027/11 |
| Microscópio óptico invertido | leica | França | 72643 |
| Extração de DNA | Qiagen EZ1 Advanced XL Robô de Extração | França | L106A0452 |
| PCR Cycler CFX96 | Bio rad | França | 785BR06298 |
| Meio PYG, PAS, Meio de fome | Produção interna em laboratório | Marselha URMITE | x |
| Amoeba cepa CDC-19 | ATCC | França | 50237 |
| Placas | Cellstar | França | 655180 |
| Materiais de PCR, primers. | eurogentec | França | Primers citados no |
| slide de vidro manuscrito 10 com grades | Kova | EUA | H899871441F |
| Eosin/azul Azur-Hemacolor mancha | Merck milipore | França | 111955,6,57,109468 |
| Filtros acionados a vácuo | Thermo scientific | France | BPV4550 / 20170115 |
| Solução salina tamponada com fosfato | Thermo Fisher scientific | França | 10010-023 |
| Mancha DAPI | Life Technologies | França | D1306 |
| citocentrifugador cytospin 4 | Thermo Fisher científico | França | 10522013JT184-31 |
| Túnel de citologia única | Polímeros biomédicos inc. | França | BMP-cyto-S50 |
| Grades de carbono | Euromedex | França | FCF400NI |
| Molibdato de amônio | VWR internacional; | França | 21276185 |
| Frascos | SARSTEDT | Alemanha | 833911 |
| 0,22 μ Filtros M | Milex millipor | França | SE2M229104 |
| Ultracentrífuga Sorval WX 80 | Thermo scientific | França | 9102448 |
| Filtros de fluxo rápido | Nalgene | França | 450-0020 |
Referências
- Raoult, D., et al. The 1.2-megabase genome sequence of Mimivirus. Science. 306 (5700), 1344-1350 (2004).
- Claverie, J. -M. Giant viruses in the oceans: the 4th Algal Virus Workshop. Virol J. 2, 52-52 (2004).
- Monier, A. A., et al.
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Reimpressões e permissões
