Artigo de método

Geração de imatura, madura e tolerogênicas células dendríticas com diferentes fenótipos Metabolic

DOI:

10.3791/54128

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22 de junho de 2016

 ,  ,  , 
1Translational Immunology, Institute of Molecular and Cell Biology, Agency for Science, Technology and Research, 2Singapore Immunology Network, 3Institute of Biomedical Studies, Baylor University

Neste artigo

Resumo

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As células dendríticas imaturas podem ser diferenciadas seletivamente em células dendríticas tolerogênicas ou maduras para regular o equilíbrio entre imunidade e tolerância. Este trabalho apresenta um meio de gerar a partir de células dendríticas derivadas de monócitos imaturos (moDCs), moDCs tolerogênicas in vitro e maduras que diferem em fenótipos metabólicos.

Resumo

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resultados da resposta imune de uma interacção complexa entre o sistema imune inato antigénio não específico e do sistema imune adaptativo antigénio específico. O sistema imunológico é uma constante de equilíbrio para manter a tolerância a auto-moléculas e reagir rapidamente a agentes patogénicos. As células dendríticas (DCs) são potentes células apresentadoras de antígenos profissionais que ligam o sistema imune inato para o sistema imunitário adaptativo e equilibrar a resposta adaptativa entre o eu e não-eu. Dependendo dos sinais de maturação, as células dendríticas imaturas podem ser estimuladas selectivamente para se diferenciarem em DCs imunogénicos ou tolerogénicos. células dendríticas imunogénicas fornecer sinais de proliferação de células T específicas do antigénio para a expansão clonal; enquanto que as células dendríticas tolerogénicos regular a tolerância por deleção de células T específico para o antigénio ou a expansão clonal de células T reguladoras. Devido a esta propriedade única, as células dendríticas são muito procurados como agentes terapêuticos para o câncer e dise auto-imuneases. As células dendríticas podem ser carregadas com antígenos específicos in vitro e injectado no corpo humano para montar uma resposta imune específica ambos imunogénicos e tolerogénico. Este trabalho apresenta um meio para gerar in vitro de monócitos, células dendríticas imaturas monócitos derivados (moDCs), tolerogênico e moDCs maduros que diferem na expressão do marcador de superfície, função e fenótipos metabólicos.

Introdução

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DC foi primeiramente descrita por Paul Langerhans (células de Langerhans) no final do século XIX, como referenciado por Jolles 1 e caracterizado por Ralph Steinman e Zanvil Cohn em 1973 que os reconhecidos como apresentadoras de antígenos células profissionais 2. DCs são encontradas no sangue periférico e na maioria dos tecidos do corpo, especialmente abundante nos tecidos que estão expostos ao ambiente externo, tais como a pele (presente como células de Langerhans) e nos forros do nariz, pulmões, estômago e intestinos, que permitem -los para encontrar antigénios extrínsecos. Imaturo DCs têm capacidade endocítica mas relativamente baixa capacidade de estimular células T 3. Imaturo DCs expressam vários receptores de reconhecimento de padrões (PRRs) que capturam padrões associados a patógenos moleculares (PAMPs) ou padrões moleculares associados a danos (amortece) 4. sinais de perigo ativando conduzir a maturação em direção DCs imunogênicas embora a auto-moléculas resultar em unresponsivene células Tss e apoptose 5. DCs imunogénicas são caracterizadas pela regulação positiva de moléculas de MHC e moléculas de superfície co-estimuladores e a sua capacidade de células T naive primos 6,7.

DCs imaturas também pode ser amadurecido para um estado Treg de indução ou tolerogénico em resposta à vitamina D3 metabolito 1a, 25 (O) 2 D 3 e certos agentes imunossupressores como Interleucina-10 (IL-10), dexametasona e rapamicina 8-9. DCs tolerogénico são caracterizados pela sua expressão de motivos de inibição baseado em tirosina imunorreceptor (ITIMs) contendo receptores da superfície e ligandos. Transdução de sinal de ITIMs contendo membros da família ILT, ILT3 e ILT4 em DCs tolerogênicas inibir alloproliferation e impulsionar a expansão Foxp3 + Treg 10,11. Estas propriedades únicas de DCs tolerogénicos levar a sua profunda potência in vivo, ou seja, a capacidade para induzir a tolerância a enxertos alogénicos durável transplantados e suppress o desenvolvimento de doenças auto-imunes. Tolerogénico DCS pode ser visto, por conseguinte, como um subtipo de DCs maduras polarizado que funcionam na inibição da activação imunitária.

Actualmente, existem dois subconjuntos gerais de células dendriticas no sangue periférico humano: DCs plasmocitoides e DCs mielóides 12. DCs circulantes são constituinte rara para menos de 2% dos leucócitos do sangue humano e isto representa uma dificuldade para o isolamento de um número apropriado de DCs para estudar as suas funções imuno-reguladoras. Para superar este problema, monócitos diferenciados DCs são utilizadas como um modelo in vitro para estudo da função de células dendríticas. Estes DCs in vitro têm receptores e funções semelhantes em comparação com DCs in vivo. Comparação detalhada das DCs in vivo e em monócitos derivados DCs in vitro gerado (moDCs) são investigados por outros laboratórios 13, 14, 15. Também é relatado que moDCs e CD1c + DCs foram equivalentes a apresentadoras de antígenos e induzir a função das células T 15.

Neste trabalho, nós descrevemos um método de gerar moDCs imaturos de monócitos do sangue periférico e em seguida diferenciá-las em DCs imunogênica e tolerogênicas. Estas células dendríticas derivadas de monócitos (moDCs) são caracterizados pelos seus marcadores de superfície, perfil de citocinas, funções imuno-reguladoras e estados metabólicos. células dendríticas imunogênica e tolerogênicas produzem diferentes citocinas que resultam na expansão da utilização de células T alogénicos ou células T reguladoras. Neste trabalho, citocina perfis é realizada com sistemas que utilizam a tecnologia multiplex. O meio de crescimento de células são incubadas com o código de cores esferas de anticorpo imobilizado e lidas de um analisador compacto. estados metabólicos de DCs são analisados ​​usando analisadores de fluxo extracelulares que medem a taxa de consumo de oxigênio, um indicador da respiração celular e taxa de acidificação extracelular que reflete glycolyticfluxo em células dendríticas. A medição destes taxas bioenergética fornece um meio para controlar as alterações no metabolismo celular, que são vitais para o desenvolvimento de células dendrítica e função.

Protocolo

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Esta pesquisa foi aprovada pelo Conselho de Revisão Institucional (NUS-IRB 10-250).

1. Isolamento de células mononucleares de sangue periférico (PBMC)

  1. Preparação do Reagente
    1. Prepare PBS / EDTA: solução salina tamponada com fosfato (PBS) e completar com 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Esterilizar a solução por filtração através de um filtro de 0,2 um. Nota para armazenar PBS / EDTA a 4 ° C e aquecer até à temperatura ambiente antes do uso.
    2. Preparar tampão de coloração: Solução salina tamponada com fosfato (PBS) com suplemento de 2% de soro fetal de bovino (FBS), 10 mM ácido 4- (2-hidroxietil) -1-piperazinoetanossulfónico (HEPES) e 2 mM de ácido etilenodiaminotetracético (EDTA). Esterilizar a solução por filtração através de um filtro de 0,2 um.
  2. Recolha de Sangue do Cone Sangue
    Nota: O cone de sangue contém componentes de glóbulos brancos recolhidos após pratoletpheresis do hospital. Se o sangue é coletado em heparina ou EDTA tubos, diluir o sangue com PBS na proporção 1: 1 e vá para o passo 1.3; se buffy coat é recebido, diluir creme leucocitário com PBS na proporção de 1: 2 e avance para o passo 1.3.
    1. Corte as duas extremidades do cone para permitir que o sangue flua para fora para um tubo de 50 ml. Note-se que o cone geralmente contém 10 ml de sangue.
    2. Usando uma seringa de extremidade cega contendo 30 ml de PBS / EDTA para lavar o cone e recolher num tubo de 50 ml.
    3. Dilui-se o sangue ainda com PBS / EDTA até um volume final de 80 ml.
  3. Isolamento de PBMC por centrifugação de densidade 16
    1. Alíquotas de 15 ml de Ficoll cada 4 frescos tubos de 50 ml.
    2. Use de 25 ml pipeta sorológica para adicionar 20 ml de sangue diluído sobre a camada de Ficoll. Tome nota para segurar o tubo de 50 ml em um ângulo de 45 e ter o cuidado de não perturbar a interfase.
    3. Centrifugar os tubos a 805 xg sem freios durante 30 min, 20 ° C.
    4. Remova ocamada de plasma e recolher o anel de PBMC que encontram-se logo abaixo da camada de plasma com uma pipeta Pasteur. Combinar quatro tubos de PBMC em dois tubos de 50 ml. Nota para evitar a coleta da camada transparente abaixo do PBMC.
    5. Adicionar PBS / EDTA até um volume final de 50 ml por tubo de PBMCs e centrifugar a 548 xg, com freios durante 10 min, 20 ° C.
    6. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento em cada tubo com 25 ml de tampão de coloração e combinam-se um tubo de 50 ml.
    7. Centrifugar a 367 xg, com freios de 5 min, 4 ° C.
    8. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento com 10 ml de tampão de coloração.

