Pré-clínica Ortotópico Modelo murino de cancro da próstata humano

Resumo

O câncer de próstata é a segunda causa mais comum de mortes relacionadas ao câncer nos Estados Unidos. Um modelo de câncer ortotópico fornece uma abordagem útil para entender a biologia do câncer de próstata e avaliar a eficácia dos regimes terapêuticos. Este protocolo descreve as etapas detalhadas necessárias para estabelecer um modelo ortotópico de camundongo com câncer de próstata.

Resumo

Para estudar a biologia multifacetada do câncer de próstata, os modelos pré-clínicos in vivo oferecem uma gama de opções para descobrir informações biológicas críticas sobre esta doença. O modelo de camundongo xenoenxerto de câncer de próstata ortotópico humano fornece uma abordagem alternativa útil para entender as interações específicas entre células tumorais geneticamente e molecularmente alteradas, seu microambiente de órgãos e para avaliação da eficácia de regimes terapêuticos. Este é um modelo bem caracterizado, projetado para estudar os eventos moleculares do desenvolvimento do tumor primário e recapitula os eventos iniciais na cascata metastática antes da embolia e entrada de células tumorais na circulação. Assim, permite a elucidação dos mecanismos moleculares subjacentes à fase inicial da doença metastática. Além disso, este modelo pode anotar alvos de medicamentos de relevância clínica e é uma ferramenta valiosa para estudar a progressão do câncer de próstata. Neste manuscrito, descrevemos um procedimento detalhado para estabelecer um modelo de camundongo xenoenxerto de câncer de próstata ortotópico humano.

Introdução

O câncer de próstata é a segunda causa mais comum de morte por câncer (9%) entre os homens nos Estados Unidos, ao lado de câncer de pulmão e brônquios (28%) ^1. De acordo com dados recentes, estima-se que 220 ​​de 800 casos de cancro da próstata diagnosticados recentemente e 27 540 mortes ocorrerá em 2015 ^um. A taxa de sobrevivência relativa de cinco anos de cancro da próstata fase inicial é> 99%, enquanto que de doença metastática avançada é apenas 28% ^1. Um grande desafio para o tratamento de doença metastática avançada é a falta de compreensão dos mecanismos moleculares subjacentes a propensão da doença de metástase para outros órgãos, particularmente para o osso, que é um local frequente de cancro da próstata. Assim, há uma clara necessidade para o estudo da composição molecular destes tumores da próstata, a fim de desenvolver regimes terapêuticos eficazes contra a progressão para doença metastática avançada ^2,3.

Próstata tumores exibem high heterogeneidade biológica sem um caminho bem definido para progressão. Metástases ocorrem frequentemente sem indicação prévia da capacidade de invasão do tumor ^4. Esta heterogeneidade clínica é atribuída à diversidade molecular de cancro da próstata. Compreender a composição molecular destes tumores letais é a chave para criar estratégias de melhor diagnóstico e terapêuticas para esta doença. Consequentemente, cancro da próstata investigação está focada na compreensão e prevenção de metástases.

Pré-clínicos in vivo mouse modelos oferecem uma variedade de opções para compreender os mecanismos moleculares da progressão do câncer de próstata para doença metastática avançada. Além disso, estes modelos são importantes para a avaliação pré-clínica de novas estratégias terapêuticas contra esta doença. Os modelos animais mais comumente usados ​​incluem modelos de camundongos transgênicos, injeção na veia da cauda, ​​implantação intra-cardíaca e mouse modelos ortotópicos humanos. estudos transgênicos são consumi tempong e correlação de desenvolvimento de câncer de próstata em ratos com a dos seres humanos têm demonstrado variabilidade ^11. Em modelos de ratinhos metastáticos espontâneas, as células são injectadas directamente na circulação e no entanto, eles têm tempo de resposta rápido, que não pode ser utilizado para estudar o tumor primário ou os passos iniciais da cascata metastática ^5. modelos de xenotransplante ortotópicos têm a limitação de desenvolver lesões metastáticas ósseas, o local comum de metástase de câncer de próstata. No entanto, o modelo de ratinho humano ortotópico de cancro de próstata de xenoenxerto é bem caracterizado, e amplamente utilizado para estudar os acontecimentos moleculares do desenvolvimento do tumor primário, a diafonia entre o tumor e microambiente órgão, a fase inicial da doença metastática e uso de drogas experimentais para a intervenção terapêutica ^{6 , 7,8-11.}

Protocolo

Protocolos para todos os procedimentos envolvendo animais devem ser revistos e aprovados por um Comitê Institucional de Animal Care and Use (IACUC). Siga os procedimentos oficialmente aprovados para o cuidado e uso de animais de laboratório. injecção intra-prostática requer cirurgia open-abdominal e os animais devem ser mantidos em um ambiente livre de patógenos com uma sala de cirurgia designado onde as técnicas assépticas cirúrgicos apropriados são usados ​​durante todo o procedimento.

