Artigo de método

Detecção de Anastasis na Vivo por CaspaseTracker Biosensor

DOI:

10.3791/54107

⸱

1 de fevereiro de 2018

 ,  , 
1Institute for Basic Biomedical Sciences, Johns Hopkins University School of Medicine, 2School of Life Sciences, Chinese University of Hong Kong, 3Department of Neurosurgery, Johns Hopkins University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

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Anastasis é tecnicamente desafiador para detectar na vivo porque as células que reverteram o processo de morte celular podem ser morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais. Aqui descrevemos os protocolos para detecção e monitoramento de células que passam por anastasis em animais vivos, usando nosso sistema de biosensor recentemente desenvolvido na vivo CaspaseTracker.

Resumo

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Anastasis ("ressurreição para a vida" em grego) é um fenômeno de recuperação celular recentemente descoberto pelo qual as células a morrer pode reverter processos de morte celular do tarde-estágio que geralmente são considerados intrinsecamente irreversível. Promoção anastasis poderia no resgate de princípio ou preservar feridos células que são difíceis de substituir tais como cardiomyocytes ou neurônios, facilitando assim a recuperação do tecido. Por outro lado, suprimindo anastasis em células de câncer, passando por apoptose após terapias contra o cancro, pode assegurar a morte de células de câncer e reduzir as chances de recorrência. No entanto, estes estudos foram dificultados pela falta de ferramentas para controlar o destino das células que passam por anastasis em animais vivos. O desafio é identificar as células que reverteram o processo de morte celular apesar de sua aparência morfologicamente normal após a recuperação. Para superar esta dificuldade, nós desenvolvemos Drosophila e sistemas de biosensor CaspaseTracker mamíferos que podem identificar e controlar permanentemente o anastatic células in vitro ou in vivo. Aqui, apresentamos os protocolos na vivo para a geração e utilização do sistema CaspaseTracker dual biosensor para detectar e rastrear anastasis em Drosophila melanogaster após exposição transitória aos estímulos de morte celular. Enquanto biosensores convencionais e protocolos podem rotular as células ativamente submetidos à morte de células apoptóticas, o biosensor CaspaseTracker permanentemente pode rotular as células que se recuperaram após a ativação de caspase - uma marca registrada da apoptose do tarde-estágio, e simultaneamente identifica processos apoptotic ativo. Este biosensor também pode acompanhar a recuperação das células que tentou outras formas de morte celular que directa ou indirectamente envolvidas caspase atividade. Portanto, este protocolo permite-nos acompanhar continuamente o destino dessas células e seus descendentes, facilitando estudos futuros da funções biológicas, mecanismos moleculares, fisiológicas e patológicas consequências e implicações terapêuticas de anastasis. Também discutimos os controles adequados para distinguir células que passam por anastasis daqueles que exibem não-apoptotic caspase atividade in vivo.

Introdução

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Programado a morte celular, tais como apoptose, desempenha um papel essencial no desenvolvimento embrionário e homeostase normal, eliminando indesejadas, feridas ou perigosas de células em organismos multicelulares1,2,3. A perda do equilíbrio entre a morte celular e sobrevivência pode levar a consequências fatais como câncer, insuficiência cardíaca, auto-imunidade e degeneração4,5,6,7,8. Ativação de carrasco caspases tem sido tradicionalmente considerada como o "ponto sem retorno" em apoptose9,10,11, que provoca rápida e maciça demolição celular12, 13,14,15,16. Desafio este dogma geral, temos demonstrado que culturas de células primárias moribundos e células cancerosas podem recuperar a não somente após a ativação de caspase, mas também seguir célula importante marcas de morte, incluindo blebbing de membrana plasmática, encolhimento celular, mitocondrial fragmentação, liberação de mitocondrial citocromo c no citosol, nuclear e condensação da cromatina, danos no DNA, fragmentação nuclear, célula superfície exposição de fosfatidilserina (PS) e formação de corpos apoptotic 17 , 18 , 19 , 20 , 21. propomos que anastasis é um fenómeno de recuperação de célula intrínsecas, como células morrendo podem recuperar após a remoção da célula morte estímulos17,18,19,20, 21. cunhou o termo "Anastasis" (Αναστάσης)18, que significa "subir de vida" em grego, para descrever este fenômeno de recuperação celular inesperado. Nossa observação de anastasis mais é suportada por recentes estudos independentes que também revelam a recuperação das células após a fosfatidilserina exteriorização22,23,24, limitado mitocondrial externa membrana de permeabilização25, ativação de linhagem mista como quinase (MLKL) e de encolhimento de célula26.