2. monócitos enriquecimento por separação magnética 17

  1. Determinar o número de células
    1. Tomar 20 ul de suspensão de células PBMC e misturar-se com 20 ul de azul de tripano para contar o número de células vivas utilizando o citómetro.
    2. suspensão de células a 367 xg Centrífuga com freiosdurante 10 min, 4 ° C.
    3. Aspirar o sedimento sobrenadante e ressuspender completamente de células a uma concentração de 10 7 culas por 80 ul de tampão de coloração.
  2. Etiquetagem magnética
    1. Adicionar 20 ul de microesferas de CD14 por 10 7 células, misturar bem e incubar durante 15 min a 2-8 ° C.
    2. Lave as células por adição de 1 ml de tampão de coloração por 10 7 células e centrifugar a 367 xg, com freios durante 10 min, 4 ° C.
    3. Sedimento sobrenadante e ressuspender completamente aspirado células em uma concentração de 10 7 culas por 50 ul de tampão de coloração.
  3. Separação magnética
    1. Use coluna de tamanho médio para um máximo de 2 x 10 8 total de células.
      Nota: Escolha uma coluna e separador apropriado de acordo com o número de células totais e o número de células CD14 + recomendadas na folha de dados.
    2. Coloque coluna no campo magnético ófa separador adequado e preparar a coluna por lavagem com 500 ul de tampão de coloração.
    3. suspensão de células pipeta coluna e recolher células não marcadas que passam através da coluna com um tubo de 15 ml.
    4. Substituir um novo tubo de 15 ml na coluna e lavagem da coluna 3 vezes com 500 ul de tampão de coloração. Certifique-se o reservatório coluna está vazia antes de adicionar novo tampão de coloração entre as lavagens.
    5. Remover a coluna do separador e colocá-lo em um novo tubo de 15 ml.
    6. Pipetar 1 ml de tampão de coloração sobre a coluna. Lave imediatamente as células magneticamente marcadas empurrando firmemente o êmbolo (fornecido no kit) para a coluna.
    7. Repita os passos 2.3.2 a 2.3.6 utilizando a fracção de eluído numa coluna nova para aumentar a pureza das células CD14 +. Note-se que as contas serão liberados a partir das células automaticamente em cultura durante a etapa 3.2.

3. Diferenciação das Células Dendríticas Activação de s diferentesTates

  1. Preparação de Reagente (Nível de endotoxina tem de ser menor que 0,1 EU / ml em todos os reagentes)
    1. Prepare meio de cultura celular: RPMI 1640 suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS), 1% de não-aminoácidos essenciais (NEAA) e mM de 2-mercaptoetanol 0,05 (2ME). Esterilizar a solução por filtração através de um filtro de 0,2 um.
    2. Prepare citocinas: reconstituir IL-4 e GM-CSF em água de grau de cultura de células a uma concentração de 0,25 mg / ml, respectivamente, em condições assépticas. citocinas alíquotas em 200 microtubos ul e armazenar a -80 ° C.
    3. Prepare vitamina D3 estoque: reconstituir vitamina D3 na água de grau de cultura de células a uma concentração de 100 mM sob condições assépticas. Alíquota de vitamina D3 em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
    4. Prepare da dexametasona: reconstituir dexametasona na água de grau de cultura de células a uma concentração de 10 mM sob condições assépticas. dexamet alíquotahasOne em 1,5 ml tubos de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
    5. Prepare LPS: reconstituir Os lipopolissacáridos (LPS) na água de grau de cultura de células a uma concentração de 1 mg / ml, sob condições assépticas. LPS alíquotas em tubos de 1,5 ml de microcentrífuga e armazenar a -20 ° C.
  2. Gerando diferentes moDCs
    1. Semente de 4 conjuntos de monócitos CD14 + na concentração de 0,3-0,5 x 10 6 / mL de meio de cultura celular suplementado com 200 ng / ml de GM-CSF e 200 ng / ml de IL-4 em placas de 6 cavidades. Note que este é o Dia 0 e o volume do meio em cada 6 bem é de 2 ml.
    2. Incubar as células em cultura de tecidos incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
    3. Retirar 850 ul de meio de cultura no Dia 4 e centrifugar a 300 xg durante 5 min, 4 ° C. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet em 1 ml de meio de cultura celular contendo 2 X (200 ng / ml de GM-CSF e 200 ng / ml de IL-4). Adicione esta mistura celular de voltapara a cultura. Note-se que a concentração 2x adicionado para a GM-CSF e IL-4 se tornará 1x quando a 1 ml de meio é adicionado de volta para a cultura.
    4. Adicionar 1 ml de estoque de vitamina D3 e 1 ul de estoque dexametasona por ml de meio a dois dos conjuntos no Dia 5 para gerar moDCs tolerogênicas. Note-se que a concentração final de vitamina D3 é de 100 nM e 10 nM de dexametasona é; adição de GM-CSF e IL-4 não é necessária no dia 5.
    5. Adicionar 200 ng / ml de GM-CSF e 200 ng / ml de IL-4 para todos os conjuntos no dia 6.
    6. Adicionar 1 ug / ml de LPS para um dos conjuntos tratados apenas com GM-CSF e IL-4 ao dia 6 para gerar moDCs maduros.
    7. Adicionar 1 ug / ml de LPS de um conjunto dos moDCs tolerogénicos no Dia 6 para gerar LPS moDCs tolerogénicos.
    8. Colher as diferentes tipos de moDCs ao dia 7 por lavagem de placa de cultura com PBS, EDTA por citometria de fluxo ou outros estudos. Note-se que as células não aderentes são recolhidas apenas. Tome nota que o rendimento percentual de CD14 + monocytes para moDCs imaturos, moDCs maduros, moDCs tolerogénicos e DCs LPS-tolerogénicos são cerca de 90%, 50%, 60% e 60%, respectivamente, e varia entre dadores de sangue e muito FBS.

4. Citometria de Fluxo

  1. Caracterização do marcador de superfície celular na moDCs
    1. Separe as células do prato de cultura por pipetagem. Lavar as células uma vez com PBS / EDTA e ressuspender as células em uma concentração de 5 x 10 5 células por 50 ul de tampão de coloração em 1,5 ml tubo de microcentrífuga.
    2. Incubar 0,5 x 10 6 aliquotas de células com PerCP-HLADR conjugado (1: 100), CD80 conjugado com PE (1:50), CD83 conjugado com PE (1:25), CD86 conjugado com PE (1:50), APC- CD11c conjugado (01:50), CD14 conjugado com PE (1:50) e BDCA3 conjugado com PE (1:50) e ILT3 APC conjugada (01:25) no escuro durante 30 min a 4 ° C. PerCP conjugado MAb (1:20), PE-conjugado MAb (1:11), MAb APC-conjugado (1:11) servirá como controles negativos do mesmo isotipo.
    3. Detectar os níveis dos marcadores de superfície utilizando um citómetro de fluxo 18 de expressão.
  2. Análise das mitocôndrias potencial de membrana de moDCs
    1. Preparar a solução de estoque de um vermelho mM clorometil-X-rosamine (CMXRos) por adição de 94,1 ul de dimetil-sulfóxido (DMSO) por 50 mg de liofilizado Red CMXRos.
    2. Incubar 2 x 10 5 moDCs com 100 nM vermelho CMXRos em 1 ml de Solução Salina Equilibrada de Hank (HBSS) durante 30 min a 37 ° C em 15 ml de tubo.
    3. Adicionar 2 ml de PBS / EDTA a células e centrifugar a 300 xg durante 5 min, temperatura ambiente. Repita 2 vezes. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o sedimento celular em 300 ul de PBS, EDTA, 2% de FCS para a análise de citometria de fluxo. Tome nota de usar canal PE para analisar o sinal Red CMXRos.
  3. Marcador Caracterização de células T
    1. Incubar 50 ul de 1,2 x 10 6 CFSE marcado com alo células T CD4 + (gerado a partir depasso 5.6) com PerCP-CD3 conjugado (1: 200), PE / Cy7-CD4 conjugado (1: 400) e CD25 da APC / Cy7-conjugado (1: 100) no escuro durante 30 min a 4 ° C. As células T a mancha usando um kit comercial com Foxp3-Alexa Fluor 647 (01:50) no escuro durante 1 hora à temperatura ambiente.

