Neste manuscrito, são apresentados métodos de oxidação periodato e reticulação de glutaraldeído para imobilização covalente de anticorpos em discos de papel. A atividade de ligação dos anticorpos imobilizados foi avaliada. Com base nesses resultados, um método de reticulação de glutaraldeído foi usado para desenvolver um novo imunoensaio baseado em papel para detecção de imunoglobulina G (IgG).
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Artigo de método
A ligação covalente de anticorpos para celulose discos de papel e suas aplicações em visível a olho nu colorimétricos imunoensaios
Neste artigo
Resumo
Resumo
Este relatório apresenta dois métodos para a imobilização covalente de anticorpos de captura na filtro de celulose tipo de papel No. 1 (papel de filtro de médio fluxo) discos e grau No. 113 (papel de filtro fast-fluxo) discos. Estes discos de papel de celulose foram enxertado com grupos funcionais de amina através de uma técnica de acoplamento de silano antes de os anticorpos foram imobilizados sobre eles. métodos de ligação cruzada de oxidação e glutaraldeído periodato foram usadas para enxertar anticorpos de captura sobre os discos de papel de celulose. A fim de garantir a capacidade máxima de ligação dos anticorpos de captura para os seus alvos após imobilização, foram investigados os efeitos de várias concentrações de periodato de sódio, o glutaraldeído, e anticorpos de captura na superfície dos discos de papel. Os anticorpos que foram revestidas sobre os discos de papel de celulose funcionalizada com amina por meio de um agente de reticulação com glutaraldeído observado aumento na actividade de ligação ao alvo, quando comparado com o método de oxidação com periodato. IgG (no soro do rato de referência) foi usado como um alvo de referência neste estudo para testar a aplicação de anticorpos imobilizados covalentemente através de glutaraldeído. Um novo à base de papel, ensaio imunoabsorvente ligado a enzima (ELISA) foi desenvolvido e validado para a detecção de anticorpos IgG com sucesso. Este método não necessita de equipamento, e pode detectar de 100 ng / ml de IgG. O papel de filtro rápido de fluxo foi mais sensível do que o papel de filtro de média de fluxo. O período de incubação do presente ensaio foi de curta e necessário pequenos volumes de amostra. Este visível a olho nu, imunoensaio colorimétrica pode ser estendido para detectar outros alvos que estão identificados com ELISA convencional.
Introdução
O estudo de diagnóstico testes point-of-care (POCT) é importante para o desenvolvimento de novas estratégias para a terapêutica, medicina personalizada e atendimento domiciliar 1. Papéis de celulose são amplamente utilizados como plataformas em imunoensaios, porque são baratos, acessível, e familiar para os utilizadores 2. Além disso, a estrutura porosa de papel de celulose possui a capacidade de dirigir o fluxo de líquido sem impacto de energia adicional. Registros de bioanalysis baseado em papel pode ser encontrada já no século 20, quando a cromatografia em papel foi inventado pela primeira vez em 1952. O exemplo mais comum é os tes....
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Protocolo
1. Os grupos funcionais amina sobre a celulose Alongamento discos de papel
- Preparar um pedaço de papel quadrado com uma dimensão de 1 cm x 1 cm, e de 100 discos de papel feitas a partir de uma série No. papel de celulose com um diâmetro de 6,0 mm (papel de filtro de média de fluxo) utilizando um furador.
- Para derivar grupos -NH2 sobre os discos de papel, mistura de 1 ml APS e 10 ml de acetona num frasco de vidro de 50 ml, na hotte. Adicionar discos de papel para a mistura reagente APS recentemente preparada, e incuba-se durante 5 h com agitação orbital (200 rpm) a temperatura ambiente de 32.
Cuidado: Pega APS e aceton....
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Resultados
Figura 3. transformada de Fourier espectro de infravermelho (FTIR) de papel de filtro de média de fluxo não tratado e APS-tratado quadrado (A) e filtro de fluxo rápido-quadrado de papel (B). Uma. Os espectros de papel quadrado não tratada do filtro de média de fluxo foi semelhante ao do APS papel quadrado tratada filtro de média de fluxo. O aumento das intensidades d.......