Caracterizar os mecanismos de regulação anastasis terá implicações fisiológicas, patológicas e terapêuticas mudança de paradigma. Anastasis poderia representar um mecanismo previamente desconhecido tilacoides para resgatar ou preservar importantes postmitotic células e tecidos que são difíceis de substituir e possivelmente conta para reversão de insuficiência cardíaca por descarga ventricular com ventricular esquerda assistir dispositivos (LVADs)27,28, recuperação de células fotorreceptoras após exposição transitória de luz excessiva29,30,31, ou reparação de neurônios depois de lesão cerebral32. Se então promover anastasis poderia reforçar a recuperação de células e tecidos. Por outro lado, anastasis pode ser uma tática de fuga inesperada, usada por células cancerosas a sobreviver a terapia de indução de morte celular, causando câncer recorrência17,18. Portanto, suprimindo o anastasis na morte de células cancerosas durante e após o tratamento do câncer pode ser uma romance estratégia terapêutica para curar o câncer, impedindo sua recaída.

Durante o processo de anastasis, achamos que algumas células recuperadas adquiriram permanentes alterações genéticas e foi submetido a transformação oncogênica, provavelmente devido a danos no DNA incorridos durante a apoptose18,20,21 . Inverter o processo de morte de células com DNA danificado pode ser um mecanismo de tumorigênese, potencialmente subjacente a observação que repetidas lesões no tecido aumenta o risco de câncer em uma variedade de tecidos, tais como lesões térmicas crônica do esôfago induzida pelo consumo de bebidas muito quentes33,34,35, lesão hepática devido ao alcoolismo36,37, evolução do tumor após genotóxicos câncer terapia38, 39,40e desenvolvimento de novos cancros de tecidos normais que surgem durante os intervalos entre os ciclos de terapia anti-câncer41,42,,43,44 . Se true, alvejando anastasis poderia impedir ou prender o desenvolvimento de câncer e progressão. Nós achamos que induzida por inanição moribundos células germinativas sofrem anastasis na re-alimentados Drosophila19.  Se anastasis ocorre em células germinativas com danos no DNA, pode ser conta para a observação de que prolongado estresse ambiental promove o desenvolvimento de doenças genéticas. Por exemplo, fomes contribuam para o desenvolvimento de doenças hereditárias transgeracional, como diabetes e doenças coronarianas45. Portanto, anastasis de compreensão pode levar a estratégias para a prevenção de doenças hereditárias causadas por este mecanismo potencial de desenvolvimento.

Para aproveitar a descoberta de anastasis e direcioná-lo para desenvolver terapias inovadoras, é essencial estudar a causa e consequência de anastasis em animais vivos. No entanto, tecnicamente é um desafio para identificar e rastrear anastatic células na vivo, porque as células que se recuperou do processo de morte celular aparecem morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais, e não há nenhum biomarcador de anastasis identificados ainda17,18,21. Para resolver esses problemas, recentemente desenvolvemos um novo na vivo caspase biosensor designado "CaspaseTracker"19, para identificar e localizar as células que sobrevivem a apoptose depois de19,de ativação do caspase46, o marca registrada do apoptosis10,14. Distinguindo-a dos biosensores caspase "tempo real" como SCAT12,47, Apoliner48, CA-GFP49, ApoAlert18,50, C3AIs51 e iCasper52 que detecta atividade de caspases em curso, o biosensor CaspaseTracker adicionalmente apresenta a capacidade de permanentemente rotular as células nessa atividade caspase expressa mesmo transitoriamente. Portanto, o biosensor CaspaseTracker permite rastreamento de longo prazo de anastasis após reversão de caspase-mediada pilha morte processo em vivo.

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Protocolo

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1) preparação de moscas CaspaseTracker Biosensor

  1. Anestesiar moscas com CO2e use um pincel para transferência de 7 a 10 sensíveis à caspase Gal4 (DQVD)19 virgem fêmeas e 7 a 10 G-rastreamento53 Gal4 repórter jovem masculinas moscas (ou vice-versa) no mesmo frasco com comida de mosca e colar de fermento fresco.
    Nota: Cruz de moscas Gal4 Caspase-sensível (DQVD) e G-rastreamento produzirá moscas de descendência CaspaseTracker. Cruz da Caspase -nosensível (DQVA)19 Gal4 e moscas G-rastreamento irão fornecer controle negativo voa (ver discussão). Fermento fresco colar serve como fonte de proteína para aumentar a produção de ovos, assim que aumenta o número de descendentes. Selecionar as fêmeas virgens e jovem macho voa de acordo com seus fenótipos54.
  2. Incubar as moscas a 18 graus Celsius (oC) durante a Cruz por 3 a 7 dias e depois transferir as moscas para um novo frasco para configurar uma nova Cruz a 18 ° C. Continue a incubar o frasco original a 18 ° C até a descendência voa eclose.
    Nota: Transferi o pai voa para novos frascos para evitar superlotação de progênie no frasco original. Moscas de pai podem produzir progênie com alimentos frescos e colar de levedura nos primeiro de 2 a 3 interruptores, e então a produtividade diminuirá significativamente com o tempo. Levantando moscas 18 ° C pode reduzir o sinal específico de biosensor CaspaseTracker (ver discussão).
  3. Selecione progênie voa com fenótipos correto54 para experimentos seguintes.
    Nota: Os transgenes de caspase-sensível Gal4 e G-rastreamento aqui estão localizados no cromossomo segundo, equilibrado com balanceador CyO. Selecione a progenitura de asa não-curly (sem CyO), que tem ambos os transgenes de caspase-sensível Gal4 e G-rastreamento.