5. Estudos Alloreaction

  1. Preparar a solução estoque de 5 mM de éster de succinimidilo de carboxifluoresceína (CFSE) por adição de 18 ul de DMSO para CFSE liofilizada, de acordo com o protocolo do fabricante.
  2. Purifica-se células T CD4 + a partir de células PBMC
    1. Determinar o número de células, tendo 20 ul de suspensão de células PBMC e misturar-se com 20 ul de azul de tripano para contar o número de células vivas utilizando um citómetro.
    2. suspensão de células a 367 xg Centrífuga com freios durante 10 min, 4 ° C.
    3. Sedimento sobrenadante e ressuspender completamente aspirado celular numa concentração de 5 x 10 7 células por 1 ml de tampão de coloração em 5 ml de uma polystytubo de rene.
    4. Adicionar CD4 + T Humano Cocktail celular de enriquecimento de células 50 ul / ml. Misturar bem e incubar à temperatura ambiente (15 - 25 ° C) durante 10 min.
    5. partículas magnéticas Vortex durante 30 segundos e adicionar partículas magnéticas em células 100 ul / ml. Misturar bem e incubar à temperatura ambiente durante 5 min.
    6. Adicionar tampão de coloração para a suspensão de células para um volume total de 2,5 ml. Misturar as células no tubo de cuidado pipetando para cima e para baixo 2 - 3 vezes. Colocar o tubo em o íman e incubar durante 5 min.
    7. Inverta ímã com tubo e decantar a suspensão (contém células T) em um novo 5 ml tubo de poliestireno.
  3. Determinar o número de células e incubar 1,2 x 10 6 CD4 + células-T com CFSE 5 uM em 1 ml de PBS durante 20 min a 37 ° C, protegida da luz.
  4. Adicionar cinco vezes o volume original da coloração com meio de cultura celular (preparado de acordo com o passo 3.1.1) para as células e incubar durante 5 min.
  5. CentrifUGE a 300 xg durante 5 min, 4 ° C e sedimento de ressuspender em meio de cultura celular a uma concentração de 2 x 10 5 por 75 ul.
  6. Adicionar 75 ul de 2 x 10 5 células CD4 + T-cells CFSE-rotulados para cada cultura moDC contendo 75 uL de meio de cultura de células com 0, 2,5 x 10 3, 5 x 10 3, 10 x 10 3, 20 x 10 3 e 40 x 10 3 moDCs em placas de 96 poços de fundo em U. Cultura durante 6 dias em cultura de tecidos incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
  7. Colheita pipetando as células T CD4 + para dentro do tubo de 15 ml e centrifugar a 300 xg durante 5 min, 4 ° C. Recolher o sobrenadante para a análise de citocinas e ressuspender sedimento celular em 2 ml de PBS / EDTA e centrifugar a 300 xg durante 5 min a 4 ° C.

6. citocinas Análise 19

  1. Recolher os sobrenadantes de estudos alloreaction tal como descrito na etapa 5.5.
  2. Preparação do Reagente para Human Cytokine / Chemokine análise de painel magnético
    1. Para a preparação da mistura de grânulos garrafa imobilizada de anticorpos para frascos individuais de grânulos (incluso no kit), vortex durante 1 min. Adicionar 60 ul de cada frasco anticorpo grânulo para o frasco de mistura (incluso no kit) e levar a um volume final de 3 ml com o grânulo Diluente (fornecida).
    2. Para a preparação de controlos de qualidade, reconstituir Controle de Qualidade 1 e Quality Control 2 (incluído no kit) com 250 mL de água desionizada.
    3. Para a preparação de tampão de lavagem, dilui-se 30 ml de tampão de lavagem 10X (incluso no kit) com 270 ml de água desionizada.
    4. Para a preparação de citocina humana padrão, reconstituir o padrão de citocinas humano (incluso no kit) com 250 ul de água desionizada para se obter uma / concentração de 10.000 pg ml.
      1. Adicionar 50 ul de 10000 pg / ml de padrão de citocinas humano a 200 uL de tampão de ensaio (fornecido no kit) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para fazer 2000 pg / mL padrão de trabalho. Transferir 50 uL de 2.000 pg / mL padrão de citocinas humano a 200 uL de tampão de ensaio (fornecido no kit) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para fazer 400 pg / ml de padrão de trabalho.
      2. Transferir 50 uL de 400 pg / ml de padrão de citocinas humano a 200 uL de tampão de ensaio (fornecido no kit) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para fazer 80 pg / ml de padrão de trabalho. Transferir 50 uL de 80 pg / ml de padrão de citocinas humano a 200 uL de tampão de ensaio (fornecido no kit) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para fazer 16 pg / ml de padrão de trabalho.
      3. Transferir 50 uL de 16 pg / ml de padrão de citocinas humano a 200 uL de tampão de ensaio (fornecido no kit) num tubo de microcentrífuga de 1,5 ml para fazer 3,2 pg / ml de padrão de trabalho. 0 pg / ml de padrão de trabalho tem apenas 200 ul de tampão de ensaio em um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml.
  3. Placa pré molhado filtro (incluso no kit) por pipetagem de 200 ul de tampão de ensaio (fornecido) em cada cavidade do filtroprato. Selar e colocar a placa de filtro num agitador de placas durante 10 minutos à temperatura ambiente.
  4. tampão aspirado de Ensaio e adicionar 25 mL de cada padrão ou controle de qualidade nos poços apropriados.
  5. Adicionar 25 ul de meio de cultura de células (preparado de acordo com o passo 3.1.1) para o segundo plano, padrões e poços de controlo.
  6. Adicionar 25 ul de tampão de ensaio aos poços de amostra e adicionar 25 ul de amostra para os poços de amostra apropriados.
  7. Vortex do frasco de mistura contendo grânulos imobilizado por anticorpo e adicionar 25 ul de os grânulos misturados a cada poço. Selar placa e incubar com agitação num agitador de placas durante a noite a 4 ° C.
  8. Aspirar placa fluido e lavagem 2 vezes por adição de 200 ul / poço de tampão de lavagem e aspiração do fluido.
  9. Adicionar 25 ul de anticorpos de detecção (fornecidos) em cada poço. Selar e incubar com agitação num agitador de placas durante 1 hora à temperatura ambiente.
  10. Adicionar 25 ul de estreptavidina ficoeritrina (provIDed) a cada poço contendo as 25 ul de anticorpos de detecção. Selar e incubar com agitação num agitador de placas durante 30 minutos à temperatura ambiente.
  11. placa de fluido de lavagem e aspirado, tal como descrito na etapa 6.8.
  12. Adicionar 150 ul / poço de bainha fluido a todos os poços e os grânulos ressuspender em um agitador de placas durante 5 min.
  13. Detectar a intensidade de fluorescência dos grânulos utilizando um sistema 3D 20. Analisar os dados de intensidade de fluorescência mediana usando um método de ajuste de curva log-logística de cinco parâmetros para o cálculo da concentração de citocinas / quimiocinas em amostras de 21.

