Síntese de DNA sondas de hibridação de mudança de comprimento de onda usando fotoestável Cyanine Corantes

Resumo

Os corantes fotoestáveis de cianina são ligados a oligonucleotídeos para monitorar a hibridização por transferência de energia.

Resumo

Neste protocolo, demonstramos um método para a síntese de 2'-alcino modificado cadeias de ácido desoxirribonucleico (ADN) por síntese em fase sólida automatizados usando a química fosforamidite padrão. Oligonucleotídeos são pós-sinteticamente marcado por dois novos corantes cianina fotoestáveis ​​usando click-química catalisada por cobre. A síntese de ambos os corantes dador e aceitador é descrita e é realizado em três etapas consecutivas. Com o ADN como a arquitectura envolvente, estes dois corantes submetidos a uma transferência de energia quando eles são colocados em estreita proximidade por hibridação. Portanto, emparelhamento de duas cadeias de ADN de cadeia simples é visualizada por uma mudança de cor de fluorescência. Esta mudança de cor é caracterizado por espectroscopia de fluorescência, mas pode também ser directamente observada por utilização de uma lâmpada ultravioleta de mão (UV). O conceito de uma leitura de cor de fluorescência dupla faz com que essas sondas de oligonucleotídeos excelentes ferramentas para imagiologia molecular, especialmente quando o pho descritacorantes tostable são utilizados. Deste modo, as sondas fotodegradação de imagiologia é prevenida, e os processos biológicos pode ser observada em tempo real durante um período de tempo mais longo.

Introdução

A imagem molecular representa uma técnica fundamental para a compreensão dos processos biológicos dentro de células vivas. ^1-3 O desenvolvimento de sondas fluorescentes de ácidos nucleicos com base para tais aplicações químico-biológica tornou-se um campo de pesquisa em expansão. Estas sondas fluorescentes precisam atender a alguns requisitos para se tornar as ferramentas apropriadas para imagens de células. Em primeiro lugar, os corantes aplicados devem apresentam uma fluorescência com elevados rendimentos quânticos, os desvios grandes Stokes "e, mais importante ainda, elevados photostabilities para permitir a longo prazo in vivo de imagens. E em segundo lugar, devem mostrar uma leitura de fluorescência fiável. Convencional cromóforo-quencher-sistemas são baseados na leitura de uma única cor de fluorescência por mudanças simples em intensidades de fluorescência. ⁴ Esta abordagem assume o risco de resultados falsos positivos ou falsos negativos devido a autofluorescência de componentes intracelulares ou baixos rácios de sinal-ruído devido à têmpera indesejada por outro cOMcomponentes. ⁴

Recentemente, relatou-se no conceito de "semáforos de ADN" que mostram leituras de cor de fluorescência dupla usando dois cromóforos diferentes. ^5-6 O conceito baseia-se na transferência de energia (ET) a partir do corante dador do corante aceitador à qual muda a fluorescência cor (ver Figura 1). Isto permite uma leitura mais fiável e, assim, fornece uma ferramenta poderosa para sondas de imagem fluorescentes. Rotulagem dos oligonucleótidos com corantes fluorescentes pode ser conseguida por duas abordagens diferentes. Os corantes podem ser incorporados durante a síntese química de ADN sobre uma fase sólida, utilizando blocos de construção de fosforamidite correspondentemente modificados. ⁷ Este método é limitado aos corantes que sejam estáveis ​​sob as condições de desprotecção e de fosforamidite padrão. Como alternativa, as metodologias de modificação pós-sintética foram estabelecidas na química de oligonucleótidos. Aqui, nós demonstramos a síntese de um dos nossos novos fotosenergia tabela de pares de transferência de ^8,9 e a rotulagem de pós-sintética de DNA usando catalisada por cobre 1,3-cicloadição entre azidas e alcinos (CuAAC). ¹⁰

Protocolo

Cuidado: Por favor, consulte todas as folhas de dados de segurança pertinentes (MSDS) antes do uso. Muitos dos produtos químicos usados ​​nestas sínteses são tóxicos e cancerígenos. Por favor, use todas as práticas de segurança apropriadas que são normalmente exigidos em laboratórios de química orgânica, tais como vestindo uma bata de laboratório, óculos de segurança e luvas.

