Artigo de método

Local Dirigido Labeling rotação e EPR espectroscópicos Estudos de Canais pentamérica Ligand-Gated Ion

10.1K vistas

⸱

DOI:

10.3791/54127

⸱

4 de julho de 2016

 ,  , 
1Department of Physiology and Biophysics, Case Western Reserve University, 2School of Medicine, Case Western Reserve University

Neste artigo

Resumo

Este artigo descreve métodos para marcação de spin dirigida ao local e reconstituição de canais controlados por ligantes pentaméricas para estudos de ressonância paramagnética eletrônica. Este protocolo pode ser adaptado para qualquer proteína de membrana. O método de reconstituição descrito aqui também pode ser usado para medições de patch clamp de correntes macroscópicas e de canal único em um sistema lipídico definido.

Resumo

O canal iônico é uma orquestração orientada por estímulos de movimentos de proteínas que leva a transições entre estados fechados, abertos e dessensibilizados. Fundamental para essas transições é a flexibilidade intrínseca da proteína, que é criticamente modulada pela composição lipídica da membrana. Para entender melhor a base estrutural da função do canal, é necessário estudar a dinâmica das proteínas em um ambiente de membrana fisiológica. A espectroscopia de Ressonância Paramagnética Eletrônica (EPR) é uma ferramenta importante para caracterizar transições conformacionais entre estados funcionais. Em comparação com a RMN e a cristalografia de raios-X, as informações obtidas da EPR são intrinsecamente de menor resolução. No entanto, ao contrário de outras técnicas, no EPR não há limite superior para o peso molecular da proteína, os requisitos da amostra são significativamente menores e, mais importante, a proteína não é restringida pelas forças da rede cristalina. Portanto, o EPR é exclusivamente adequado para estudar grandes complexos de proteínas e proteínas em sistemas reconstituídos. Neste artigo, discutiremos protocolos gerais para marcação de spin dirigida ao local e reconstituição da membrana usando um canal iônico controlado por ligante pentamérico dependente de prótons procariótico (pLGIC) de Gloeobacter violaceus (GLIC) como exemplo. Uma combinação de abordagens EPR de onda contínua (CW) e pulsada (ressonância eletrônica de elétron duplo-DEER) em estado estacionário será descrita para permitir uma caracterização quantitativa completa da dinâmica do canal.

Introdução

Durante a última década, a compreensão estrutural dos canais iónicos dependentes de ligando pentaméricos (pLGIC) tem crescido nos trancos e barrancos, devido a multidões de estruturas de alta resolução de vários membros da família. Principais fatores que levaram aos avanços atuais no campo incluem a descoberta de canais pLGIC procariotas, 1-3 grandes avanços na expressão de proteína de membrana eucariótica, 4-6 e avanços tremendos em abordagens de determinação de estrutura. 7 Estas estruturas proporcionam um consenso claro sobre a conservação geral da arquitectura tridimensional de pLGIC. No entanto, duas grandes áreas que parecem arrastar para trás são a caracterização funcional destas preparações de canal e a descrição mecanicista da função do canal.

Gating alterações conformacionais são complexos e ocorrem a uma distância de 60 Â ao longo do comprimento do canal e estas transições são extensivamente modulada pelalípidos de membrana. Em particular, lipidos negativos, colesterol e fosfolípidos foram mostrados para modular a função de pLGIC 8-11. Embora o papel preciso destes constituintes lipídicos na função do canal permanece desconhecida, uma compreensão completa molecular de gating exigiria estudar estes canais no seu ambiente nativo. Spin Dirigido local Labeling (SDSL) e ressonância paramagnética eletrônica (EPR) espectroscopia são as técnicas de escolha para o estudo da dinâmica de proteínas em sistemas reconstituídos. espectroscopia de EPR não é limitada pelo tamanho molecular (como é NMR) ou a propriedade óptica da amostra (como é a espectroscopia de fluorescência), e, assim, permite medições de construções de comprimento total reconstituído em condições nativas lipídicas. A técnica é extremamente sensível e tem requisitos relativamente baixos de amostra (no intervalo de pico-molar). Ambos estes aspectos tornar a técnica bem adequado para o estudo de proteínas de membrana grandes que são difíceis de expressar em mais miligramaquantidades.

A utilização de espectroscopia de EPR em combinação com marcação de spin dirigida ao local foi desenvolvido por Wayne Hubbell e colegas, e foi adaptado para o estudo de uma variedade de tipos de proteínas. 12-24 os dados de RPE foram utilizados para investigar estruturas secundárias, mudanças na proteína conformação, profundidades de inserção de membrana, e proteína-proteína / interacções proteína-ligando.

O método envolve a substituição de cisteína nas posições de interesse por mutagénese dirigida ao local. Para garantir a etiquetagem específica do local, é necessário substituir cisteínas nativas com outro aminoácido (por exemplo., Serina) para criar um modelo de cisteína-menos. De longe, o marcador de spin mais popular é um MTSL específico tiol-: (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) metanotiosulfonato que se liga à proteína através de uma ponte de ligação de dissulfureto. Devido à sua elevada especificidade, de tamanho relativamente pequeno (ligeiramente maior do que o triptofano), e flexidade da região de ligante, este marcador de spin tem sido mostrado ter uma excelente reactividade, mesmo com uma cisteína enterrado. Além disso, para maximizar a reactividade, a reacção de marcação da proteína é realizada sob a forma detergente solubilizado. Depois da separação do excesso de rotação livre do rótulo por meio de cromatografia de exclusão de tamanho, a proteína é reconstituído em lipossomas ou sistemas que mimetizam a bicamada lipídica de composição definida. Em geral, cisteína mutagênese é bem tolerada na maioria das partes da proteína, e o tamanho relativamente pequeno do spin-sonda provoca perturbação mínima para as estruturas secundárias e terciárias. Para assegurar que a modificação retido funções de tipo selvagem, os canais marcados e reconstituídas pode ser avaliado por medidas de patch-clamp.

A proteína marcada-funcional é então sujeita a medições espectroscópicas, que fornecem essencialmente três tipos principais de informação: 12,14,15,20,22,23,25-27 spin-sonda dinâmica por lineshanálise de macaco; acessibilidade da sonda para agentes de relaxamento paramagnético; e a distância de distribuição. 27 distâncias EPR são medidos por duas abordagens diferentes. A primeira baseia-se na técnica de onda contínua (CW), onde alargamento espectral resultantes de interacções dipolares entre spin-etiquetas (no 8 - gama de distâncias de 20 Â). É usada para determinar a distância 28,29 A segunda é uma pulsado-EPR método em que as medições de distância pode ser estendida até 70 Å. 30-34 em Duplo Electron Electron ressonância (DEER), oscilações na amplitude spin-echo são analisados ​​para determinar distâncias e distribuições de distância. Aqui o eco de spin é modulado na frequência da interação dipolar. Juntos, estes parâmetros são utilizados para determinar a topologia de proteína, elementos estruturais secundários, e as alterações da proteína-conformacional.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Protocolo