2) a aplicação de indução de morte celular transitória para moscas CaspaseTracker Biosensor

  1. Transferência de 10 a 20 recém eclosed fêmea voa para um novo frasco com alimentos frescos de voar e colar de fermento fresco para 1 dia a 18 ° C, para permitir a produção de câmara de ovos pela ovogênese.
    Nota: Mantendo a fêmea com moscas machos pode aumentar a produção de câmara de ovos.
  2. Para câmaras de ovo submeter-se a apoptose por choque frio, transferência de induzir a fêmea voa para novo frasco vazio, que é então colocado a-7 ° C durante 1 h.
    Nota: choque frio fere células através da indução de55,de ruptura de membrana plasmática56.
  3. Para induzir o ovo câmaras submeter-se a apoptose por inanição de proteína, transferi as moscas fêmeas para um novo frasco com 8% de sacarose e 1% alimentos de ágar a 18 ° C durante 3 dias.
    Nota: Fome de proteínas (alimentos não proteico) pode desencadear câmaras de ovo para se submeter a apoptose57,58,59 e autofagia60,61. Interruptor voa para um novo frasco com comida de ágar de sacarose e 1% de 8% todos os dias para manter a condição ideal de sacarose a comida de mosca.
  4. Transferi as moscas estressadas volta para um novo frasco com alimentos frescos de voar e colar de fermento fresco por 3 dias a 18 ° C, para permitir-lhes para se recuperar. Disse a fome e as moscas de fome-recuperado para obter câmaras de ovo de ovários como descrito62.
    Nota: Para dissecar drosófila para obter os ovários, anestesiar moscas com CO2e usar 2 pares de pinças para remover a cabeça de mosca e use a pinça para puxar a base do abdômen para remover os ovários das moscas.

3) fixação e coloração das câmaras de ovo dissecado para a imagem latente

  1. Transferi as câmaras dissecado ovo junto com ao redor de soro fisiológico 0,5 mL tamponado fosfato (PBS) para tubos de centrífuga de 1 mL. Permitir que os ovos se acalmar.
    Nota: Cubra as pontas de pipetas de plástico com 1% albumina de soro bovino (BSA) dissolvido em água ou PBS para evitar que as câmaras de ovo para ficar na superfície de plástico das dicas. Execute os seguintes procedimentos no escuro para evitar fotobranqueamento de proteína fluorescente vermelha (RFP, também conhecido como DsRed) e proteína verde fluorescente (GFP) na sala do ovo.
  2. Remova a PBS pipetando e então aplique paraformaldeído 4% de 0,5 mL de PBS para corrigir as câmaras de ovo em temperatura ambiente no escuro por 20 a 30 min.
    Nota: Aplica rotação suave neste e as seguintes etapas de incubação.
  3. Remover o paraformaldeído pipetando e em seguida, lavou a câmara de ovo com 0,5 mL PBST (PBS + 0,1% Triton X-100) por 3 vezes.
    Nota: Fixação prolongada poderia reduzir os sinais RFP e GFP.
  4. Incubar as câmaras de ovo com PBST para 1 a 2 h à temperatura ambiente ou durante a noite a 4 ° C, com suave rotação para permeabilize as câmaras de ovo.
    Nota: PBST também pode evitar câmaras de ovo para manter a superfície de plástico revestida não-BSA.
  5. Remover o PBST pipetando e em seguida, aplicar 0,5 mL de 10 μg/mL de corante azul de Hoechst nuclear em PBST ovo câmaras para 1 a 2 h à temperatura ambiente a mancha para núcleo.
    NOTA1: Evite a incubação prolongada com corante nuclear como isto irá aumentar o sinal específico.
    Obs2: Uma abordagem alternativa para manchar o núcleo sem Hoechst é adicionar 200 agente μL de montagem de antibranqueamento com DAPI (ver materiais) e incubar durante a noite,63, antes de montar os tecidos no deslizamento da tampa de vidro, conforme descrito no protocolo 3.8.
    Note3: executar a coloração e os procedimentos a seguir no escuro para evitar fotobranqueamento.
  6. Remover o corante nuclear pipetando e em seguida, aplicar 0,5 mL PBST lavar as câmaras de ovo em tubos de centrífuga de 1 mL por 3 vezes, com incubação de 10 a 20 min com suave rotação entre cada etapa de lavagem.
  7. Remover todos os PBST com pipeta fina e em seguida, aplicar 200 agente de montagem antibranqueamento μL (ver materiais) para incubar as câmaras de ovo em temperatura ambiente por 3 h ou durante a noite a 4 ° C até que as câmaras de ovo afundam até o fundo do tubo.
    Nota: os tecidos que absorveram plenamente o agente de montagem afundam até o fundo do tubo.
  8. Montar as câmaras de ovo manchado por transferi-los com 200 μL antibranqueamento montagem agente sobre uma lâmina de vidro previamente limpos para a imagem latente por pipetagem, cobrir as câmaras de ovo com uma lamela de vidro previamente limpos de 20 x 20 mm e selar a lamínula sobre a lâmina de vidro, colocando esmalte na borda da lamínula.
    NOTA1: Limpeza prévia a lâmina de vidro e lamínulas com água ou 70% de etanol.
    Obs2: Aplique vaselina entre a lâmina de vidro e o deslizamento da tampa para evitar destruir as câmaras de ovo por overcompression.
  9. As câmaras de ovo usando fluorescência ou microscópio confocal, usando um x 20, at 0.8 de imagem plano-Apochromat objectivo, com excitação luz de comprimento de onda 405 nm para coloração nuclear (detectar emissões ~ 461 nm), 561 nm para (sinal RFP (atividade da caspase recentes ou em curso) detectar emissões ~ 590 nm) e 488 nm para sinal GFP (passado atividade caspase) (detectar emissões ~ 518nm).
    Nota: Consulte nossos protocolos publicados para microscopia20,64.