7. em tempo real Consumo de Oxigênio Rate (OCR) e Extracelular A acidificação Taxa Medidas (ECAR)

  1. Preparação do reagente / Materiais
    1. Prepare meio de OCR: O meio de ensaio suplementado com glucose 25 mM e piruvato de sódio 1 mM (pH 7,35). Esterilizar a solução por filtração através de um filtro de 0,2 um. Tome nota que este meio é prepared sem FBS porque os componentes em FBS são complexas e variam de um lote para anteras muito.
    2. Prepare forma ECAR: Base de dados de meio suplementado com 2 mM de L-glutamina (pH 7,35). Esterilizar a solução por filtração através de um filtro de 0,2 um. Tome nota que este meio é preparado sem bicarbonato, glicose, piruvato e FBS. Note-se que FBS tem capacidade de tamponamento e irá interferir com a leitura ECAR.
    3. Preparar compostos para medições de OCR: Ressuspender oligomicina com 630 mL de meio OCR para fazer 100 solução mM estoque e diluir com meio OCR 16 mM concentração de trabalho. Ressuspender carbonil cianeto de 4- (trifluorometoxi) fenil-hidrazona (FCCP) com 720 ul de meio de OCR para perfazer 100 uM da solução e dilui-se com meio de OCR para 4,5 uM de concentração de trabalho. Ressuspender rotenona / antimicina A com 540 mL de meio OCR para fazer 50 mM solução estoque e diluir com meio OCR para 10? M de concentração de trabalho.
    4. Prepararcompostos para medições ECAR: Ressuspender de glucose com 3 ml de meio ECAR para fazer a solução estoque 100 mM e diluído para 80 mM de concentração de trabalho. Ressuspender oligomicina com 720 ul de meio ECAR para fazer a solução de estoque de 100 uM e diluir até 18 mM de concentração de trabalho. Ressuspender 2-desoxi-D-glucose com 1,5 ml de meio ECAR para fazer a solução estoque 1,000 mM.
    5. Pipetar 200 ul de calibrador em cada cavidade de armazenamento do cartucho e a 37 ° C sem CO 2 um dia antes das medições.
  2. Medidas de OCR em tempo real
    1. Colheita moDCs e ressuspender cada tipo de moDCs em meio de OCR a uma concentração de 60 x 10 3 por 150 ul de meio de OCR.
    2. Semente de 60 x 10 3 células / poço numa placa de 96 poços de fundo plano de poli-D-lisina-revestidas e incubar numa incubadora sem CO 2 durante 1 hora a 37 ° C. Tome nota para usar 50 jil de 50 ng / ml de poli-D-lisina para revestir a placa durante 1 hora e lava-se comágua estéril. Mantenha a placa seca durante 2 horas à temperatura ambiente antes do uso.
    3. Pipeta meio de OCR 25 ul em porta de injeção A para todos os poços; médio OCR 25 ul contendo 16 mM de oligomicina na porta de injeção B para todos os poços; médio OCR 25 l contendo 4,5 M de (FCCP) em injeção de porta C para todos os poços e 25 de médio OCR l contendo rotenona 10 mM / antimicina A na porta de injeção D para todos os poços. Note-se que a concentração final é bem para oligomicina 2 uM, FCCP é de 0,5 | iM e rotenona / antimicina A é 1 uM.
    4. Coloque placa no analisador de fluxo extracelular e executar um estudo de OCR completo com todos os moDCs simultaneamente em quatro etapas consecutivas: respiração basal (após a injeção meio do canal A), a inibição V complexo mitocondrial (após a injeção de drogas do porto B), a indução respiração máxima (depois injeção de drogas do porto C) e inibição da cadeia de transporte de elétrons (depois de droga a partir da porta D) 22. Tome nota de que existem 3 cycles entre injeções e 6 min de intervalo entre as medições.
  3. Medidas eCar em tempo real
    1. Colheita moDCs e ressuspender cada tipo de moDCs em ECAR meio a uma concentração de 60 x 10 3 por 150 ul de meio ECAR.
    2. Semente de 6 x 10 4 células / poço numa placa de 96 poços de fundo plano de poli-D-lisina-revestidas e incubar numa incubadora sem CO 2 durante 1 hora a 37 ° C.
    3. Pipeta meio ECAR 25 ul em porta de injeção A para todos os poços; médio ECAR 25 ul contendo 10 mM de glicose na porta de injeção B para todos os poços; forma ECAR 25 ul contendo 18 uM de oligomicina na porta de injecção C durante todos os poços e 25 uL meio de OCR contendo 1,000 mM de 2-desoxi-D-glicose em D porta de injecção para todos os poços. Note-se que a concentração final de glucose é bem para 10 uM, oligomicina é de 2 ^ M e 2-desoxi-D-glucose é de 100 mm.
    4. Coloque placa no analisador de fluxo extracelular e executar umestudo completo ECAR com todos moDCs simultaneamente em quatro etapas consecutivas: respiração basal (após a injeção meio do canal A), a indução glicólise (após a injeção de drogas do porto B), a indução glicólise máxima (após a injeção de drogas do porto C) e inibição da glicólise (depois droga a partir da porta D) 22.
    5. Analisar diferenças estatisticamente usando ANOVA de uma via com uma comparação múltipla pós-teste de Tukey.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Purificação de Monócitos e dendrítico Diferenciação Celular

Os monócitos foram purificados a partir de PBMC por centrifugação de densidade de sangue periférico (Figura 1A), seguido por células CD14 + de separação de selecção positiva magnética (Figura 1B) e cultivadas em meio completo na presença de GM-CSF e IL-4 para se obter as células dendríticas imaturas ( A Figura 2A). A adição de vitamina D3 e dexametasona pós GM-CSF e IL-4 resultou na diferenciação de moDCs imaturos em moDCs tolerogénicas (Figura 2B). LPS foi adicionado para induzir a maturação de moDCs imaturos para amadurecer moDCs (Figura 2C) e moDCs tolerogénicos foram estimuladas com LPS para verificar a resistência à maturação (Figura 2D). As amostras de sangue utilizadas neste trabalho foram obtidas de doadores saudáveis ​​com anterior informadasconsentimento.

moDC Caracterização

Marcador de superfície A caracterização por Citometria de Fluxo

Análise dos marcadores de superfície DC mostraram que moDCs maduros expressaram os níveis mais elevados de marcadores de maturação HLA-DR, CD83 e CD86 em comparação com moDCs tolerogénicos tratadas com LPS, moDCs tolerogénicos e moDCs imaturas (figura 3). Estes resultados demonstraram que moDCs tolerogénicos eram resistentes a maturação em comparação com moDCs imaturos após a estimulação com LPS. Além disso, LPS-tratadas moDCs tolerogênicas e moDCs tolerogênicas exibido aumento da expressão de CD14, BDCA3 (CD141) e transcrição do tipo imunoglobulina (ILT) 3 em comparação com moDCs imaturos e maduros. Os moDCs tolerogênicas que geramos aqui é consistente com relatórios anteriores 23.

Caracterização funcional de moDCs

moDCs induzidas para se tornar imunogénica maturação e libertação de citocinas que promovem a proliferação de células-T CD4 +. Foi avaliada a imunogenicidade dos diferentes subtipos moDC medindo a proliferação de células T em co-cultura. MoDCs tolerogénico eram fracamente imunogénica quando comparada com moDCs maduros, como mostrado por baixo alloproliferation de células T CD4 + (Figura 4A). MoDCs tolerogénico são caracterizadas pelo seu baixo IFN-Γ, baixo IL-12p40 e IL-10 de alta produção de citocinas em alloreaction co-culturas com células T CD4 + (Figura 4B). Além disso, aloespecifica aumentando o número de moDCs tolerogênicas em co-culturas de moDCs maduros induzida células-T CD4 + aumentou a freqüência de alta Foxp3 + células T reguladoras CD25 (Figura 4C).