1. Site-Directed Mutagênese e Cys Mutações

  1. Clonagem e mutagénese
    NOTA: GLIC tipo selvagem (wt) 35 tem uma única cisteína nativo (C27), que é mutado para serina para criar um fundo cisteína-menos. Mutações de cisteína são introduzidos no fundo de cisteína-menos por mutagénese dirigida ao local, utilizando iniciadores que transportam um codão de cisteína na posição 36 desejada.
    1. Dissolvem-se 5 ul de tampão 10x reacção, 1 ul de 100 ng / mL de cisteína-menos GLIC molde de ADN 35, 0,5 ul de cada um de 40 uM para a frente e o iniciador inverso 36, 1 ul de dNTPs (100 mM), e 41 ul de água desionizada . Pipetar a amostra algumas vezes para misturá-lo completamente, rotação (6.000 rpm) e, finalmente, adicionar 1 ml da DNA polimerase.
    2. Definir o termo-cycler com o protocolo seguinte:
      1. Desnaturação a 95 ºC durante 4 min.
      2. Desnaturação a 95 ºC durante 30 segundos.
      3. recozering a 55 ºC durante 1 min.
      4. Alongamento a 68 ºC durante 10 minutos (cerca de 1 min por comprimento plasmídeo kb).
      5. Repita os passos 1.1.2.2 - 1.1.2.4 durante 18 ciclos.
      6. A alongamento final a 68 ºC durante 10 min.
      7. Segurando a temperatura a 4 ºC
        NOTA: temperatura de recozimento é calculado com base no iniciador de Tm.
    3. Adicionar 1 ml de Dpnl à mistura de reacção, misturar bem por pipetagem, e girar para baixo (6.000 rpm) durante 1 min. Incubar durante 2 horas a 37 ° C.
  2. Transformação
    1. Thaw E. As células competentes de E. coli em gelo. Aliquota de 30 uL de células para um tubo de 14 ml estéril transformação e adicionar 1 ul de ADN digerido para as células. Misture tocando no lado do tubo. Incubar durante 20 min em gelo.
    2. Colocar o tubo em banho-maria 42 ºC por 45 segundos e, em seguida, colocá-lo de volta no gelo por 2 min. Adicionar 400 mL de mídia SOC estéril e agitar as células em uma incubator a 37 ºC durante 1 hora.
    3. Placa de 100 ul de células em placas de LB contendo canamicina (50? M) e 1% de glucose. Incubar as placas O / N a 37 ºC.
    4. Colher uma única colónia da placa e inocular em 5 ml O / N culturas contendo meio LB / canamicina. Incubar a cultura D / N (~ 16 horas) a 37 ºC num agitador incubadora.
    5. Extrair DNA a partir da cultura O / N por minipreparação 37. Quantificar o rendimento de ADN utilizando um espectrofotómetro através da medição da absorvância a 260 nm de comprimento de onda. A concentração deve ser de ~ 100-200 ng / mL. Confirmar a presença da mutação por meio de estratégias de sequenciamento de DNA recombinante convencionais 38,39.