1. Sintese dos corantes

Nota: ambos os corantes podem ser sintetizados pelos mesmos tipos de reacção Figura 2 mostra uma visão geral destas reacções..

1. Síntese de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io iodeto (corante 1)
   1. Síntese de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metil-piridin-1-io (Figura 2A, o passo a)
      1. Dissolve-se 466 mg de 4-picolina e 5,91 g de 1,3-diiodopropane em 10 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace e selar hermeticamente por uma tampa de septo.
      2. Aquece-se a 85 ° C durante 16 horas.
      3. Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
      4. Adicionar 20 ml de acetato de etilo ao óleo residual e tratar a mistura num banho de ultra-sons W 120 durante 3 min.
      5. Recolhe-se o precipitado formado por filtração e lava-se cinco vezes com acetato de etilo. Seca-se o produto sólido sob vácuo O / N.
   2. Síntese de 1- (3-azidopropil) -4-metilpiridin-1-io (Figura 2A, passo b)
      1. Dissolve-se 900 mg de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metil-piridin-1-io em 12 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace, adicionar 376 mg de azida de sódio, e selar hermeticamente por uma tampa de septo.
      2. Aquece-se a 85 ° C durante 16 horas.
      3. Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
      4. Adicionar 15 ml de diclorometano ao resíduo.
      5. Filtrar e descartar o precipitado resultante.
      6. Remover o solvente sob pressão reduzida utilizando uma podridãoAry evaporador para se obter o produto como um óleo castanho.
   3. Síntese de 1-metil-1H-indol-3-carbaldeído (Figura 2A, passo c)
      1. Sob gás inerte (árgon), dissolve-se 1,45 g de indol-3-carbaldeído, carbonato de potássio 1,52 g e 2,70 g de carbonato de dimetilo em 10 ml de dimetilformamida absoluta em um frasco de 50 ml equipado com um condensador de refluxo de fundo redondo.
      2. Agita-se a mistura a 130 ° C durante 19 h.
      3. Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida verter a mistura em gelo.
      4. Extrair a camada aquosa três vezes com 150 ml de acetato de etilo.
      5. Combinar as camadas orgânicas, lavá-las com água, secam-se com sulfato de sódio e eliminar o solvente a 50 ° C sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
   4. Acoplamento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-1H-indol-3-il) vinil) piridin-1-io iodeto (corante 1) (Figura 2A, Passo d)
      1. Trabalhar sob árgon e sob exclusão de humidade. Dissolve 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metil-piridin-1-io e 48 mg de 1-metil-1H-indol-3-carbaldeído em 4 ml de etanol em um balão de 20 ml equipado com um condensador de refluxo de fundo redondo.
      2. Adicionar 0,07 ml de piperidina e aquecer a 80 ° C durante 4 h.
      3. Deixa-se arrefecer para a TA.
      4. Recolhe-se o precipitado resultante por filtração e lava-se três vezes com éter dietílico.
      5. Adicionar éter dietílico para recolher o sobrenadante e o precipitado resultante por filtração. Lavar três vezes com éter dietílico.