1. Preparação de células para implantação

NOTA: Com base na necessidade de investigação, qualquer linha celular de cancro da próstata pode ser usado. As linhas celulares são cultivadas de acordo com as instruções do fornecedor.

1. Para a linha de células PC3M-Luc-C6 que expressa estavelmente o gene de luciferase de pirilampo, células de cultura em Meio Essencial Mínimo (MEM) suplementado com 10% de Soro Fetal Bovino (FBS), aminoácidos 1x não essenciais, 1 x fleomicina D1 e 1 mM de piruvato de sódio . Manter as células numa incubadora Wom uma atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de _CO2 a 37 ° C. células PC3M-Luc-C6 foram adquiridos a partir de instalação de núcleo de UCSF.
2. Células colheita por tripsinização. Lavar as placas de cultura de uma vez com solução salina tamponada com fosfato (PBS). Adicionar 2 ml de tripsina a 0,05% a um prato de 10 cm e incuba-se durante 3-5 minutos numa incubadora com uma atmosfera humidificada de 95% de ar e 5% de _CO2 a 37 ° C até as células são separadas.
   1. Para evitar aglomeração, não agitar as células batendo ou sacudindo o prato enquanto espera para que as células desanexar. Recolher as células em 5 ml de meio completo e girar durante 5 minutos a 200 x g. Lava-se a pelete de células com PBS para remover a tripsina.
3. Enumerar células vivas por ensaio de exclusão de azul de tripano. Misturar 10 ul da suspensão de células em PBS com 10 ul de 0,4% (p / v) de solução de azul de tripano. Coloque a mistura em um hemocitômetro ou câmara de contagem slide e contagem de células imediatamente sob um microscópio ou ler o slide câmara em um cou celularnter.
   1. Prepara-se uma suspensão de células contendo 2,5 x 10 ⁵ células em 10 ul meios. Misture a suspensão de células com extrato de matriz extracelular 10 ul membrana basal-like e colocar as células em gelo. Adicionar luciferina à suspensão de células (1: 200 ul; estoque de 30 mg / ml de concentração) antes da injecção em ratinhos.
      NOTA: Isto permite imediato bio-imagem dos animais para verificar a consistência das injeções de células entre os diferentes grupos experimentais. Injectar células tão rapidamente quanto possível, de preferência dentro de 30 min após tripsinização uma vez que a viabilidade celular diminui rapidamente depois da separação.

2. Preparação da área cirúrgica

1. Realizar a cirurgia em uma área organizada, desinfectados que promove a assepsia.
2. Higienizar do banco contador / laboratório com uma solução de água sanitária antes da cirurgia.
   NOTA: O uso de álcool é desencorajado devido ao tempo de contacto prolongado necessário para entrar em vigor (15 min).
3. Use campos estéreis,limpar almofadas absorvíveis ou toalhas, e substituir esses materiais após cada sessão cirúrgica. Esterilizar todos os instrumentos antes de usar. Os métodos preferidos são um autoclave a vapor, esterilizador esferas de vidro, o gás de óxido de etileno, ou esterilização de vapor de peróxido de hidrogénio.
4. Use um microscópio de dissecação assepticamente limpa para realizar o procedimento cirúrgico ou investigadores experientes pode executar sem um microscópio.