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Resultados

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Enquanto microscopia de lapso de tempo célula viva é um método confiável para trato anastasis em pilhas cultivadas20, é um desafio para identificar quais células sofreram anastasis em animais, porque as células recuperadas parecem morfologicamente indistinguíveis de células saudáveis normais que não procuraram a morte celular. Por exemplo, células de cancro do colo do útero humano HeLa exibem características morfológicas de2,apoptose1...

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Discussão

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O sistema de dupla biosensor CaspaseTracker é uma nova e exclusiva ferramenta que permite a detecção de recente ou atividade caspase em curso e rastreamento de células que reverteram a morte celular processar e sobrevivem depois de experimentar caspase atividade na vivo. Enquanto atividade caspase tem sido tradicionalmente assume-se como uma marca registrada da apoptose, crescentes estudos revelam que não-apoptotic caspase atividade desempenha funções potenciais em funções divers...

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Divulgações

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Os autores não têm nada para divulgar.

Agradecimentos

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Agradecemos Darren Obbard imagem de Drosophila em Figura 3 e no manuscrito de vídeo; J. Marie Hardwick, Wade Gibson e Heather M. Lamb para discussão valiosa sobre este manuscrito. Este trabalho foi apoiado por um Sir Edward Youde Memorial Fellowship (H.L.T.), Dr. Walter Szeto Memorial Scholarship (H.L.T.), Fulbright conceder 007-2009 (H.L.T.), Life Science Research Foundation fellowship (H.L.T.) e o ICN K22 concedem CA204458 (H.L.T.). Ho Lam Tang era um Shurl e Kay Curci Fundação Fellow da Fundação de pesquisa de Ciências da vida (2014-2017).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
CONSUMÍVEIS E REAGENTES
Vectashield meio de montagemVector ProductsH-1000Antifade
de montagem Vectashield (com DAPI)Vector ProductsH-1200Meio de montagem antifade com pinça DAPI
Ted Pella#505 (110mm, #5)Pinça Dumont grau de biologia, lâminas de aço inoxidável
FisherScientific12-565BLâminas de vidro
Hoechst 33342Sondas MolecularesH1399Mancha de DNA
Mitotracker Red CMXRos Molecular ProbesM-7512Coloração mitocondrial
Cleaved caspase-3 (Asp175) anticorpoTecnologia de Sinalização Celular#9661Coloração para fragmento ativo de caspase-3
Albumina de soro bovino (BAS)Sigma-AldrichA8806Agente bloqueador para imunocoloração
Phosphate Buffered Saline VWR114-056-101Meio para lavagem e imunocoloração
Triton™ X-100Sigma-AldrichT8787Detergente para permeabilização celular
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
EQUIPMENT
LSM780 microscópio confocalCarl ZeissN/AImaging
Estereomicroscópio Carl Zeiss Stemi 2000 Carl ZeissN/ADrosophila dissecção
AmScope Fiber Optic Dual Gooseneck Microscópio Iluminador, 150WAmScopeWBM99316 luz
meio

Referências

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