      6. Combinar os precipitados.
2. Síntese de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-fenil-1H-indol-3-il) vinil) iodeto quinolin-1-io (corante 2)
   1. Síntese de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, passo a)
      1. Dissolve-se 715 mg de 4-metilquinolina e 5,91 g de 1,3-diiodopropane em 10 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace e selar hermeticamente por uma tampa de septo.
      2. Calora 85 ° C durante 16 horas.
      3. Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
      4. Adicionar 20 ml de acetato de etilo ao óleo remanescente e tratar a mistura num banho de ultra-sons W 120 durante 3 min.
      5. Recolhe-se o precipitado formado por filtração e lava-se cinco vezes com acetato de etilo. Seca-se o produto sólido sob vácuo O / N.
   2. Síntese de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io (Figura 2B, passo b)
      1. Dissolve-se 900 mg de 1- (3-iodopropil) iodeto -4-metilquinolin-1-io em 12 ml de acetonitrilo em um frasco de 20 ml de headspace, adicionar 333 mg de azida de sódio, e selar hermeticamente por uma tampa de septo.
      2. Aquece-se a 85 ° C durante 16 horas.
      3. Deixa-se arrefecer para a TA, depois remover o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
      4. Adicionar 15 ml de diclorometano ao resíduo.
      5. Filtrar e descartar o precipitado resultante.
      6. Remover o solvente under pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo para se obter o produto na forma de óleo castanho.
   3. Síntese de 1-metil-2-fenil-1H-indole-3-carbaldeído (Figura 2B, passo c)
      1. Sob gás inerte (árgon), dissolve-se 1,45 g de 2-fenil-1H-indole-3-carbaldeído, carbonato de potássio 0,996 g e 1,77 g de carbonato de dimetilo em 10 ml de dimetilformamida absoluta em um frasco de 50 ml equipado com um condensador de refluxo de fundo redondo.
      2. Agita-se a mistura a 130 ° C durante 19 h.
      3. Deixa-se arrefecer até à temperatura ambiente, em seguida verter a mistura em gelo.
      4. Extrair a camada aquosa três vezes com 150 ml de acetato de etilo.
      5. Combinar as camadas orgânicas, lavá-las com água, secam-se com sulfato de sódio e eliminar o solvente sob pressão reduzida utilizando um evaporador rotativo.
   4. Acoplamento de 1- (3-azidopropil) -4- (2- (1-metil-2-Phe nil-1H-indol-3-il) vinil) iodeto quinolin-1-io (Figura 2B, passo d)
      1. Obra sob argsobre e sob exclusão de humidade. Dissolve-se 90 mg de 1- (3-azidopropil) -4-metilquinolin-1-io e 59,7 mg de 1-metil-2-fenil-1H-indole-3-carbaldeído em 4 ml de etanol em um balão de 20 ml de fundo redondo equipado com condensador de refluxo.
      2. Adicionar 0,06 ml de piperidina e aquecer a 80 ° C durante 4 h.
      3. Deixa-se arrefecer para a TA.
      4. Recolhe-se o precipitado resultante por filtração e lava-se com éter dietílico três vezes.
      5. Adicionar éter dietílico para recolher o sobrenadante e o precipitado resultante por filtração. Lavar três vezes com éter dietílico.
      6. Combinar os precipitados.