2. Expressão e Purificação GLIC

  1. Transformação
    1. Seguindo as etapas descritas na secção 1.2, transformar 30 ul de células competentes C43 com 1 pi (~ 100-200 ng / ul) do plasmídeo contendo o gene que codifica para a GLIC, juntamente com um local de clivagem de rinovírus humano (HRV) -3c protease (para a sequência de plasmideo e de gene, referem-se ao texto suplementar) 35 (a partir do passo 1.2.5).
    2. Placa de 100 ul de células em placas de LB-agar contendo 1% de glucose e 50 ug / ml de canamicina, e incubar-los S / N (~ 16 horas) a 37 ºC numa incubadora.
    3. Verifique visualmente para colônias e garantir que eles não estão sobre-crescido ou mostrar a presença de colónias por satélite. Prontamente selar as placas com parafilme e armazená-los a 4 ºC.
  2. Configurando O / N-culturas e Preparação de meio de crescimento
    1. Escolher uma única colónia isolada usando fio inoculando loop e transferir para um balão estéril de 100 ml contendo 20 ml de caldo de Luria (LB) suplementado com glucose meios estéreis 1% e 50 ug / ml de canamicina. Incubar los O / N (~ 16 horas) a 37 ºC num agitador a 250 rpm.
    2. Media autoclave de 900 ml Terrific Broth (TB) (Veja Mídia e composição do tampão) em 2,8frascos de vidro G Fernbach para a cultura bacteriana no ciclo de vapor a 121 ° C durante 20 min.
  3. A criação de grandes culturas de crescimento
    1. Adicione 100 ml de tampão fosfato de potássio estéril (Veja Mídia e composição do tampão) para a mídia TB autoclavado. Adicionar estéril de glucose (0,2% concentração final), canamicina (50 ug / ml), e 10 ml da cultura D / N. Incubar a 37 ° C num agitador a 250 rpm.
    2. Verifique a densidade óptica a 600 nm de comprimento de onda (OD600) usando um densitómetro ou espectrofotómetro a cada hora até atingir 0,5 (~ 2 h). Neste ponto, reduzir a velocidade para 150 rpm e abaixe a temperatura para 18 ºC. Monitorar a OD a 600 a cada 30 min até atingir 0,8 (~ 1 h).
    3. Adicionar 50 ml de glicerol e continuar agitando a cultura até que a DO600 atinge 1,0-1,2 (~ 15-30 min).
      NOTA: Sob estas condições, leva cerca de uma hora para a cultura para atingir 18 ºC de 37 ºC. É important que o glicerol é adicionado à cultura, após o arrefecimento para 18 ° C.
    4. Induzir as células com 200 mM IPTG (isopropil-tio-β-galactósido) e redefinir o agitador de volta para 250 rpm e incubar mais para ~ 16 horas a 18 ºC.
  4. Protein Purification
    1. Certifique-se de que o OD 600 no final de 16 horas é de ~ 16 - 18. colher as células em frascos de centrífuga de 1,0 L por centrifugação a 8500 xg, a 4,0 ° C durante 15 min. Decantar o sobrenadante e pesar o frasco com o sedimento celular. Calcule o peso da pelete, subtraindo o peso da garrafa vazia do peso total.
      NOTA: O peso da pelota celular esperado é ~ 30 - 35 g / L. No entanto, é de notar que pode haver variação na final DO600 e sedimento celular peso entre mutantes.
    2. Re-suspender o sedimento bacteriano em 150 ml de gelo-tampão A frio (NaCl 100 mM, Tris 20 mM, pH 7,4) por 1,0 L de cultura. Adicionar ADNase I (100 ug / ml) e proteasinibidores E (fluoreto de fenilmetilsulfonilo (1 mM), leupeptina (2,0 jig / ml), aprotinina (2,0 ng / ml) e pepstatina A (1 ug / ml)).
    3. Homogeneizar as células fazendo-as passar através de um disruptor de células numa sala fria 4,0 ºC. Repetir o processo de três vezes de modo a que a maior parte das bactérias são lisadas. Centrifugar as células a 14.000 xg durante 15 min e pipeta-se o sobrenadante para fora e transferir para um tubo de centrífuga limpo. Descartar o pellet, que contém células não-lisadas e corpos de inclusão.
    4. Centrifuga-se o sobrenadante a 168000 xg durante 1 h. Cuidadosamente decantar o sobrenadante sem perturbar o pelete de membrana.
    5. Reúnem-se os sedimento de membranas a partir de 1 L de cultura e re-suspender em tampão A (suplementado com 10% de glicerol) até um volume final de 50 ml. Adicionar 0,5 g de n-dodecilo-β-D-maltopiranósido (DDM) para a suspensão de membrana e nutar durante 2 horas a 4,0 ° C.
    6. Após solubilização da membrana, remover os detritos celulares a partir do lisado por centrifugção de 168.000 g durante 1 hora. Enquanto isso preparar a resina de amilose. Transferência de 3 ml de resina, utilizando uma pipeta para uma coluna de cromatografia de polipropileno vazio. Lava-se a resina fazendo passar 10 volumes de leito de água 3 vezes e, em seguida, com 10 volumes de leito de tampão A contendo 0,5 mM de DDM.
    7. Após centrifugação, o sobrenadante cuidadosamente levar a cabo utilizando uma pipeta e transferir para um tubo de 50 ml limpo. Para por lotes de ligação, adicione resina de amilose pré-equilibrada com o tubo cônico. Ligar a proteína extraída a resina de amilose por nutação a mistura durante 2 h a 4,0 ° C.
    8. Passar toda a suspensão através de uma coluna de cromatografia e recolher o fluxo de passagem. Em seguida, passe todo o fluxo através da resina recolhida durante um segundo tempo para maximizar a ligação.
    9. Passa 10 volumes do leito de tampão A com DDM 0,5 mM, 0,5 mM de tris (2-carboxietil) fosfina (TCEP) e 1 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA), para remover as proteínas não ligadas.
    10. Eluir a proteína GLIC com 10 ml de Buffer A contendo maltose 40 mM além DDM 0,5 mM e TCEP 0,05 mM. TCEP evita a oxidação das cadeias laterais de cisteína. Recolher todo o eluato.
    11. Concentra-se a proteína eluida usando concentrador centrífugo (Peso molecular cut-off = 50 kDa) a 4-6 mg / ml e adicionar protease de HRV-3C (200 ug por 10 mg de proteína) e incubar O / N a 4,0 ° C.
      NOTA: Verificar a conclusão da digestão protease, executando as amostras em gel de SDS PAGE (Veja o passo 2.5.5 e Figura 1).
  5. Dirigido local Spin-rotulagem
    1. Adicione cerca de 100 ul de estoque de 200 mM de (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) MTSL 40 em DMSO e armazenar o material a -20 ° C em alíquotas de 25 ul.
    2. Use a amostra digerida-protease para o spin-marcação com MTSL. Adicionar excesso de 10 vezes molar de marcador de spin-MTSL (GLIC monómero: MTSL na razão molar 01:10). Incubar em gelo durante 1 hr. Adicione um segundo tiro de marcador de spin em um excesso molar de 5 vezesproporção e incubar durante mais uma hora.
      NOTA: Para posições enterradas (com baixa eficiência de marcação de spin, descritos a seguir), a 30 vezes o excesso molar do marcador de spin é adicionada e a proteína é incubada durante 6 h.
    3. Fazer passar a amostra através de uma coluna de exclusão de tamanho rápido Protein Liquid Chromatography (FPLC), que é pré-equilibrada com Tampão A e DDM 0,5 mM para separar a MBP clivada e o excesso de livre rotação do rótulo de pentâmeros GLIC. Recolher fracções de 1 ml para um total de 30 ml de eluição. Reunir as fracções contendo pentâmeros GLIC (Figura 1). Siga as instruções do fabricante para executar o FPLC.
    4. Determinar a concentração da amostra, utilizando um espectrofotómetro através da medição da absorvância a 280 nm de comprimento de onda. Coeficiente de extinção molar e o peso molecular estimado de monómero GLIC são 49850 M-1 cm-1 e 36380 Da, respectivamente. Concentra-se a solução de proteína utilizando um concentrador centrífugo (MolecularLimiar de peso = 50 kDa) até uma concentração final de ~ 8-10 mg / ml e colocá-lo em gelo. A amostra está agora pronto para a reconstituição.
    5. Como uma verificação adicional de qualidade para assegurar que a preparação é homogénea bioquimicamente, executar um (β-ME a 1,0%) em gel de SDS-PAGE redutor.
      NOTA: O gel de Coomassie corados deve mostrar uma única banda a ~ 33 kDa correspondente ao monómero GLIC (Figura 1).
    6. Para os mutantes marcadas com rotação suspeitos de apresentar alargamento dipolar, sub-rotular as amostras na presença de etiqueta 41 diamagnético. Incubar a-proteína eluída com MTSL 0,1 vezes e incuba-se em gelo durante 1,0 h. Em seguida, adicionar um excesso molar de 20 vezes de etiqueta diamagnético (1-acetoxi-2,2,5,5-tetrametil-Δ3-pirrolina-3-metil) metano tiossulfonato.
      NOTA: O reagente utilizado aqui diamagnético é iso-estérica para o marcador paramagnético com uma química idêntica rotulagem.
    7. Incubar a amostra em gelo durante 2 hr. Passe a amostra através de um sizcoluna de cromatografia de exclusão e que é pré-equilibrada com Tampão A e DDM 0,5 mM como no Passo 2.5.3.
  6. Eficiência da rotulagem de spin
    1. eficiência de rotulagem da rotação é definido como a razão entre a concentração-marcador de spin para a concentração de cisteína da cadeia lateral (GLIC-monómero). Para determinar a eficiência de spin-etiquetagem da amostra, a intensidade integrada da amostra irá ser comparado com um padrão de concentração conhecida, utilizando uma curva de calibração. Adicione soluções de um padrão EPR (tais como 2,2,6,6-tetrametil-1-piperidinyloxyl: TEMPO) em uma gama de concentrações (10 - 250 um) por dissolução em água.
    2. Medir o sinal EPR de cada uma destas soluções e determinar a área sob a curva (dupla integração do sinal EPR) para cada concentração (como descrito nos Passos 6.1). Gerar uma curva de calibração representando graficamente a área medida como uma função da concentração de TEMPO e encaixe com uma linha recta.
      NOTA: O sãoum sob um sinal de EPR derivado é uma melhor descrição da intensidade espectral do que o pico de amplitude de pico. Integrando o primeiro derivado do sinal EPR dará ao espectro de absorção, uma segunda integração dará então a área sob o espectro de absorção (que é proporcional à concentração de rotação). Certifique-se de uma linha de base constante tanto no baixo campo e região de alto campo do espectro.
    3. Medir a concentração da proteína marcada por rotação no detergente utilizando um espectrofotómetro (como no passo 2.5.4). Agora medir o sinal EPR da amostra e, em seguida, determinar a área da dupla integral do sinal EPR seguindo os passos na secção 6.1. Ao utilizar a curva de calibração para determinar a concentração da etiqueta que corresponde ao sinal EPR medido. Calcula-se a eficiência de marcação de spin como a razão molar de marcador de spin e concentração de proteína.