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Discussão
revestimento directo de captura de anticorpo purificado por afinidade de cabra anti-IgG de rato-Fc em discos de papel de celulose não modificado foi realizado para detectar concentrações de IgG. Os resultados indicaram que, adicionalmente a fixação dos anticorpos de captura é necessário para reprodutibilidade. A técnica de silano foi utilizado com sucesso para introduzir grupos funcionais de amina para os discos de papel de celulose 34. A concentração de EPA afecta a imobilização dos anticorpos. Portanto, a q.......
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Divulgações
Os autores não têm nada a divulgar.
Agradecimentos
Este trabalho foi apoiado financeiramente pelo Ministério da Educação de Cingapura por meio do Subsídio Translacional e de Inovação (MOE2012-TIF-2-G-009).
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Materiais
| Nome | Empresa | Número de catálogo | Comentários |
|---|---|---|---|
| Papel de filtro de celulose, Grau 1 (papel de filtro de fluxo médio) | GE Healthcare Pte Ltd Singapore | 1001 110 | |
| Papel de filtro de celulose, Grau 113 (Papel de filtro de fluxo rápido) | Sigma-Aldrich, Singapura | 1113-320 | |
| Glutaraldeído | Sigma-Aldrich, Singapura | G6257 | Grau II, 25% em H2O |
| Surfactante | Tween-20, Sigma-Aldrich, Singapura | P2287 | |
| Álbum de soro bovino | Sigma-Aldrich, Singapura | A2153 | |
| Leite em pó desnatado | Louis Franç OIS | Embalado por alcaparras de cozinha, Cingapura | |
| Tris base | Promega | H5135 | |
| Periodato de sódio | Merck | 106597 | |
| Na2HPO4 | Merck | 106585 | |
| KH2PO4 | Merck | 104873 | |
| NaCl | CALBIOCHEM | ||
| NaOH | Merck | 106462 | |
| HCl | Merck | tampão | |
| (PBS) | N/A | N/A | PBS, contendo 137 mmol/L NaCl, 2,7 mmol/L KCl, 8.0 mmol/ L Na2HPO4 e 1,5 mmol/L KH2PO4, é preparado com água e ajustado para pH 7,4 com 0,1 mol/L NaOH ou 0,1 mol/L HCl |
| Acetona | Tee Hai Chem Pte Ltd Singapura | 9005-68 | |
| Mistura de TMB e solução de peróxido de hidrogênio | Solução ultra TMB-ELISA de 1 etapa, Thermo Scientific Pierce | 34029 | 1 L |
| Coelho anti-humano IgG-FITC | TWC/Bio Pte Ltd Cingapura | sc-2278 | |
| Peroxidase conjugada cabra anti-coelho IgG | TWC/Bio Pte Ltd Cingapura | sc-2030 | |
| Anticorpo de revestimento anti-IgG-Fc de cabra purificado por afinidade | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131A | |
| Referência de camundongo soro | Bethyl Laboratories, Inc | RS10-101-5 | 9,5 mg/ml |
| HRP conjugado cabra anti-camundongo anti-camundongo anticorpo de detecção IgG-Fc | Bethyl Laboratories, Inc | A90-131P | |
| Equipment | |||
| Fourier transform infrared spectrophotometer | Shimadzu IR Prestige-21 | N / A | |
| Gerador de imagens moleculares de fluorescência | Pharos FXTM plus gerador de imagens moleculares, Bio-Rad, Cingapura | Forno N / A | |
| NUVE | FN500 | N / A | |
| Turbo mixer VM-2000 | MYC LTD | N / A | |
| ImageJ | RGB, download gratuito | N / A |
Referências
- Curtis, K. A., Rudolph, D. L., Owen, S. M. Rapid detection of HIV-1 by reverse-transcription, loop-mediated isothermal amplification (RT-LAMP). J. Virol. Methods. 151 (2), 264-270 (2008).
- Martinez, A. W., Phillips, S. T., Carrilho, E., Thomas, S. W., Sindi, H., Whitesides, G. M.
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Reimpressões e permissões