3. O implante de células tumorais

1. Use masculina 6-8 semanas de idade imunocomprometidos Balb / c ou NOD / SCID.
   NOTA: É mais difícil de operar em pequenos animais e animais maiores tendem a ter uma cinética mais lenta do crescimento tumoral e metástases.
2. Injectar pré-cirurgia medicação para a dor de acordo com instruções da instalação animal. Por exemplo, pode ser utilizado Buprenorfina intra-peritoneal, numa dose de 0,1 mg / kg de peso corporal.
3. Anestesiar os animais, colocando-os em uma câmara de isoflurano com 1-3% de isoflurano em oxigênio e wa-lo até os animais são anestesiados completamente. Certifique-se de que não há reflexo do dedo do pé de tónus muscular nesse ponto. Use veterinário adequado lubrificante pomada oftálmica para prevenir a cegueira devido à xeroftalmia durante a anestesia geral.
   NOTA: Anestesiar os animais pelo método do investigador por exemplo preferido, por pentobarbital de sódio, 0,05 mg por grama de peso corporal é administrado intra-peritoneal ou uma solução de ketamina / xilazina (concentração: 17,16 mg / ml) numa dose de 65 mg / kg de peso corporal é usado por via subcutânea. inalação de isoflurano é um método preferido de anestesia. A pomada deve ser cuidadosamente aplicado sem esfregar contra a córnea.
4. Remover o animal a partir da câmara de isoflurano e colocar em um aparelho de cone de nariz com o fluxo contínuo de 1-2% de isoflurano em oxigénio para assegurar que o animal está sob anestesia completa antes de prosseguir.
   1. Remover pêlos de ratos pelo barbear ou usar um creme de cabelo remoção antes de iniciar o procedimento.
      NOTA: Seria preferível colocar o mouse sobre uma almofada de aquecimento estéril durante a cirurgia.
5. Coloque o mouse na posição supina. Limpar o abdómen inferior com 10% w / w solução de povidona-iodo seguido por 70% de etanol esfregaços.
6. Com um par de fórceps finos, levantar uma área de pele de 2 mm acima da glândula prepucial, cerca de 1-2 cm acima da bainha do pénis, e cerca de 2-3 cm abaixo da parte inferior da caixa torácica.
7. Adicione uma incisão mediana um centímetro de comprimento, em primeiro lugar através da pele com um bisturi e depois através da camada de músculo com uma tesoura (Figura 1).
8. Localizar a bexiga na cavidade do corpo. É um órgão esférico castanho amarelo-claro, localizado directamente sob a incisão (Figura 1).
9. Com um par de aperto de pinça fina da bexiga e, em seguida, para baixo para cima levantar para fora da cavidade do corpo para a bainha do pénis. Isto exporá os dois vesículas seminais que são um par de órgãos saclike branco e claramente distinta.
10. Com umcotonete em cada mão, externalizar as vesículas seminais, um por um, e trazê-los para fora da cavidade do corpo e colocá-los face para baixo sobre a superfície exterior do abdómen com a bexiga no meio (Figura 2).
11. Usando os cotonetes, inclina suavemente para trás as vesículas seminais no ponto de inserção perto do colo da bexiga, para o invólucro do pénis, de modo que os dois lóbulos da próstata dorsal são claramente visíveis. Use cotonetes de algodão molhado, para evitar danos nos tecidos (Figura 3).
12. Agita-se a suspensão de células com uma micropipeta antes do carregamento na seringa.
13. Ao colocar as vesículas seminais em posição com um cotonete de algodão, inserir a agulha da seringa no lóbulo dorsal da próstata sob o microscópio (Figura 4). Lentamente injectar 20 jil de suspensão de células até uma formação de bolhas é identificado. A bula abaulamento indica que a injeção está correto.
14. Enquanto retraindo a agulha, pressione levemente o local da injecção comum cotonete e espera por alguns segundos para evitar fugas.
15. Retire cuidadosamente as vesículas seminais com cotonetes e inseri-los de volta para a cavidade do corpo, um por um, seguido pela bexiga. Evite 'girando' os órgãos internos durante a realização deste procedimento.
16. Depois de colocar os órgãos de volta para dentro da cavidade do corpo, suturar a primeira camada muscular em um padrão interrompido com 4-0 suturas absorvíveis catgut crómico, seguido pelo fechamento da pele com 4-0 não absorvíveis de nylon de sutura cirúrgica. A pele também pode ser puxado em conjunto e fechada com grampos cirúrgicos para fechar a incisão completamente.
    NOTA: Os ratos têm um hábito de arranhar e morder a sua ferida, o que pode conduzir à reabertura da ferida, por conseguinte, utilizar cola de tecido, também é recomendado juntamente com suturas. animais imediatamente a imagem para assegurar que não é igual intensidade bioluminescente entre todos os grupos experimentais.
17. Devolver os animais para limpar gaiolas e mantê-los sob uma lâmpada de aquecimento ou caloring pad. Monitorar os animais constantemente até que eles se recuperar completamente da anestesia e manter decúbito esternal.