3. GLIC Reconstituição em Asolectin Membranas

  1. Preparação de Lipossomas
    1. Lavar de 25 ml de fundo redondo limpo balão com 5 ml de clorofórmio e seca-se o balão numa corrente de N 2 gasoso no exaustor de fumos. Transferem-se 10 mg de (asolectin soja extracto polar de 25 mg / ml em clorofórmio) para o balão e secar os lipidos sob uma corrente contínua de N 2 gasoso.
      NOTA: A escolha de lipídios para reconstituição é baseada nos resultados de experimentos na seção 4.
    2. Quando o clorofórmio foi evaporado, colocar o balão no vácuo durante 1 hora para assegurar a secagem completa. Adicionar 1 ml de Tampão A reconstituição para o lípido seco e o frasco vigorosamente vortex para obter o sedimento em suspensão lipídica.
    3. Para preparar pequenas vesículas unilamelares, sonicar a suspensão de lípido num sonicador de banho frio até a solução de vesículas torna-se mais ou menos translúcidos e não há aglomerados são observados (cerca de 10 - 15 min). A esta mistura, adicionar DDM a uma concentração final de 4 mM e incubar à TA durante 30 min.
  2. Reconstituição
    1. Adicionar a proteína purificada a partir do passo 2.5.4 à mistura de lípidos.
      NOTA: A relação proteína-to-lipídico depende do tipo de experimento. Para medições de correntes macroscópicas, uma proporção de 1: 10.000 é usado. Para os estudos de EPR, a reconstituição é feito a uma proteína maior a proporção de lípidos (1: 2500) para maximizar o sinal. É previamente demonstrado que a estas concentrações, nenhuma agregação lateral é observada 42.
      NOTA: quantidade de trabalho típico de GLIC para EPR é de aproximadamente 1 mg, embora com base na posição sondado, valores mais baixos iria funcionar tão bem.
    2. Incubar a amostra a 4 ºC durante 1 h com rotação suave, em seguida, diluir a amostra de 15 ml com tampão A.
      NOTA: Este passo traz a concentração de detergente abaixo da concentração micelar crítica (CMC).
    3. Remover o detergente residual na suspensão pela adição de esferas de poliestireno (com poros hidrofóbicos que o detergente armadilha). Adicionar 80 mg de limpar as contas e incubar os liposome suspensão O / N em um nutator a 4 ºC.
      1. Para preparar os grânulos para uso, pesar ~ 100 mg e transferi-los para um tubo de 50 ml. Adicionar 10 ml de metanol, agitar vigorosamente, girar as contas a 8.000 xg por 2 minutos, e decantar o metanol. Repita esse processo de metanol lavar três vezes. Repetir o mesmo processo com 30 ml de água desionizada, lavagem três vezes.
    4. No dia seguinte, o lipossoma transferir para um tubo de ultracentrifugação de 25 ml utilizando um filtro de coluna para remover as esferas e diluir a amostra de 25 ml. Centrifugar as amostras a 168.000 xg durante 2 hr. Decantar o sobrenadante e ressuspender o sedimento utilizando 100 pi de tampão B.

4. Determinar Optimal Lipid Composição para reconstituição por FRET

  1. Usar uma transferência de energia de ressonância de fluorescência (FRET) com base na análise para determinar a composição de membrana que mantém a proteína monodispersa.
  2. purificar wt GLIC (com a cisteína nativa, C27) seguindo os passos descritos na secção 2. Rótulo a proteína em um 10: 1 (label / monômero) razão molar ou com fluoresceína-maleimida ou tetramethylrhodamine-maleimida usando as etapas na seção 2.5.
  3. Seguindo os passos na secção 3.2 para reconstituição, preparar três amostras diferentes para cada composição lipídica a ser testado; Primeiro, fluoresceína marcado GLIC numa razão molar de 1:. 1500 (pentâmero: lípido) Em segundo lugar, GLIC numa proporção molar marcado com rodamina de 1: 1,500 (pentâmero: lípido). Em terceiro lugar, misturar detergente solubilizado fluoresceína e rodamina marcado GLIC (proporção de 1: 1 molar). Reconstituir esta mistura em 1: 750 (pentâmero: lípido) proporção.
    NOTA: Foram utilizados três sistemas de lipídios: asolectin, POPC: POPG (proporção de 3: 1 molar), e E. extracto polar coli. A proporção de proteína para a reconstituição de lípidos no ensaio FRET é maior do que o utilizado para as medições de EPR (1: 750, em comparação com 1: 1500 usado para estudos de EPR).
  4. Diluira suspensão de lipossomas (para reduzir o sinal de dispersão de luz; ~ 5 uL em 995 uL de tampão A), em seguida, pipetar a amostra numa cuvete de quartzo e colocá-lo em um fluorímetro.
  5. Definir o comprimento de onda de excitação a 490 (o que corresponde aos valores máximos de absorção para o doador: fluoresceína). Utilizando as instruções do fabricante, registar o espectro de emissão de 500 nm a 660 nm.
    NOTA: Para a amostra GLIC marcado com fluoresceína, você vai ver um pico em 518 nm (correspondente a emissão de fluoresceína) sem pico a 572 nm (correspondente a emissão de rodamina). Para a amostra GLIC marcada com rodamina, você não vai ver um pico a 518 nm, mas sim a 572 nm resultante da excitação direta de rodamina a 490 nm. Para a amostra contendo ambas as fluoresceína e rodamina rótulos, uma diminuição da intensidade de pico de fluoresceína e um aumento correspondente no pico de rodamina é um sinal de FRET, que é provável que um indicador de agregação lateral da proteína na membrana.
  6. monitorar oamplitude da emissão de rodamina a 572 nm a vários intervalos de tempo (0-24 h) de gravação em cada hora durante as primeiras 6 h e, em seguida, após incubação S / N (Figura 2). Para cada intervalo, medir a intensidade de fluorescência a 572 nm (para a rodamina: Ia) e a 518 nm (para a f luoresceina: Id). Subtrair a contribuição de activação rodamina direta (amostra 2 na etapa 4.3) a partir de Ia (IAC). Determinar a proporção de FRET como Iac / (Iac + Ib). Compare FRET em intervalos de tempo diferentes e em composições de lípidos diferentes.
    NOTA: Como um controlo, efectuar o passo 4.5 e 4.6 para amostras de detergente solubilizado e comparar o espectro de emissão para aqueles a partir dos lipossomas reconstituídos. Utilize uma mistura equimolar de proteína marcada em detergente (descrito no passo 4.3) e diluir em tampão A, suplementado com 0,5 mM de DDM. Espera-se que as amostras de detergente irá mostrar FRET sinal mínimo.