Análise da atividade mitocondrial

Red CMXRos é usado para refletir a atividade mitocondrial para analisar os níveis de potencial de membrana mitocondrial em moDCs. MoDCs tolerogénico foram observados para ter uma maior actividade mitocondrial em comparação com os outros subtipos moDC diferenciadas (Figura 5A). Em seguida, a taxa de consumo de oxigénio mitocondrial (OCR) é avaliado para os diferentes subtipos moDC usando um Bioanalyzer. medições de OCR permitem percepções de alta resolução para o perfil metabólico, proporcionando informações, incluindo mas não limitado a respiração basal, capacidade respiratória de reposição, vazamento de prótons e respiração não-mitocondrial. A medição de OCR fornece um meio para avaliar a capacidade das células para responder ao stress. As células são metabolicamente perturbado pela adição de três compostos diferentes em sucessão. A primeira injecção é Oligomycin (ATP acoplador) que inibe complexo V da cadeia de transporte de elétrons (ETC), inibir a síntese de ATP. Esta etapa diferencia a percentagem de oxigénio consumido para a síntese de ATP e o percentagem de oxigénio consumida para vencer vazamento de protões através da membrana mitocondrial interna. A segunda injecção é FCCP (ETC acelerador), que interrompe a síntese do ATP através do transporte de iões hidrogénio através da membrana mitocondrial em vez de através do canal de protões de V. Complexo O colapso do potencial de membrana mitocondrial leva a um rápido consumo de oxigénio e de energia, sem a geração de ATP. FCCP tratamento pode ser utilizado para calcular a capacidade respiratória de reposição de células. Manutenção da capacidade respiratória de reposição sob condições de estresse é fundamental para a sobrevivência da célula. Esta capacidade é determinada por vários factores, incluindo a disponibilidade do substrato e a capacidade funcional das enzimas envolvidas na ETC. A terceira injecção é uma combinação de rotenona, um Complex I de inibidor, e antimicina A, um inibidor de Complexo III. Esta combinação é desligado e a respiração mitocondrial OCR é observado para diminuir como resultado da deficiência da função mitocondrial (Figura 5C). MoDCs tolerogénico apresentaram níveis basais mais elevados do que OCR moDCs maduros (Figura 5D). Além disso, tolerogênico, LPS-tolerogênico e moDCs imaturos mostraram aumento da capacidade respiratória de reposição comparação com moDCs maduros (Figura 5E).

Caracterização metabólica dos moDCs

Porque o ácido láctico e protões são libertados a partir de células durante a glicólise, analisou-se a actividade glicolítica dos moDCs através da realização de uma análise em tempo real da taxa de acidificação extracelular (ECAR) (Figura 6B). Na presença de glicose, a taxa de todas as glicolítica moDCs aumentada em comparação com a fase basal, commoDCs maduras que exibem maior taxa glicolítica que moDCs imaturas (Figura 6D). Tolerogénico e moDCs imaturos exibiu maior glicólise máxima (induzida por oligomicina na presença de glucose), em comparação com moDCs-tratados com LPS (Figura 6B). A capacidade glicolítica dos moDCs tolerogênicas e imaturas foi superior moDCs maduros (Figura 6E). Em contraste com sua alta taxa glicolítica, reserva glycolytic foi o mais baixo em moDCs maduros (Figura 6F).

Diagrama de centrifugação para isolamento de PBMC, incubação de microesferas CD14, separação de células magnéticas.
Figura 1:. Purificação de monócitos do sangue periférico (A) 25 ml de sangue são cuidadosamente em camadas sobre 15 ml de Ficoll por tubo de 50 ml antes da centrifugação. PBMC estão concentradas numa camada abaixo plasma após centrifugação de densidade. (PBMC B) são incubadas com microesferas que estão conj ugated a anticorpos monoclonais CD14 humanos (isotipo: IgG2a de ratinho). e, em seguida carregada numa coluna que é colocado no campo magnético de um separador para isolar monócitos CD14 + Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Comparação morfológica de moDCs imaturos, tolerogênicos, maduros e tolerogênicos a LPS, imagem de microscópio.
Figura 2: Caracterização morfológica de moDCs. (A) a 200 ng / ml de GM-CSF e IL-4 é adicionado a monócitos CD14 + purificadas no dia 0, 4 e 6 para gerar moDCs imaturos; e (B) um passo adicional de estimulação com 100 nM de vitamina D3 e dexametasona 10 nM no Dia 5 gera moDCs tolerogénicos. MoDCs imaturos e moDCs tolerogênicas são estimuladas com 1 ug / ml de LPS no dia 6 de gerar (C) amadurecer moDCs e moDCs (D) LPS-tolerogênicas.ttps: //www.jove.com/files/ftp_upload/54128/54128fig2large.jpg "target =" _ blank "> Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

O gráfico de citometria de fluxo exibe a expressão de proteínas em células imunes; inclui marcadores HLA-DR, CD80-86.
Figura 3:. Superfície marcador Caracterização por citometria de fluxo Os níveis de expressão de marcadores de superfície de HLA-DR, CD80, CD83, CD86, CD11, CD14, BDCA3 e LT3 em tolerogénico (verde), LPS-tolerogénicas (preto), imatura (vermelho), madura (azul) moDCs. controles isotípicos são mostradas em cinza. histograma individual para cada tipo de célula é plotado com contagem de células do eixo Y contra o registro do eixo X da intensidade do fluoróforo e os cobriu. Todos os histogramas são representativos de quatro experiências independentes. Este valor foi modificado a partir do J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 de junho, 2015). Reproduzidos e reproduzido com permissão de direitos de autor. Direitos de autor 2015. A Associação Americana deImunologistas, Inc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Gráficos de resposta proliferativa de células T CD4+; efeito de concentração de moDC; análise de modulação imunológica.
Figura 4: Caracterização funcional de moDCs. (A) Quantificação de frequência alloproliferation de células T CD4 + induzidas por co-cultura com números crescentes de tolerogénico (TOL; verde), LPS-tolerogénico (L-TOL; preto), imatura (IMM; vermelho) e maduro (MAT ; azul) moDCs. Os dados foram reunidos a partir de quatro experiências independentes; média + SEM diferenças estatísticas entre todos os moDCs contra moDCs maduros foram analisados ​​por ANOVA de duas vias com Dunnett comparação múltipla pós-teste. (B) Análise de citocinas de IFN-Γ (painel esquerdo), IL-12p40 (painel do meio) e Il- 10 (painel da direital) em sobrenadantes de alloreactions entre CD4 + células-T co-cultivadas com um número crescente de qualquer tolerogênico (verde), imaturo (vermelho) ou azul) moDCs (maduros. Os dados foram reunidos a partir de seis experiências independentes; média ± SEM alloproliferation de células T (C) células T CD4 + e regulador de expansão de células T induzida por co-cultura com moDCs maduros na presença de um número crescente de moDCs tolerogénicos. Esquerda do eixo Y, a frequência da proliferação de células T CD4 +. Direito do eixo Y, a frequência de CD25 alta Foxp3 + células fechadas nas células T CD4 + proliferativa. Os dados foram reunidos a partir de três experiências independentes; significa ± SEM diferenças estatísticas entre presença contra ausência de moDCs tolerogênicas foram analisados ​​por ANOVA de uma via com Dunnett comparação múltipla pós-teste. (D) alloproliferation de células T CD4 + (esquerda) e frequência de células CD25highFoxP3 + (Direito) induzida por co- cultura com moDCs tolerogénicosna presença de um número crescente de moDCs maduros. Os dados foram reunidos a partir de duas a três experiências independentes; significa ± SEM diferenças estatísticas entre a presença contra ausência de moDCs maduros foram analisados ​​por ANOVA de duas vias com Dunnett comparação múltipla pós-teste. Este valor foi modificado a partir do J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 de junho, 2015). Reproduzidos e republicado com copyright permissão. Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise da respiração celular: gráficos de barras, gráfico de linhas de OCR, MFI, mitocôndrias, SRC, inibidores.
Figura 5: Análise de Actividade mitocondrial de moDCs. (A) Níveis de potencial de membrana mitocondrial (Red CMXRos) em moDCs foram obtidos por fanálise baixo citometria. Os dados de quatro experiências independentes foram reunidas. Média ± SEM (B) Representação esquemática de uma respiração mitocondrial em tempo real. análise OCR a partir de respiração basal e após a adição de oligomicina (inibição complexo V), FCCP (indução máxima da respiração), e rotenona / antimicina A mistura (cadeia de transporte de electrões inibição [etc.]). O SRC (basal máxima subtraída da respiração máxima) mitocondrial é derivado a partir da curva de OCR. (C) estudo cinético representativas das mitocôndrias OCR (pmol / min) em tolerogénico (TOL, verde), LPS-tolerogénico (L-TOL, preto) , imaturo (IMM, vermelho) e maduro (MAT, azul) moDCs usando adição sequencial de oligomicina (Olig), FCCP, e rotenona / antimicina A (Rot-AA). (D) OCR quantificação da respiração basal de moDCs e ( E) sobra capacidade respiratória de moDCs. Os dados foram reunidos a partir de cinco experiências independentes. A média ± SEM. Este valor foi modificado a partir do J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (1 de junho, 2015). Reproduzidos e republicado com copyright permissão. Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Análise de equilíbrio estático; Gráfico ECAR; experimento de glicólise; processos metabólicos.
Figura 6: Caracterização metabólica de moDCs. (A) Representação esquemática da glicólise em tempo real. análise ECAR ECAR começa a partir da base, em que as células foram incubadas em meio isento de glucose, seguido pela adição de glicose (indução glicólise), oligomicina (que induz a glicólise celular máxima e inibição complexo V), e, finalmente, 2-desoxi-D- glicose(Inibição da glicólise). Taxa glicolítica (indução glicólise subtraído para ECAR basal), capacidade glicolítica (glicólise máxima subtraído para ECAR basal), e reserva glicolítica (glicólise máxima subtraído para a indução da glicólise) são derivados a partir da curva ECAR. (B) estudo cinético representativas de-glicólise dependente ECAR (mPH / min) em tolerogênico (TOL, verde), LPS-tolerogênico (L-TOL, preto), imaturo (IMM, vermelho), e amadurecer (MAT, azul) moDCs usando adição sequencial de glicose (Gluc), oligomicina (Olig), e 2-DG. Bares (C) mostram níveis eCar basais (D) taxa glicolítica (e) de capacidade glicolítica, e (f) reserva de glycolytic de moDCs. Os dados foram reunidos a partir de três experiências independentes; significa 6 SEM. As diferenças estatísticas foram analisadas por ANOVA de uma via com uma comparação múltipla pós-teste de Tukey. Este valor foi modificado a partir do J Immunol 194 (11), 5174-5186, doi: 10,4049 / jimmunol.1303316 (01 de junho de 2015). Reproduzidos e republicado com copyright permissão. Direitos de autor 2015. A Associação Americana de imunologistas, Inc. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este artigo descreve um método para gerar a partir de monócitos moDCs imaturos, moDCs tolerogênicas e moDCs maduros. As etapas importantes neste protocolo são discutidos em detalhe nos parágrafos seguintes. É importante notar que o sangue periférico humano é usado como um material de partida neste protocolo e precauções universais para o manuseamento de sangue humano deve ser praticada. Embora seja tecnicamente viável para derivar DCs de medula óssea em seres humanos 24, a diferenciação in vitro de DC células encontradas no sangue periférico é o preferido devido à disponibilidade de sangue periférico em relação à medula óssea. Entre as células encontradas no sangue periférico, células e monócitos CD34 + hematopoiéticas estaminais são normalmente usados ​​para a geração in vitro de DCs. CD34 hematopoiético + stem células são cultivadas com GM-CSF e TNF-α para derivar subconjuntos CD1a + e CD14 +, que são então ainda mais diferenciado em Langerhanscomo as células dendríticas e as células. Por outro lado, os monócitos são cultivados em GM-CSF e IL-4 para gerar moDCs imaturos. Vários protocolos são utilizados para o enriquecimento de monócitos de sangue periférico; por exemplo, por aderência a placas de plástico, de elutriação e kits de isolamento 25, 26 As vantagens do protocolo de adesão são mínimo de danos às células e de custo relativamente eficaz no entanto célula pureza pode ser comprometida.; e um passo extra é necessária para separar as células para outras experiências. Elutriação é uma técnica que separa as células com base no seu tamanho e densidade. As vantagens da elutriação e a viabilidade celular são monócitos pode ser prontamente utilizado para outras experiências; No entanto, esta técnica é limitada pela disponibilidade de um elutriator e a incapacidade para separar diferentes populações de células (células T e monócitos) com parâmetros de sedimentação semelhantes. Comercialmente kits de isolamento disponíveis utilizam microesferas magnéticas para selecionar positiva ouseleccionar negativamente a população de monócitos. Alguns protocolos são desviadas para o isolamento de monócitos usando a seleção negativo como os monócitos isolados permanecem "intocados" (não vinculados por marcadores ou microesferas). Neste protocolo, contas CD14 foram usadas para monócitos humanos selecione positivos de PBMC. CD14 não tem um domínio citoplásmico e a ligação do anticorpo a CD14 não desencadear a transdução de sinal. Além disso, as microesferas irá separar a partir de monócitos após a cultura e, portanto, não impede o processo de diferenciação. Além disso, o CD14 é expresso na maior parte dos monócitos fortemente e fracamente nos neutrófilos e algumas células dendríticas mielóides, por conseguinte, este método de resultados de isolamento na pureza mais elevada de células do que os outros métodos 17.