4. Acompanhamento dos Animais

1. Monitorizar os animais regularmente até ao final da experiência, de acordo com protocolos institucionais. Se estiver usando clipes metálicos cirúrgicos, retirar após uma a duas semanas. Duração do experimento depende da necessidade de investigações específicas.
   NOTA: Este experimento foi realizado durante 21 dias para examinar o estabelecimento bem sucedido das células cancerosas implantadas na próstata do rato.
2. Administrar medicação para a dor com base nas instruções da instalação animal. Por exemplo, buprenorfina intra-peritoneal, numa dose de 0,1 mg / kg de peso corporal pode ser utilizado no momento do procedimento com uma segunda dose após doses de 6 horas adicionais e a cada 8-12 horas, conforme necessário.
3. Monitorar o peso animal, consumo de alimentos, a cor da pele e textura, atividade e frequência de micção e defecação. Euthanize animais immediately se há uma perda significativa de peso corporal superior a 15%.
   1. Para a eutanásia, entregar CO ₂ a partir de um tanque pressurizado em uma gaiola un-lotada, com um caudal de deslocar 10-30% da câmara ou gaiola de volume / minuto, permitindo CO ₂ para entrar na câmara lentamente para que narcotização inconsciência e completa ocorrer antes da morte.
   2. Manter o fluxo de CO ₂ durante pelo menos um minuto após paragem respiratória e deixar os animais na câmara durante um tempo suficiente para que a morte ocorra imediatamente antes da realização de um método físico.
   3. Execute decapitação, deslocamento cervical ou qualquer outro IACUC aprovado método físico após a eutanásia de animais quimicamente.
      NOTA: Redução significativa de peso corporal, muitas vezes indica uma condição letárgico. animais portadores de tumor deve estar de boa saúde, excepto quanto à presença de tumores, até ao final da experiência. A eutanásia deve ser coerente com as Orientações AVMA sobre eutanásia e deve ser listed no protocolo IACUC aprovado.

5. Non-invasive Bio-imaging dos Animais

1. Monitorar os animais semanalmente usando uma técnica de imagem não-invasivo para monitorar a colonização das células cancerosas, o crescimento do tumor e qualquer metástases à distância.
   NOTA: modalidades de imagem, como GFP-imagem, a imagem latente de luciferase, raios-X ou tomografia computadorizada de micro 3D (UCT) etc, podem ser usadas com base na investigação específica precisa ^12-15.

Resultados

Após a implantação ortotópica de células PC3M-Luc-C6 no lóbulo posterior da próstata, os ratinhos foram semanal fotografada utilizando um sistema de imagem de bioluminescência animal vivo para monitorizar a colonização das células e o crescimento do tumor ao longo do decurso da experiência (Figura 5A - B). A quantificação do sinal bioluminescente indicaram que as células PC3M-Luc-C6 colonizado com sucesso os lóbulos da próstata. O aumento da bioluminescê...

Discussão

Este manuscrito descreve um procedimento detalhado para o estabelecimento de um modelo ortotópico humana rato xenoenxerto de cancro da próstata. Este modelo foi estabelecido por implantação directa da linha de células de cancro da próstata humano PC3M-Luc-C6 nos lóbulos da próstata dorsal de ratinhos imunocomprometidos. Os tumores foram deixados a desenvolver ao longo do curso do experimento. O crescimento do tumor foi monitorizado semanalmente por um sistema de imagem de bioluminescência não invasiva durante o experime...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Linha celular de câncer de próstata PC3	ATCC	CRL-1435
Meio Essencial Mínimo (MEM)	GIBCO,Life Technology	11095-080
PBS	GIBCO,Life Technology	10010-023
FBS	GIBCO,Life Technology	10437-028
Zeocin	Invitrogen,Life Technology	R250-01
Tripsina	GIBCO,Life Technology	25300-54
IVIS	Xenogen-Caliper
(300 µ l, 28,5 g)	Becton Dickinson	309300
Ratos	Charles River Laboratories, Inc
Cotonetes com álcool	MEDEquip Depot	326895 BD
PVP Iodo Prep Pad	MEDEquip Depot	C12400PDI
Surgical CatGut Chromic Suture	Demetech	CC224017F0P
Matrigel	Corning	354248

Seringas de Insulina