5. As medições funcionais por Gravações patch-clamp

  1. Prepare proteoliposomes para medições de patch-clamp em exatamente da mesma forma como para estudos de EPR (Seção 3.1).
    NOTA: No entanto, ajustar a proteína: lípido proporção com base no tipo de medição a ser feita (de canal único vs gravações macroscópicas). Flash-congelar os proteolipossomos em azoto líquido e armazenar a -80 ºC até à sua utilização. Normalmente, reconstituir GLIC em 1: 10.000 proteína: lipídio (razão molar) para as correntes macroscópicas e 1: 50.000 razão molar para gravações de canal único.
  2. lipossomas descongelamento em gelo. Lavar a lâmina de vidro limpa com água e etanol e secar completamente. Colocar uma gota de 10 ul do proteolipossoma no centro da lâmina e ó seco / N em um exsicador a 4 ° C sob vácuo.
  3. Re-hidratar os proteolipossomas seca por adição de 20 ul de Tampão B (NaCl 150 mM, HEPES 10 mM, pH 7,0) e colocar a lâmina numa petriplate no topo de um papel de filtro húmido. Cobrir a placa e permite a rehidratação a prosseguir durante cerca de 2 h.
    NOTA: Este processo Yields gigantes lipossomas multi-lamelares que são favoráveis ​​para corrigir a partir.
  4. Puxe pipetas de patch dos capilares de paredes finas de vidro de borosilicato (~ 1-2 mm de diâmetro ponta) usando Fabricante de configuração recomendada no extrator pipeta. Heat-polonês usando um fogo-forjar a uma resistência de 1,5 - 2MΩ quando preenchido com tampão B.
  5. Encha a câmara de gravação com tampão B, utilizando uma pipeta e anexar o eléctrodo de terra Ag / AgCl. Utilizando uma ponta de pipeta de 2 uL, gentilmente desalojar os lipossomas a partir da borda e transferência de 1 ul da suspensão na câmara de gravação. Aguarde alguns minutos para que os lipossomas para liquidar o fundo.
  6. Encha o patch-pipeta com tampão B, utilizando uma agulha de seringa não-metálicos e montá-la no amplificador cabeça-stage. Identificar uma vesícula single-isolado para corrigir. Aplicar uma pressão positiva leve para evitar que o patch-pipeta de entupimento, e insira a ponta na câmara de gravação.
  7. Aplicar impulsos de teste para medir o trabalho a prova pipetance e compensar o deslocamento de tensão pipeta. Aproxime-se da vesícula, e quando o contato é feito, aplique uma ligeira pressão negativa para puxar delicadamente a vesícula contra a pipeta patch para formar um selo gigaohm.
  8. Monitorizar a resistência da pipeta durante todo o processo. Uma vez que o selo é formado gigaohm, retirar-se a pipeta com cuidado de distância a partir do lipossoma para formar um remendo de dentro para fora. Desligue o pulso de teste.
  9. Definir o potencial segurando a -100 mV, e aplicar um pulso de pH. Um pH baixo foi obtido utilizando 10 mM de citrato de sódio Tampão C (NaCl 150 mM, citrato 10 mM, pH 3,0). (Figura 3)
    NOTA: As gravações são feitas com uma frequência de amostragem de 10 kHz para macroscópica e 40 kHz para medições de canal único.

6. Medidas de EPR

  1. Continuous-Wave EPR Spectroscopy
    1. Transferir a suspensão de lipossomas a partir do passo 3.2 para um tubo de 200 ul e sedimentar as amostras utilizando uma centrifugadora. Descartar o supernatant e amostra está pronta para medidas de RPE.
      NOTA: Para medições de EPR, é importante remover tanta tampão da amostra de lipossomas quanto possível. Uma vez que as amostras aquosas absorver a parte eléctrica do forno de microondas, resultando em aquecimento e perda de sensibilidade.
    2. Para levar a cabo a troca de tampão, transferir 20 ul de pelete de lipossomas utilizando uma pipeta para um tubo de microcentrífuga. Adicionar 180 mL de tampão D (NaCl a 100 mM, citrato 10 mM, pH 3,0) e incuba-se a 42 ° C banho-maria durante 5 min. Centrifugar a amostra, remover o sobrenadante utilizando uma pipeta e repita o processo três vezes para assegurar a troca completa de tampão.
      NOTA: Como alternativa, a permuta de tampão pode ser feita submetendo as amostras a vários ciclos de congelamento / descongelamento.
    3. Gás permeáveis ​​capilares de plástico são adequados para medições de ambos line-formas espectral e acessibilidade solvente. Toque no capilar para o proteolipossomos peletizada para desenhar a amostra dentro e selar a extremidade com cera de osso.
      NÃOE: típica volumes de amostras são ~ 5 mL e uma concentração de spin desejável é 150? M. Se o objetivo é medir formas de linha sozinho, pode-se usar tubos de OD de quartzo capilares 0,4 mm. Se necessário, uma pipeta pode ser utilizada para encher a amostra no interior do capilar.
    4. Operar o espectrômetro
      1. Realizar medições CW-EPR à temperatura ambiente (292-297 K) em um espectrômetro de banda X equipado com um ressonador dielétrico de acordo com o manual de instruções dos fabricantes.
      2. Ligue o refrigerador de água, fornecimento de energia, e consola de ponte de microondas. Permitir que o sistema equilibrar termicamente durante cerca de 30 min antes da gravação. Abra o software de aquisição.
      3. Inserir o tubo de amostra / capilar para dentro do ressonador, certifique-se de que a secção do tubo cheio com a amostra está no centro da cavidade de ressonância. Sintonize o ressonador de acordo com as instruções no manual do espectrômetro.
      4. Grave o primeiro espectro de absorção derivado de varredura de campo emuma potência incidente microondas de 1,0 mW, a modulação de frequência de 100 kHz e uma largura de varredura de 100 G. Determine a potência ideal para o experimento através da realização de um experimento de saturação de potência progressiva, onde a altura do pico-a-pico do primeiro CW derivado sinal EPR é medida como uma função da raiz quadrada da energia de microondas incidente.
        NOTA: Para potências de microondas inferiores, a intensidade de sinal aumenta proporcionalmente à raiz quadrada da energia desde a população de equilíbrio dos estados de spin não é afectada. No entanto, se o poder é ainda maior, o relaxamento spin-estrutura já não pode manter a diferença de população de equilíbrio dos dois estados de spin e a amplitude do sinal começa a estagnar ou "saturar". Para além deste ponto, a amplitude de sinal pode realmente diminuir com o aumento do poder observar devido à inversão de população de sates rotação. Além disso, para os espectros alargado com asas extensas onde uma linha de base plana bem definida não é VIvel, aumentar a largura da varredura para 150-200 G para evitar a perda de área.
      5. Comece com o uso de uma amplitude de modulação de 1,0 G.
        Nota: Este valor é sample-dependente e ajustado para diminuir o ruído de baixa frequência no sinal. Se for muito grande um valor for usado, ele pode distorcer ou ampliar o sinal.
      6. Defina o tempo constante e conversão tempo de 20,48 ms, varrer tempo de 20,97 segundos, e resolução de até 1024 pontos.
        Nota: A constante de tempo também é baseada na amostra e é ajustado para filtrar o ruído de alta frequência.
      7. Depois de o primeiro exame, definir o campo de centro no centro do sinal EPR e escolher largura de varrimento de tal modo que o rastreio inclui o sinal de linha de base e suficiente em ambos os lados.
        NOTA: Para além disso, para melhorar a relação sinal / ruído, aumentar o número de verificações com base na força do sinal EPR. Incluem largura de varredura eo número de pontos
      8. Medir a acessibilidade do marcador de spin para colisão agentes relaxante O 2 ou ácido etilenodiaminodiacético (Niedda) protocolos de saturação usando energia 27 descrito no passo 6.1.4.4.
        NOTA: Prepare Niedda como descrito anteriormente 26.
      9. Primeiro perfundir a amostra na cavidade com N 2 durante 5 min (a expulsar O 2). Medir os espectros para cada potência de microondas entre 5-35 dB, em passos de 3 dB com uma largura de varrimento de 30 G.
      10. Então perfundir a amostra na cavidade com ar durante 10 minutos e medir os espectros em diferentes potências de microondas (5-35 dB em passos de 3 dB) como no passo 6.1.4.9.
      11. Incubar 20 ul do sedimento com 180 ul de lipossomas de Niedda 50 mM (em tampão B ou tampão D), numa 42 ° C em banho-maria durante 5 min. Centrifugar a amostra e remover o sobrenadante utilizando uma pipeta. Carregar a amostra no capilar e colocá-la no interior da cavidade do ressonador. Repita o passo 6.1.4.9.
        NOTA: O princípio por trás do experimento é que a interação com relaxina paramagnéticag agentes por meio de troca de spin Heisenberg seria evitar a saturação da inversão de sinal e população. Água Niedda solúvel e lipídico O peso molecular solúvel 2 são usados ​​como repórteres para a água (tanto a granel e antessalas intraprotein) e da membrana posições na proteína expostos, respectivamente.
  2. Análise de dados:
    NOTA: A análise dos dados EPR envolve os seguintes passos: 14,22,23,25-27
    1. Calcula-se a mobilidade da sonda de rotação (AH S-1), como o inverso da largura da linha central do primeiro espectro de absorção no derivado. AH o -1 é o reflexo da liberdade motional ou a dinâmica da sonda.
    2. Calcular o parâmetro de acessibilidade (П), que é uma estimativa da acessibilidade da sonda com outros agentes relaxantes colisional paramagnéticas, utilizando os passos descritos abaixo.
      NOTA: Interação do spin-sonda com agentes paramagnéticos relaxanteaumenta a taxa de relaxação spin-rede (T 1) do nitróxido por troca de spin Heisenberg. 27
      1. Estimar o parâmetro de acessibilidade (П) a partir de experiências de saturação de alimentação (6.1.4.8) em que a amplitude vertical pico-a-pico da linha central do primeiro espectro de EPR derivado é medido em diferentes potência de microondas. 25 Lote da amplitude do sinal como uma função da raiz quadrada da potência de microondas e se encaixam com a seguinte equação 27.
        figure-protocol-1
        NOTA: Quando A é a amplitude do sinal, é uma medida da homogeneidade da saturação da linha de ressonância (o que é normalmente entre 0,5 e 1,5), que é um factor de escala, P é a energia incidente, e a representa o valor em que o primeiro derivado de amplitude é metade do seu valor insaturado.
  3. Calcular AP 1/2 como a diferença em valores P 1/2 na presença (O 2 ou Niedda) e ausência (perfundidos com N 2) de agentes paramagnéticos relaxante. Calcular o parâmetro de acessibilidade (П) usando a equação:
    figure-protocol-2
    NOTA: Onde P 02/01 de referência e de referência O AH é a metade valor de saturação máxima potência e a largura de linha central, respectivamente, para o padrão de referência (tais como o DPPH (2,2-difenil-1-picrilhidrazil)) 27.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Resultados