monócitos de sangue podem ser diferenciadas em DCs ou macrófagos e o destino de monócitos depende grandemente do ambiente de citocinas. Neste trabalho, moDCs são gerados pela adição de fator estimulante de colônias de granulócitos e macrófagos (GM-CSF) E interleucina 4 (IL-4) para os monócitos de sangue periférico humano. GM-CSF é necessária para a sobrevivência dos monócitos e IL-4 exerce uma actividade inibidora sobre a diferenciação de macrófagos; e a adição combinatória de GM-SCSF e IL-4 para os monócitos produzem uma percentagem mais elevada de moDCs imaturas em comparação com citocinas individuais 27. Há outros protocolos que geram moDCs por adição de factor de necrose tumoral alfa (TNF-α), interferon alfa (IFN-α) e interleucina 13 (IL-13) para os monócitos de sangue periférico 28, 29, 30. A combinação de GM-CSF e IL-4 foi otimizado na década de 1990 e agora um protocolo aceite que gera DCs imaturas plástico diferenciadas em moDCs imunogénicas ou tolerogênicas e polarizada em Th1, Th2 ou Th17 moDCs promovendo.

moDCs imaturas são diferenciadas em moDCs tolerogénicos pela adição de vitamina D3 e dexametasona. Existem vários protocolos para gerar DCs tolerogénicos por exemplo, atravésfactor nuclear kappa B (NF-kB) inibição, activação β-catenina, vitamina D3, dexametasona e Rapamicina 31, 32, 33, 34, 35, 9, 36, 37. Embora tanto a vitamina D3 e dexametasona foram relatados para induzir um efeito tolerogénico em DCs, a combinação de vitamina D3 e dexametasona em resultado de uma maior supressão da alloproliferation do que quando são usadas drogas individuais. Portanto, o protocolo existente para a geração de DCs tolerogénico foi modificada para uma combinação de vitamina D3 e dexametasona. Este método está sendo aceito como um modelo para DCs tolerogênicas humanos com uma utilidade terapêutica. É também importante notar que a vitamina D3 e dexametasona reconstituída tem uma vida útil curta.

Neste protocolo, lipopolissacáridos (LPS) foi adicionada como um indutor de maturação de DC. moDCs imaturos também pode ser induzida a maturação utilizando cocktail pró-inflamatória:(TNF-α), interleucina 1 beta (IL-1β), Interleucina 6 (IL-6) e prostaglandina E2) ou citoquinas pró-inflamatórias (TNF-a e interferão gama (IFN-Γ)). Cocktail pró-inflamatórias gera moDCs maduras, com funções de alta co-estimuladoras e migratórias mas que produzem níveis relativamente baixos de IL-12 38. TNF-α ou IFN-Γ por si só não é capaz de induzir um fenótipo estável 39 dendrítica. LPS estimula o receptor semelhante a Toll 4 (RST4), medeia a activação da proteína-quinases activadas mitogénio (MAPKs) NF-kB e para induzir a maturação de CD. DC maturação induzida por LPS apresenta uma sobre-regulação de marcadores de maturação de DC (CD83, CD86, HLA-DR) e também levou à produção de IL-12p70. Além disso, esta etapa pode ser ainda modificado para emparelhar com LPS agonistas de TLR3 para produzir DCs maduras para vacinas contra o cancro clínicos. Neste trabalho, DCs tolerogênicas são mostrados para ser resistente a maturação após tratamento com LPS. Estes semi-maduros, como DCs não são imunogênico e não fazer releaSE citocinas pró-inflamatórias 40.