2. Síntese de cadeias de ADN

Nota: A síntese das cadeias de ADN é realizada utilizando o método de fosforamidite em fase sólida, como descrito por M. Caruthers ¹¹ em um sintetizador de ADN. O funcionamento do sintetizador é testado antes do processo de síntese, e os reagentes são renovados senecessário.

1. Prearrangements
   1. Dissolve-se o disponível comercialmente 2'-O-propargil-deoxyuridinephosphoramidite (CU) em 1,2 ml de diluente amidite (acetonitrilo extra-seco). Mova solução no frasco para um frasco de sintetizador e parafuso no sintetizador.
   2. Executar um "teste de vazamento" (de acordo com as instruções do fabricante) para se certificar de que não existe nenhuma fuga de gás argônio. Se o "teste de vazamento" falhar, parafuso no frasco com mais força.
   3. Primeiro a solução de Cu através do enchimento do tubo que liga a câmara de síntese em fase sólida.
   4. Lave todas as linhas com acetonitrilo.
2. Síntese de cadeias de ADN
   1. Usar o computador conectado para entrar no método sequência de ADN e de acoplamento, seguindo as instruções do protocolo do fabricante. O passo de acoplamento do bloco de construção Cu leva 168 segundos com 7 pulsos (cada impulso são 16 ul) em comparação com 40 segundos com 7 pulsos para um convencionalfosforamidite como blocos de construção.
   2. Montar a coluna contendo o CPG (vidro de poro controlado) como fase sólida que é modificado com um umol de a primeira base (síntese de ADN é realizada a partir de 3 'para 5') para o sintetizador.
   3. Iniciar a síntese no sintetizador de ADN ^11.
3. A manipulação de cadeias de ADN sintetizados
   1. Secam-se as colunas com as cadeias de ADN sintetizada sob vácuo O / N.
   2. Utilize uma pinça para abrir a coluna e solte o CPG para um frasco de reacção. Adicionar 700 ul de solução de amónia aquosa concentrada para desproteger o oligonucleótido e libertar a cadeia de ADN a partir do CPG.
   3. Fechar o recipiente e aplicar uma tampa de segurança para o recipiente de reacção para evitar a sua ruptura e de calor a 50 ° C durante 18 h.
   4. Remover a amónia por centrifugação sob pressão reduzida (100 mbar) a 30 ° C durante 30 min.
   5. Iniciar filtração a partir de CPG: navio Centrifugar a 11.000 xg foR 3 min. Aqui sobrenadante e transferi-la para um dispositivo de centrifugação com um tamanho de poro de 0,45 um. Centrifugar a 1.000 g durante 4 min.
   6. Enquanto isso, adicionar 300 uL de água duplamente destilada para a CPG, de vórtice durante 20 segundos e centrifugar a 11000 xg durante 3 min. Transferir o sobrenadante para o dispositivo de centrifugação e centrifugar a 1000 x g durante 4 min. Repita este procedimento de lavagem duas vezes.
   7. Remover a água das soluções aquosas combinadas por centrifugação a 0,1 mbar e 25 ° CO / N.

3. Procedimento "Clicando"

1. Adicionar 50 uL de água duplamente destilada, 25 jil de uma solução de ascorbato de sódio (0,4 M em água), 34 ul de tris - [(1-benzil-1H-1,2,3-triazol-4-il) metil] amina (0,1 H em DMSO / tBuOH 3: 1), 114 ul de azida (0,01 M em DMSO / tBuOH 3: 1) e 17 ul de uma tetraquis () cobre (I), solução de hexafluorofosfato de acetonitrilo (0,1 M em DMSO / tBuOH 3: 1) para a amostra de ADN modificado com alcino liofilizada.
2. Incubar a amostra a 60 ° C durante 1,5 h.
3. Arrefecer attemperatura ambiente.
4. Adicionar 150 ul de _Na2EDTA (0,05 M em água) e 450 ul de acetato de sódio (0,3 M em água) à amostra de ADN e transferência para um tubo de 10 ml.
5. Adicionar 10 ml de etanol (100%) e manter a -32 ° C durante 16 horas.
6. embarcação Centrifugar durante 15 min a 1000 x g e remover o sobrenadante.
7. Lavar ADN-pelete com 2 ml de etanol frio (80%).
8. sedimento seco sob pressão reduzida.

Purificação 4. HPLC

Nota: Antes de separar as fitas de DNA se certificar de que o HPLC está funcionando corretamente, solvente suficiente disponível ea coluna está limpo. Lavar a coluna com tampão de concentração a partir de / acetonitrilo.

1. Dissolve-se o ADN-pelete em bruto em 250 uL de água duplamente destilada e transferir para um frasco de HPLC.
2. Iniciar Executar HPLC de 45 min com um gradiente de 0% de acetonitrilo até 15% de acetonitrilo durante um corante e um gradi ent de 0% de acetonitrilo a 17% de acetonitrilo para a tintura 2. Monitorar o funcionamento, verificando 260 nm (absorção DNA) e 459 nm (corante 1) ou 542 nm (corante 2). Recolhe-se as fracções que mostram absorção em ambos os canais de comprimento de onda.
3. Verificar as fracções recolhidas para a direita por massa assistida por matriz de ionização de dessorção por laser (MALDI) A espectrometria de massa utilizando uma matriz que consiste em 3-hidroxipicolínico ácido (3HPA) e diammoniumhydrogencitrate.
   1. Preparar a matriz através da mistura de 900 ul de uma solução saturada de 3-HPA em 1: 1-mistura de acetonitrilo e água com 100 ul de uma solução diammoniumhydrogencitrate (100 g / L) em água.
   2. Pipetar 1-2 ul da sonda de DNA no alvo e deixe secar ao ar.
   3. Adicionar 0,2 mL da matriz de 3-HPA / diammoniumhydrogencitrate à amostra e misturar até que cristaliza.
   4. Execute espectrometria de massa MALDI.
   5. Combinar as fracções de HPLC que exibem a massa direita.