Caracterização bioquímica dos Mutantes GLIC marcado por rotação

Seguindo o protocolo descrito acima seria normalmente produzem proteína de fusão MBP-GLIC na gama de 10 - 12 mg / L de cultura. Embora este valor pode variar entre os diferentes mutantes, em particular para as posições enterradas no interior da proteína, o rendimento pode ser significativamente comprometida. Nestes casos, os volumes de cultura pod...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Discussão

espectroscopia EPR tem provado ser uma abordagem estrutural inigualável em quantificar mudanças conformacionais em proteínas de membrana em um ambiente quase nativo. Esta abordagem permite-nos uma espiada nos detalhes moleculares da dinâmica de proteínas que são obscurecidos em estruturas de alta resolução a partir de cristalografia de raios X e microscopia Cryo-elétron. No entanto, é importante considerar as limitações técnicas dessa abordagem que possa afetar a aplicabilidade geral para outros sistemas e também para m...

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Estamos muito gratos aos membros atuais e antigos do laboratório Chakrapani para leitura crítica e comentários sobre o manuscrito. Este trabalho foi financiado pelo National Institutes of Health subvenção (1R01GM108921) e da American Heart Association (NCRP Scientist Desenvolvimento Grant 12SDG12070069) e SC.

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Mutações de Mutagênese e Cys
ao Sítio 10x PfuUltra HF tampão de reaçãoAgilent Technologies600380-52
dNTPSNew England BioLabs Inc‎N0447L10 mM cada dNTP
pfu Ultra DNA polimeraseAgilent Technologies600380-512.5 U/ul
DPNI New England BioLabs Inc‎R0176S20,000 U/ml
XL10 GOLDAgilent Technologies200314
SOC mediaNew England BioLabs Inc‎B9020S
KanamicinaFisher ScientficBP905
LB mídiaInvitrogen127957084
Miniprep kitQIAGEN27106
C43 células competentesLucigen60446
Expressão e Purificação
GlicoseFisher ScientficD16
Biorreagentes FisherTriptonaBP1421-500
Extrato de leveduraAmrescoJ850
Biorreagentes FisherglicerolBP229
K2HPO4Amresco0705
K2HPO4Amresco0781
IPTG (isopropil-tio-β-galactosídeo)Gold BiotechnologyI2481C25
Trizma BaseSigma Life ScienceT1503
NaClSigma-AldrichS7653
DNase ISigma Life ScienceDN25
PMSFAmrescoM145
LeupeptinaAmrescoJ580
PepstatinaAmrescoJ583
DDM (n-Docecil-β-D-Maltopiranosídeo)AnatraceD310S
Resina de amiloseNew England BioLabs Inc‎E8021L
TCEPAmrescoK831
EDTAFisher ScientficBP118
MaltoseAcros Organics329915000
Superdex 200 GLGE Healthcare17-5175-01
Coluna vazia de cromatografia de polipropilenoBioRad731-1550
Rotulagem de rotação dirigida ao local
MTSL (1-oxil-2,2,5,5-tetrametil-3-pirrolina-3-metil) metantiossulfonatoToronto Reaserch chemicals IncO873900
(1-acetoxi-2,2,5,5-tetrametil-Δ 3-pirrolina-3-metil) metantiossulfonatoToronto Reaserch chemicals IncA167900
DMSOJ.T. Baker9224-01
Reconstituição
Lipídio de asoletinaAvanti lipídios polares Inc541602C
Biobeads (grânulos de poliestirena)Bio Rad152-3920
MetanolFisher produtos químicosA413
FRET
Fluoresceína-maleimidaThermoFisher ScientificF-150
Tetrametilrodamina-maleimidaThermoFisher ScientificT-6027
POPCAvanti lipídios polares Inc850457C
POPGAvanti lipídios polares Inc840457C
E.coli extrato lipídico polarAvanti polar lipids Inc100600C
HEPESSigma Life ScienceH3375
EPR medição
TPX capilares plásticosBrukerER221
EDDA (etilenodiamina-N, N'-ácido diacético)Aldrich158186
Ni(OH)2Aldrich283622
Dirigidas de