As limitações deste protocolo encontram-se no processo de diferenciação. O processo leva 8 dias a partir do dia 0 ao dia 7, a qual coloca uma dificuldade de ser adaptado para análises de elevado rendimento. Uma modificação do protocolo é necessário para encurtar o processo de diferenciação ainda obter números elevados de DCs viáveis ​​nos diferentes estados. Em segundo lugar, as DCs são gerados pela adição de citocinas neste protocolo e estas citocinas não sustentar a população DC por um longo período de tempo. Além disso, as citocinas são utilizadas em concentrações muito mais elevadas do que in vivo e podem resultar no desenvolvimento de vias enviesada que não são fisiologicamente idêntico ao DCs in vivo. Por exemplo, em culturas in vitro de precursores de DC foram mostradas para responder ao GM-CSF, que não é uma citocina essencial para a diferenciação normal DC in vivo 41. No entanto, a estimulação de citocinas pode ser um método útil para geneavaliar um número elevado de DC in vitro para a experimentação. A capacidade de sujeitar essas células geradas a partir deste protocolo para outras análises, como a imunofluorescência, citometria de fluxo, alo estudos de reação e estudos metabólicos aumenta a utilidade deste método. Estes DCs in vitro servir como um bom modelo para melhorar o conhecimento do desenvolvimento DC, maturação e apresentação de antígenos, que é previamente difícil de fazer com os números raros de DCs in vivo.

Capacidade DCs 'para regular a imunidade imunológica contra a tolerância torna-os candidatos atraentes na terapêutica contra o câncer e doenças auto-imunes 42, 43, 44, 45. DCs imunogénicas gerados neste protocolo pode ser utilizado para melhorar a eficácia de vacinação contra doenças infecciosas e de tumores; enquanto DCs tolerogénicos pode ser usado para controlar as respostas de células T indesejado e prevenir a rejeição após o transplante. o intrincadoequilíbrio entre a imunidade e tolerância depende imensamente sobre o estado de diferenciação DC. diferenciação DC é um programa celular coordenada que é governada por múltiplas vias de sinalização e destino metabólico. Diferentes estados de diferenciação de DC diferem em necessidades bioenergéticos e biossíntese; por exemplo, DCs activadas requerem adaptações metabólicas mais enérgicas importantes para a sobrevivência e migração em comparação com DCs em estado de repouso. É importante notar que a vitamina D3, dexametasona e rapamicina são conhecidos pela sua capacidade de induzir DCs tolerogénicos, têm sido descritas para influenciar o metabolismo DC. Neste trabalho, o metabolismo energético de moDCs de diferentes estados de diferenciação foram caracterizados usando analisadores de fluxo extracelular e moDCs tolerogênicas apresentou o maior maturação plasticidade metabólica e LPS induzida pela diminuição dessa plasticidade. Metabolismo anabólico suporta DCs maturação, enquanto influencia o metabolismo catabólicos tolerogênico DC funciona 46. as DCsgerado a partir deste protocolo pode ser usada para avaliar se a alteração do estado metabólico de DCs ser a chave para a modificação da imunidade e da tolerância em terapêutica. Em conclusão, nós apresentamos um protocolo para a geração de imaturo, tolerogênico e moDCs maduros crucial para estudar funções imunorregulatórios 'DCs.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As taxas de acesso aberto para este artigo foram fornecidas pela Agilent Technologies.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho foi financiado pela Agência de Ciência, Tecnologia e Reasearch de financiamento principal (para JEC).

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
FicollGE Healthcare17-1440-03
SeringaBecton, Dickinson302832Isolamento PBMC Tubo
de centrífuga de 1,5 mlAxygenMCT-150-CIsolamento PBMC
15 ml tubo de falcãoFalcon352096PBMC Isolamento
50 mlFalcon352070Isolamento PBMC
CentrífugaEppendorf5810RPBMC isolamento
0.2 µ filtrom Sartorius stedim biotech17597PBMC
isolamento MACs kitMiltenyi biotec130-042-201Enriquecimento de monócitos
Separador MiniMACSMiltenyi biotec130-042-102Enriquecimento de monócitos
Água de grau de cultura celularInvitrogen, Life TechnologiesCultura de células
RPMIGibco, Life Technologies11875-093Cultura de células
FBSHycloneSH30070103Cultura de células
Penicilina-estreptomicinaGibco, Life Technologies15140Cultura de células
Fosfato
Tamponado Salino		Gibco, Life Technologies10010-031Cultura de células
NEAAGibco, Life Technologies11140-040Cultura de células
EDTAGibco, Life Technologies15575Cultura de células
HEPESGibco, Life Technologies15630-080Cultura de células
Piruvato de sódioGibco, Life Technologies11360-070Cultura de células
GM-CSFMiltenyi biotec130-093-868Cultura de células
IL-4Miltenyi biotec130-093-924Cultura de células
Vitamina D3SigmaD1530Cultura de células
DexametasonaSigmaD2915Cultura de células
LPSSigmal2755Cultura de células
azul de tripanoGibco, Life Technologies15250-061Cultura de células
HLADR conjugado com PerCP BioLegend307628Citometria
CD80 BD conjugado com PEBiosciences 557227Citometria
CD83 conjugado com PE BD Biosciences556855Citometria
CD86 conjugado com PE BD Biosciences555665Citometria
CD11c conjugado com APCBD Biosciences340544Citometria
CD14 conjugado com PE Miltenyi biotec130-091-242Citometria
BDCA3 conjugada com PE Miltenyi biotec130-090-514Citometria
APC-conjugada ILT3 eBioscience12-5139-73
Citometria Isotipo combinado
PerCP- conjugado Mab BioLegend		400250Citometria
Isotipo combinado
PE- conjugado Mab		Miltenyi biotec130-091-835Citometria
Isotipo combinado
APC- conjugado Mab		Miltenyi biotec130-091-836
Citometria BD LSR II Citômetro de FluxoBD PharmingenBD LSR II Citometria
cytofix/cytopermBD BiosciencesCitometria 554714
CD25 conjugada com APC/CY7BD pharmingen557753 Citometria
CD4 conjugada com PE/CY7Citometriade 300512
com CD3 conjugada com PerCPCitometriade 300428Biolegend
Kit de enriquecimento de células T CD4+ humanasSTEMCELL Technologies19052Estudo de aloreação
Ímã EasySep STEMCELL Technologies18000Estudo de aloreação
Cell Trace Kit de proliferação de células CFSESondas molecularesC34554Estudo de aloreação
HBSSGibco, LifeTechnologies 14025092Estudo de aloreação
Alexa Fluor 647-conjugado FoxP3BD Biosciences560889
Milliplex MAP Human
Citocina/Quimiocina
painel magnético		MilliporeHCYTOMAG-60KAnálise de citocinas
5 ml Tubo de poliestirenoFalcon352058Análise de citocinas
Fluido de bainha Luminex MilliporeSHEATHFLUIDAnálise de citocinas
Sistema FLEXMAP 3D com software xPONENTLuminex CorporationFLEXMAP 3DAnálise de citocinas
MitoTracker Red CMXRosCell Signalling9082Atividade mitocondrial
DMSOSigma AldrichD2650Atividade mitocondrial
XF Meio de ensaio (OCR)Cavalo-marinho Biociência102352-000Adaptação metabólica
Glicose Sigma AldrichG8769Adaptação metabólica
XF Base Medium (ECAR)Seahorse Bioscience102353-100Adaptação metabólica
L-glutaminaGibco, Life Technologies25030-081Adaptação metabólica
CalibrantSeahorse Bioscience100840-000 Adaptação metabólica
Kit de Estresse Mito Cell XFSeahorse Bioscience103015-100Adaptação metabólica
Kit de Estresse de Glicólise XFSeahorse Bioscience103020-100Adaptação metabólica
Seahorse Cavalo-marinho BioscienceXFe96Adaptação metabólica
de isolamento PBMC de