_title "> 5. Determinação da Concentração

Nota: A concentração é determinada através da medição da absorção a 260 nm usando um UV / Vis, com base nos coeficientes de extinção (ε ₂₆₀₎ das bases de ADN e o corante.

1. Dissolve-se o ADN em 100 - 200 ul de água duplamente destilada.
2. Aplicar 1 ul da solução de ADN no UV / VIS.
3. Medir a absorção a 260 nm. Repita três vezes.
4. Tomar o valor médio para o cálculo da concentração da solução. Para o cálculo dos coeficientes de extinção, utilizar ε _260nm das quatro bases naturais ¹² e a _{260 nm} ε do Cu bloco de construção comprado (considerado como uridina natural) ¹² para se obter a _{260 nm} ε de toda a cadeia de ADN. Para corante 1, o uso ε _{260 nm} = 10.200 L * mol ^-1 * cm ^-1 e para a tintura 2, o uso ε _{260 nm} = 13.100 L * mol ^{-1 * cm -1. Calcula-se a concentração da solução seguinte lei de Lambert-Beers com base nos coeficientes de extinção e absorvências medidas. 13}

6. Preparação de amostras e espectroscopia

1. Preparação de amostras de cadeia simples
   1. Preparar separadamente um ml de soluções 2,5 mM de cada um dos DNA1 modificado e DNA2 em NaCl 200 mM, NaP 50 mM de _i, pH = 7.
2. Preparação de amostras de cadeia dupla
   1. Prepare 1 ml de uma solução contendo 2,5 | iM de DNA1 e 2,5 uM de DNA2 em NaCl 200 mM, NaP 50 mM de _i, pH = 7 num vaso de reacção.
   2. Fixar a tampa com uma tampa de segurança e de calor a 90 ° C durante 10 min. Em seguida, desligue aquecimento e deixar arrefecer até à RT O / N.
3. espectroscopia de absorção
   Nota: Para determinar o comprimento de onda de excitação para a especificação de fluorescênciaOs espectros de absorção troscopy são registados.
   1. Medições de fita simples
      1. Grave uma medição em branco contendo apenas 200 mM de NaCl, NaP 50 mM _i tampão, pH = 7.
      2. Transferir a solução preparada de DNA1 numa cuvete de 1 cm de vidro de quartzo e registar a absorção. Corrigir a medida contra os dados em branco. Determinar o valor máximo da absorção do corante.
      3. Repita o procedimento para DNA2.
4. espectroscopia de fluorescência
   1. Medições de fita simples
      1. Grave uma medição em branco contendo NaCl a 200 mM, NaP 50 mM _i tampão, pH = 7; usando o comprimento de onda de excitação do corante 1.
      2. Transferir a solução DNA1 numa cuvete de 1 cm de vidro de quartzo.
      3. Grave o espectro de fluorescência.
   2. Medição de fita dupla
      1. Transferir a solução de cadeia dupla numa cuvete de vidro de quartzo.
      2. Grave o espectro de fluorescência usando o comprimento de onda de excitação do corante 1.
5. experiências de visualização
   Cuidado: protecção ocular adequada deve ser usado para evitar danos UV para os olhos!
   1. Para obter uma melhor compreensão do que os espectros registados estão mostrando, irradiam-se as tinas com lâmpadas UV portátil (Figura 5). Observe a mudança de cor de fluorescência a partir do individual para o DNA de cadeia dupla.

Resultados

Absorção e espectros de fluorescência do ADN de cadeia dupla e são registados como mostrado na Figura 4.

O espectro de absorção gravado (Figura 4 à direita) mostra a absorção maxima λ _max a 465 nm para DNA1 de cadeia simples (dye 1) e 546 nm para DNA2 de cadeia simples (corante 2). O DNA1_2 recozido (corante corante 1 & 2) apresenta máximos a 469 nm e ambos 567 nm. Ambos máximos...