Referências

  1. Tasneem, A., Iyer, L. M., Jakobsson, E., Aravind, L. Identification of the prokaryotic ligand-gated ion channels and their implications for the mechanisms and origins of animal Cys-loop ion channels. Genome Biol. 6, 4(2005).
  2. Hilf, R. J., Dutzler, R. X-ray structure of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 452 (7185), 375-379 (2008).
  3. Bocquet, N., et al. X-ray structure of a pentameric ligand-gated ion channel in an apparently open conformation. Nature. 457 (7225), 111-114 (2009).
  4. Hibbs, R. E., Gouaux, E. Principles of activation and permeation in an anion-selective Cys-loop receptor. Nature. 474 (7349), 54-60 (2011).
  5. Miller, P. S., Aricescu, A. R. Crystal structure of a human GABAA receptor. Nature. 512 (7514), 270-275 (2014).
  6. Hassaine, G., et al. X-ray structure of the mouse serotonin 5-HT3 receptor. Nature. 512 (7514), 276-281 (2014).
  7. Du, J., Lu, W., Wu, S., Cheng, Y., Gouaux, E. Glycine receptor mechanism elucidated by electron cryo-microscopy. Nature. , (2015).
  8. Sunshine, C., McNamee, M. G. Lipid modulation of nicotinic acetylcholine receptor function: the role of neutral and negatively charged lipids. Biochim Biophys Acta. 1108, 240-246 (1992).
  9. Fong, T. M., McNamee, M. G. Correlation between acetylcholine receptor function and structural properties of membranes. Biochemistry. 25 (4), 830-840 (1986).
  10. daCosta, C. J., Baenziger, J. E. A lipid-dependent uncoupled conformation of the acetylcholine receptor. J Biol Chem. 284 (26), 17819-17825 (2009).
  11. Criado, M., Eibl, H., Barrantes, F. J. Functional properties of the acetylcholine receptor incorporated in model lipid membranes. Differential effects of chain length and head group of phospholipids on receptor affinity states and receptor-mediated ion translocation. J Biol Chem. 259 (14), 9188-9198 (1984).
  12. Hubbell, W. L., Lopez, C. J., Altenbach, C., Yang, Z. Technological advances in site-directed spin labeling of proteins. Curr Opin Struct Biol. 23 (5), 725-733 (2013).
  13. Columbus, L., Hubbell, W. L. A new spin on protein dynamics. Trends Biochem Sci. 27 (6), 288-295 (2002).
  14. Hubbell, W. L., Cafiso, D. S., Altenbach, C. Identifying conformational changes with site-directed spin labeling. Nat Struct Biol. 7 (9), 735-739 (2000).
  15. McHaourab, H. S., Steed, P. R., Kazmier, K. Toward the fourth dimension of membrane protein structure: insight into dynamics from spin-labeling EPR spectroscopy. Structure. 19 (11), 1549-1561 (2011).
  16. Bordignon, E. Site-directed spin labeling of membrane proteins. Top Curr Chem. 321, 121-157 (2012).
  17. Klare, J. P., Steinhoff, H. J. Spin labeling EPR. Photosynth Res. 102 (2-3), 377-390 (2009).
  18. Drescher, M. EPR in protein science : intrinsically disordered proteins. Top Curr Chem. 321, 91-119 (2012).
  19. Perozo, E., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Liu, Y. S., Sompornpisut, P. EPR approaches to ion channel structure and function. Novartis Found Symp. 245, 146-158 (2002).
  20. Fanucci, G. E., Cafiso, D. S. Recent advances and applications of site-directed spin labeling. Curr Opin Struct Biol. 16 (5), 644-653 (2006).
  21. Sahu, I. D., McCarrick, R. M., Lorigan, G. A. Use of electron paramagnetic resonance to solve biochemical problems. Biochemistry. 52 (35), 5967-5984 (2013).
  22. Hubbell, W. L., McHaourab, H. S., Altenbach, C., Lietzow, M. A. Watching proteins move using site-directed spin labeling. Structure. 4 (7), 779-783 (1996).
  23. Altenbach, C., Marti, T., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. Transmembrane protein structure: spin labeling of bacteriorhodopsin mutants. Science. 248 (4959), 1088-1092 (1990).
  24. McHaourab, H. S., Lietzow, M. A., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme. Correlation with protein structure and dynamics. Biochemistry. 35 (24), 7692-7704 (1996).
  25. Farahbakhsh, Z. T., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Spin labeled cysteines as sensors for protein-lipid interaction and conformation in rhodopsin. Photochem Photobiol. 56 (6), 1019-1033 (1992).
  26. Altenbach, C., Greenhalgh, D. A., Khorana, H. G., Hubbell, W. L. A collision gradient method to determine the immersion depth of nitroxides in lipid bilayers: application to spin-labeled mutants of bacteriorhodopsin. Proc Natl Acad Sci U S A. 91 (5), 1667-1671 (1994).
  27. Altenbach, C., Froncisz, W., Hemker, R., McHaourab, H., Hubbell, W. L. Accessibility of nitroxide side chains: absolute Heisenberg exchange rates from power saturation EPR. Biophys J. 89 (3), 2103-2112 (2005).
  28. Rabenstein, M. D., Shin, Y. K. Determination of the distance between two spin labels attached to a macromolecule. Proc Natl Acad Sci U S A. 92 (18), 8239-8243 (1995).
  29. Altenbach, C., Oh, K. J., Trabanino, R. J., Hideg, K., Hubbell, W. L. Estimation of inter-residue distances in spin labeled proteins at physiological temperatures: experimental strategies and practical limitations. Biochemistry. 40 (51), 15471-15482 (2001).
  30. Borbat, P. P., McHaourab, H. S., Freed, J. H. Protein structure determination using long-distance constraints from double-quantum coherence ESR: study of T4 lysozyme. J Am Chem Soc. 124 (19), 5304-5314 (2002).
  31. Chiang, Y. W., Borbat, P. P., Freed, J. H. The determination of pair distance distributions by pulsed ESR using Tikhonov regularization. J Magn Reson. 172 (2), 279-295 (2005).
  32. Jeschke, G. DEER distance measurements on proteins. Annu Rev Phys Chem. 63, 419-446 (2012).
  33. Jeschke, G., Polyhach, Y. Distance measurements on spin-labelled biomacromolecules by pulsed electron paramagnetic resonance. Phys Chem Chem Phys. 9 (16), 1895-1910 (2007).
  34. Jeschke, G., Wegener, C., Nietschke, M., Jung, H., Steinhoff, H. J. Interresidual distance determination by four-pulse double electron-electron resonance in an integral membrane protein: the Na+/proline transporter PutP of Escherichia coli. Biophys J. 86 (4), 2551-2557 (2004).
  35. Hilf, R. J., Dutzler, R. Structure of a potentially open state of a proton-activated pentameric ligand-gated ion channel. Nature. 457 (7225), 115-118 (2009).
  36. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Conformational transitions underlying pore opening and desensitization in membrane-embedded Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 287 (44), 36864-36872 (2012).