Referências

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,
  1. Jolles, S. Paul Langerhans. J Clin Pathol. 55 (4), 243-24 (2002).
  2. Steinman, R. M., Cohn, Z. A. Identification of a novel cell type in peripheral lymphoid organs of mice. I. Morphology, quantitation, tissue distribution. J Exp Med. 137 (5), 1142-1162 (1973).
  3. Steinman, R. M., Swanson, J. The endocytic activity of dendritic cells. J Exp Med. 182 (2), 283-288 (1995).
  4. Hemmi, H., Akira, S. TLR signalling and the function of dendritic cells. Chem Immunol Allergy. 86, 120-135 (2005).
  5. Mueller, D. L. Mechanisms maintaining peripheral tolerance. Nat Immunol. 11 (1), 21-27 (2010).
  6. Inaba, K., et al. Efficient presentation of phagocytosed cellular fragments on the major histocompatibility complex class II products of dendritic cells. J Exp Med. 188 (11), 2163-2173 (1998).
  7. Caux, C., et al. B70/B7-2 is identical to CD86 and is the major functional ligand for CD28 expressed on human dendritic cells. J Exp Med. 180 (5), 1841-1847 (1994).
  8. Paavonen, J., Lehtinen, M. Interactions between human papillomavirus and other sexually transmitted agents in the etiology of cervical cancer. Curr Opin Infect Dis. 12 (1), 67-71 (1999).
  9. Ohtani, M., et al. Mammalian target of rapamycin and glycogen synthase kinase 3 differentially regulate lipopolysaccharide-induced interleukin-12 production in dendritic cells. Blood. 112 (3), 635-643 (2008).
  10. Wilde, B., et al. Dendritic cells in renal biopsies of patients with ANCA-associated vasculitis. Nephrol Dial Transplant. 24 (7), 2151-2156 (2009).
  11. Al-Hello, H., et al. An enterovirus strain isolated from diabetic child belongs to a genetic subcluster of echovirus 11, but is also neutralised with monotypic antisera to coxsackievirus A9. J Gen Virol. 89, 1949-1959 (2008).
  12. Ziegler-Heitbrock, L., et al. Nomenclature of monocytes and dendritic cells in blood. Blood. 116 (16), 74-80 (2010).
  13. Osugi, Y., Vuckovic, S., Hart, D. N. Myeloid blood CD11c(+) dendritic cells and monocyte-derived dendritic cells differ in their ability to stimulate T lymphocytes. Blood. 100 (8), 2858-2866 (2002).
  14. Reynolds, G., Haniffa, M. Human and Mouse Mononuclear Phagocyte Networks: A Tale of Two Species. Front Immunol. 6, (2015).
  15. Jefford, M., et al. Functional comparison of DCs generated in vivo with Flt3 ligand or in vitro from blood monocytes: differential regulation of function by specific classes of physiologic stimuli. Blood. 102 (5), 1753-1763 (2003).
  16. Menck, K., et al. Isolation of human monocytes by double gradient centrifugation and their differentiation to macrophages in teflon-coated cell culture bags. J Vis Exp. (91), (2014).
  17. Zhou, L., et al. Impact of human granulocyte and monocyte isolation procedures on functional studies. Clin Vaccine Immunol. 19 (7), 1065-1074 (2012).
  18. Menon, V., Thomas, R., Ghale, A. R., Reinhard, C., Pruszak, J. Flow cytometry protocols for surface and intracellular antigen analyses of neural cell types. J Vis Exp. (94), (2014).
  19. Faresjo, M. A useful guide for analysis of immune markers by fluorochrome (Luminex) technique. Methods Mol Biol. 1172, 87-96 (2014).
  20. Baker, H. N., Murphy, R., Lopez, E., Garcia, C. Conversion of a capture ELISA to a Luminex xMAP assay using a multiplex antibody screening method. J Vis Exp. (65), (2012).
  21. Defawe, O. D., et al. Optimization and qualification of a multiplex bead array to assess cytokine and chemokine production by vaccine-specific cells. J Immunol Methods. 382 (1-2), 117-128 (2012).
  22. Nicholls, D. G., et al. Bioenergetic profile experiment using C2C12 myoblast cells. J Vis Exp. (46), (2010).
  23. Chunharas, A., Pabunruang, W., Hongeng, S. Congenital self-healing Langerhans cell histiocytosis with pulmonary involvement: spontaneous regression. J Med Assoc Thai. 85, 1309-1313 (2002).
  24. Bai, L., Feuerer, M., Beckhove, P., Umansky, V., Schirrmacher, V. Generation of dendritic cells from human bone marrow mononuclear cells: advantages for clinical application in comparison to peripheral blood monocyte derived cells. Int J Oncol. 20 (2), 247-253 (2002).
  25. Felzmann, T., et al. Monocyte enrichment from leukapharesis products for the generation of DCs by plastic adherence, or by positive or negative selection. Cytotherapy. 5 (5), 391-398 (2003).
  26. Berger, T. G., et al. Efficient elutriation of monocytes within a closed system (Elutra) for clinical-scale generation of dendritic cells. J Immunol Methods. 298 (1-2), 1-2 (2005).
  27. Sallusto, F., Lanzavecchia, A. Efficient presentation of soluble antigen by cultured human dendritic cells is maintained by granulocyte/macrophage colony-stimulating factor plus interleukin 4 and downregulated by tumor necrosis factor alpha. J Exp Med. 179 (4), 1109-1118 (1994).
  28. Pace, S. T., Gelman, B. B., Wong, B. R. Primary Langerhans cell histiocytosis of the lacrimal gland in an adult. Can J Ophthalmol. 50 (3), 40-43 (2015).
  29. Ravanfar, P., Wallace, J. S., Pace, N. C. Diaper dermatitis: a review and update. Curr Opin Pediatr. 24 (4), 472-479 (2012).
  30. Gebhardt, C., et al. A case of cutaneous Rosai-Dorfman disease refractory to imatinib therapy. Arch Dermatol. 145 (5), 571-574 (2009).
  31. Vazquez, P., Robles, A. M., de Pablo, F., Hernandez-Sanchez, C. Non-neural tyrosine hydroxylase, via modulation of endocrine pancreatic precursors, is required for normal development of beta cells in the mouse pancreas. Diabetologia. 57 (11), 2339-2347 (2014).
  32. Pellacani, G., et al. Distinct melanoma types based on reflectance confocal microscopy. Exp Dermatol. 23 (6), 414-418 (2014).
  33. Shi, Y., et al. Hepatic involvement of Langerhans cell histiocytosis in children--imaging findings of computed tomography, magnetic resonance imaging and magnetic resonance cholangiopancreatography. Pediatr Radiol. 44 (6), 713-718 (2014).
  34. Haustein, M., Terai, N., Pablik, J., Pillunat, L. E., Sommer, F. Therapy-resistant swelling of the upper eyelid in childhood. Ophthalmologe. 111 (1), 53-57 (2014).
  35. Haidinger, M., et al. A versatile role of mammalian target of rapamycin in human dendritic cell function and differentiation. J Immunol. 185 (7), 3919-3931 (2010).
  36. Macedo, C., Turquist, H., Metes, D., Thomson, A. W. Immunoregulatory properties of rapamycin-conditioned monocyte-derived dendritic cells and their role in transplantation. Transplant Res. 1 (1), 16(2012).
  37. Fischer, R., Turnquist, H. R., Taner, T., Thomson, A. W. Use of rapamycin in the induction of tolerogenic dendritic cells. Handb Exp Pharmacol. 188 (188), 215-232 (2009).
  38. Nicolette, C. A., et al. Dendritic cells for active immunotherapy: optimizing design and manufacture in order to develop commercially and clinically viable products. Vaccine. 25, 47-60 (2007).
  39. Han, T. H., et al. Evaluation of 3 clinical dendritic cell maturation protocols containing lipopolysaccharide and interferon-gamma. J Immunother. 32 (4), 399-407 (2009).
  40. Paananen, A., et al. Molecular and biological analysis of echovirus 9 strain isolated from a diabetic child. J Med Virol. 69 (4), 529-537 (2003).
  41. HC, O. N., Wilson, H. L. Limitations with in vitro production of dendritic cells using cytokines. J Leukoc Biol. 75 (4), 600-603 (2004).
  42. Mest, H. J., et al. Glucose-induced insulin secretion is potentiated by a new imidazoline compound. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol. 364 (1), 47-52 (2001).
  43. Puc, J., et al. Mitochondrial activity after cold preservation of pancreatic islet cells treated with pefloxacin (PFX). Ann Transplant. 3 (1), 38-41 (1998).
  44. Alarcon, C., Serna, J., Perez-Villamil, B., de Pablo, F. Synthesis and differentially regulated processing of proinsulin in developing chick pancreas, liver and neuroretina. FEBS Letters. 436 (3), 361-366 (1998).
  45. Jekunen, A. P., Kairemo, K. J., Paavonen, T. Imaging of Hand-Schuller-Christian syndrome by a monoclonal antibody. Clin Nucl Med. 22 (11), 771-774 (1997).
  46. Pearce, E. J., Everts, B. Dendritic cell metabolism. Nat Rev Immunol. 15 (1), 18-29 (2015).

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