Discussão

Este protocolo mostra o procedimento completo para rotular DNA pós-sinteticamente através CuAAC por corantes fluorescentes modificados-azida. Isto inclui a síntese dos corantes e o ADN modificado com alcino, bem como o procedimento de marcação.

A síntese dos corantes seguintes quatro passos. Todos os produtos podem ser obtidos por uma precipitação em vez simples, devido à sua carga positiva e sem cromatografia em coluna demorado é necessária. A introdução das funcionalidades azida antes dos ...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
synthesis
4-Picoline	Sigma Aldrich	239615
1,3-Diiodopropano	Sigma Aldrich	238414
Acetonitrila	Fisher Scientific	10660131	HPLC grau
acetato de etila	Fisher Scientific	10456870	grau técnico
azida	de sódioSigma Aldrich	71290	p.a. grau
Diclorometano	Fisher Científico	10626642	grau técnico
Indole-3-carboxaldeído; 98%	ABCR	AB112969
carbonato de potássio, 99 + %	Acros	424081000
dimetilcarbonato	Sigma Aldrich	517127
N, N< / em>-Dimetilformamida, 99,8%, Extra Seco sobre Peneira Molecular	Acros	348435000
Sulfato de Sódio	Bernd Kraft	12623,46
Etanol, 99,5%	Acros	397690010
Piperidina, 99%	Acros	147181000
Diethylether	Fisher Scientific	10407830	grau técnico
2-Fenilindol-3-carboxaldeído; 97%	ABCR	AB125050
4-Metilquinolina	ABCR	AB117222
DNA synthesis
Expedite 8909 Nucleic Acid Synthesizer	Applied Biosystems	-
DMT-dA(bz) Phosphoramidite	Sigma Aldrich	A111081
DMT-dT Phosphoramidite	Sigma Aldrich
DMT-dG (dmf) Fosforamidita	Sigma Aldrich	G11508
DMT-dC (bz) Fosforamidita	Sigma Aldrich	C11108
Diluente de Amidita para síntese de DNA	Sigma Aldrich	L010010
Acetonitrila ultrapura para síntese de DNA	Sigma Aldrich	L010400
Cap A	Sigma Aldrich	L840000
Cap B	Sigma Aldrich	L850000
CPG dT Coluna 1.0  µ reagentes	mole Proligo	T461010
CPG dA(bz) Coluna 1.0  µ reagentes	mole Proligo	A461010
CPG dG(ib) Coluna 1.0  µ Reagentes	Mole Proligo	G461010
CPG dC(bz) Coluna 1.0  µ reagentes mole	Proligo	C461010
amônia (solução aquosa)			Fluka Analytical
nanosep 0.45  µ m	Pall	ODGHPC34
5- (Benziltio) -1H-tetrazol (Ativador)	Sigma Aldrich	75666
2'-O-propargyl desoxiuridinafosforamidite	Chem Genes	ANP-7754
workup
vacuum concentrador	Christ
click
Tetrakis (acetonitrila) cobre (I) hexafluorofosfato	Sigma Aldrich	346276
acetato de sódio	Sigma Aldrich	S2889
(+) -Sodium L-ascorbato	Sigma Aldrich	A7631
EDTA sal dissódico	Sigma Aldrich	E5134
TBTA-ligante	-	-	sintetizado de acordo com um procedimento da literatura1
HPLC
HPLC-system	Shimadzu
MALDI-Biflex-IV espectrômetro	Bruker Daltonics
LC-318 C18 coluna	Supelcosil via Sigma Aldrich	58368
determinação da concentração
ND 1000 Espectrofotômetro	nanodrop
preparação e espectroscopia de amostras
Cary 100 Bio	Varian
Fluoromax-3 fluorímetro	Jobin-Yvon
1 R. Chan Timothy, R. Hilgraf, K. B. Sharpless, V. Fokin Valery, Org Lett 2004, 6, 2853-2855.