  37. Birnboim, H. C., Doly, J. A rapid alkaline extraction procedure for screening recombinant plasmid DNA. Nucleic Acids Res. 7 (6), 1513-1523 (1979).
  38. Sanger, F., Nicklen, S., Coulson, A. R. DNA sequencing with chain-terminating inhibitors. Proc Natl Acad Sci U S A. 74 (12), 5463-5467 (1977).
  39. Sanger, F., Coulson, A. R. A rapid method for determining sequences in DNA by primed synthesis with DNA polymerase. J Mol Biol. 94 (3), 441-448 (1975).
  40. McHaourab, H. S., Kalai, T., Hideg, K., Hubbell, W. L. Motion of spin-labeled side chains in T4 lysozyme: effect of side chain structure. Biochemistry. 38 (10), 2947-2955 (1999).
  41. Gross, A., Columbus, L., Hideg, K., Altenbach, C., Hubbell, W. L. Structure of the KcsA potassium channel from Streptomyces lividans: a site-directed spin labeling study of the second transmembrane segment. Biochemistry. 38 (32), 10324-10335 (1999).
  42. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in a Prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), (2012).
  43. Velisetty, P., Chakrapani, S. Desensitization mechanism in prokaryotic ligand-gated ion channel. J Biol Chem. 287 (22), 18467-18477 (2012).
  44. Chakrapani, S., Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of an isolated voltage-sensor domain in a lipid bilayer. Structure. 16 (3), 398-409 (2008).
  45. Cuello, L. G., Cortes, D. M., Perozo, E. Structural dynamics of the KvAP pore domain lacking the voltage sensing domain. Biophysical Journal. 88 (1), 19-20 (2005).
  46. Perozo, E., Cortes, D. M., Cuello, L. G. Structural rearrangements underlying K+-channel activation gating. Science. 285 (5424), 73-78 (1999).
  47. Chakrapani, S., Sompornpisut, P., Intharathep, P., Roux, B., Perozo, E. The activated state of a sodium channel voltage sensor in a membrane environment. Proc Natl Acad Sci U S A. 107 (12), 5435-5440 (2010).
  48. Vasquez, V., Sotomayor, M., Cordero-Morales, J., Schulten, K., Perozo, E. A structural mechanism for MscS gating in lipid bilayers. Science. 321 (5893), 1210-1214 (2008).
  49. Perozo, E., Cortes, D. M., Sompornpisut, P., Kloda, A., Martinac, B. Open channel structure of MscL and the gating mechanism of mechanosensitive channels. Nature. 418 (6901), 942-948 (2002).
  50. Kim, M., Xu, Q., Murray, D., Cafiso, D. S. Solutes alter the conformation of the ligand binding loops in outer membrane transporters. Biochemistry. 47 (2), 670-679 (2008).
  51. Kazmier, K., Sharma, S., Islam, S. M., Roux, B., McHaourab, H. S. Conformational cycle and ion-coupling mechanism of the Na+/hydantoin transporter Mhp1. Proc Natl Acad Sci U S A. 111 (41), 14752-14757 (2014).
  52. Durr, K. L., et al. Structure and dynamics of AMPA receptor GluA2 in resting, pre-open, and desensitized states. Cell. 158 (4), 778-792 (2014).
  53. Borbat, P. P., et al. Conformational motion of the ABC transporter MsbA induced by ATP hydrolysis. PLoS Biol. 5 (10), e271(2007).
  54. Zou, P., McHaourab, H. S. Increased sensitivity and extended range of distance measurements in spin-labeled membrane proteins: Q-band double electron-electron resonance and nanoscale bilayers. Biophys J. 98 (6), 18-20 (2010).
  55. Pannier, M., Veit, S., Godt, A., Jeschke, G., Spiess, H. W. Dead-time free measurement of dipole-dipole interactions between electron spins. J Magn Reson. 142 (2), 331-340 (2000).
  56. Jeschke, G., et al. DeerAnalysis2006-a comprehensive software package for analyzing pulsed ELDOR data. Applied Magnetic Resonance. 30 (3-4), 473-498 (2006).
  57. Ruta, V., Jiang, Y., Lee, A., Chen, J., MacKinnon, R. Functional analysis of an archaebacterial voltage-dependent K+ channel. Nature. 422 (6928), 180-185 (2003).
  58. Velisetty, P., Chalamalasetti, S. V., Chakrapani, S. Structural basis for allosteric coupling at the membrane-protein interface in Gloeobacter violaceus ligand-gated ion channel (GLIC). J Biol Chem. 289 (5), 3013-3025 (2014).
  59. Dellisanti, C. D., et al. Site-directed spin labeling reveals pentameric ligand-gated ion channel gating motions. PLoS Biol. 11 (11), e1001714(2013).
  60. Labriola, J. M., et al. Structural sensitivity of a prokaryotic pentameric ligand-gated ion channel to its membrane environment. J Biol Chem. 288 (16), 11294-11303 (2013).
  61. Kinde, M. N., et al. Conformational Changes Underlying Desensitization of the Pentameric Ligand-Gated Ion Channel ELIC. Structure. 23 (6), 995-1004 (2015).
  62. Vasquez, V., Cortes, D. M., Furukawa, H., Perozo, E. An optimized purification and reconstitution method for the MscS channel: strategies for spectroscopical analysis. Biochemistry. 46 (23), 6766-6773 (2007).
  63. Bayburt, T. H., Sligar, S. G. Membrane protein assembly into Nanodiscs. FEBS Lett. 584 (9), 1721-1727 (2010).
  64. Hanson, S. M., Francis, D. J., Vishnivetskiy, S. A., Klug, C. S., Gurevich, V. V. Visual arrestin binding to microtubules involves a distinct conformational change. J Biol Chem. 281 (14), 9765-9772 (2006).
  65. McCoy, J., Hubbell, W. L. High-pressure EPR reveals conformational equilibria and volumetric properties of spin-labeled proteins. Proc Natl Acad Sci U S A. 108 (4), 1331-1336 (2011).
  66. Mobius, K., et al. Combining high-field EPR with site-directed spin labeling reveals unique information on proteins in action. Magn Reson Chem. 43, Spec no. 4-19 (2005).
  67. Lopez, C. J., Oga, S., Hubbell, W. L. Mapping Molecular Flexibility of Proteins with Site-Directed Spin Labeling: A Case Study of Myoglobin. Biochemistry. 51 (33), 6568-6583 (2012).
  68. Fleissner, M. R., et al. Site-directed spin labeling of a genetically encoded unnatural amino acid. Proc Natl Acad Sci U S A. 106 (51), 21637-21642 (2009).
  69. Lorenzi, M., et al. Tyrosine-targeted spin labeling and EPR spectroscopy: an alternative strategy for studying structural transitions in proteins. Angew Chem Int Ed Engl. 50 (39), 9108-9111 (2011).

Acesso restrito. Inicie sessão ou comece um teste para visualizar este conteúdo.

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Espectroscopia EPREPR de Onda Cont nuaResson ncia Dupla de El tronsPurifica o de Prote nasReconstitui o de MembranaPrepara o de LipossomasCromatografia de Filtra o em GelConcentra o Centrifugada

Artigos relacionados