Artigo de método

FRET Imaging no hidrogéis tridimensionais

DOI:

10.3791/54135

⸱

1 de agosto de 2016

 ,  , 
1Department of Oral Biology, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 2Department of Bioengineering, Center for Craniofacial Regeneration, McGowan Institute of Regenerative Medicine, University of Pittsburgh, 3Laerdal AS

* These authors contributed equally

Neste artigo

Resumo

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A imagem de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta poderosa para estudos de biologia celular em tempo real. Aqui é apresentado um método para imagens de células FRET em microambientes fisiológicos de hidrogel tridimensional (3D) usando microscopia de epifluorescência convencional. Uma análise para sondas FRET raciométricas que produz razões lineares ao longo da faixa de ativação é descrita.

Resumo

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

A imagem da transferência de energia de ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta poderosa para examinar a biologia celular em tempo real. Estudos que utilizam FRET geralmente empregam cultura bidimensional (2D), que não imita o microambiente celular tridimensional (3D). Um método para realizar imagens FRET de emissão extinta usando microscopia convencional de epifluorescência de campo amplo de células dentro de um ambiente de hidrogel 3D é apresentado. Aqui é descrito um método de análise para sondas FRET raciométricas que produz razões lineares ao longo da faixa de ativação da sonda. A medição dos níveis intracelulares de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) é demonstrada em condrócitos sob estimulação de forscolina usando uma sonda para ativação de EPAC1 (ICUE1) e a capacidade de detectar diferenças na sinalização de cAMP dependendo do tipo de material de hidrogel, aqui um hidrogel de fotoreticulação (PC-gel, polietilenoglicol dimetacrilato) e um hidrogel termorresponsivo (TR-gel). Comparado com os métodos 2D FRET, esse método requer pouco trabalho adicional. Os laboratórios que já utilizam imagens FRET em 2D podem facilmente adotar esse método para realizar estudos celulares em um microambiente 3D. Pode ainda ser aplicado à triagem de medicamentos de alto rendimento em microtecidos 3D projetados. Além disso, é compatível com outras formas de imagem FRET, como medição de anisotropia e imagem de tempo de vida de fluorescência (FLIM), e com plataformas avançadas de microscopia usando iluminação confocal, pulsada ou modulada.

Introdução

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A sinalização celular é complexa e consequente para vários campos, incluindo farmacologia, engenharia de tecidos e medicina regenerativa. Ferramentas investigativas úteis são necessárias para aprofundar nossa compreensão da biologia celular e desenvolver materiais ideais para a regeneração de tecidos. A imagem de transferência de energia por ressonância de Förster (FRET) é uma ferramenta essencial que permite a análise da ativação do receptor, conformação molecular e interações supramoleculares (por exemplo, complexação de proteína/DNA) em células vivas. FRET é um tipo de transferência de energia não radiativa entre fluoróforos1. Tem uma eficiência inversamente proporcional à sexta potência da distância entre um fluoróforo doador e um fluoróforo aceptor. Assim, ele pode fornecer informações sobre a distância espacial entre duas moléculas diferentes ou entre regiões de uma molécula na escala nanométrica (normalmente 1 - 10 nm)2. Os fluoróforos doadores e aceptores podem ser de diferentes tipos de moléculas (hetero-FRET), nos quais o doador tem a maior emissão de energia (menor comprimento de onda), ou do mesmo tipo (homo-FRET). A imagem FRET pode ser realizada em células fixas ou vivas, mas, em geral, as células fixas são usadas para imagens de interações moleculares em alta resolução espacial quando os sistemas confocais de alta velocidade não estão disponíveis. As células vivas são usadas para estudar interações e processos que são inibidos ou alterados pela fixação, como a resposta de sinalização intracelular em tempo real3.

Estudos de células vivas que empregam imagens FRET usam culturas celulares bidimensionais (2D) em parte devido à simplicidade e menor fundo (sem emissão de células fora do plano). No entanto, as culturas 2D também alteram vários processos celulares em comparação com o microambiente fisiológico e a cultura tridimensional (3D)4,5. Por exemplo, as interações célula a célula nativa e célula a matriz extracelular são drasticamente alteradas na cultura 2D, levando a mudanças facilmente observadas na morfologia e polaridade celular6. Os microdomínios da membrana (por exemplo, cavéolas e jangadas lipídicas) e a sinalização do receptor são fortemente regulados pelo ambiente de cultura, em parte porque se ligam aos componentes do citoesqueleto7,8 e a forma da célula e a estrutura do citoesqueleto são fortemente reguladas pelo ambiente de cultura espacial9. A mecanotransdução não é apenas influenciada pela matriz 3D, mas pelas condições de carga secundária mais complexas geradas em ambientes 3D em comparação com culturas 2D10. Finalmente, a permeabilidade das matrizes 3D é menor que a do meio de cultura, em geral com diminuição da difusão e aumento da ligação das moléculas de sinalização celular em comparação com as culturas 2D. Com as culturas 3D, é possível criar e observar um microambiente mais semelhante ao fisiológico no que diz respeito a pistas adesivas, químicas e mecânicas. As interações célula a célula podem ser promovidas e as propriedades adesivas podem ser controladas com a estrutura, composição e arquitetura (padronização) do material 3D11-13. As propriedades mecânicas do material também podem ser adaptadas pela composição e estrutura14,15. A cultura de células em hidrogéis, portanto, permite estudos de FRET em células primárias que, de outra forma, se desdiferenciariam ou mudariam de fenótipo usando técnicas convencionais, por exemplo, células da cartilagem articular. Assim, é necessário um método para permitir ensaios FRET em culturas 3D vivas.

Os andaimes de hidrogel são ideais para estudos baseados em FRET 3D porque podem ser feitos opticamente transparentes e adaptados para controlar o microambiente e fornecer pistas celulares. Hidrogéis feitos de polímeros naturais têm sido usados em cultura de células há décadas, incluindo gelatina e fibrina16. Maior controle sobre o microambiente celular pode ser alcançado com a modificação química desses polímeros e com o uso de polímeros sintéticos17,18. A rigidez mecânica e a permeabilidade do hidrogel podem ser controladas alterando sua composição polimérica e tamanho da malha (densidade do polímero e da reticulação)19,20. Além disso, os hidrogéis podem se tornar bioativos por meio da incorporação de fatores de crescimento e ligantes celulares. Devido a essas possibilidades, o desenvolvimento de hidrogéis para aplicações de biossensoriamento, administração de medicamentos e engenharia de tecidos é uma área de pesquisa muito ativa21. A impressão 3D de hidrogéis também está em desenvolvimento para a fabricação de microtecidos e órgãos15. Assim, a imagem FRET de células em hidrogéis não é apenas útil como um meio de aproximar o comportamento celular fisiológico, mas também como uma ferramenta para estudar e otimizar o crescimento de tecidos projetados.

As sondas FRET raciométricas binárias são muito úteis no estudo da sinalização celular e podem ser utilizadas em culturas de hidrogel. Para obter uma lista parcial de sondas fluorescentes e FRET publicadas, consulte o site do Cell Migration Consortium22. O tipo de sonda mais comum contém dois fluoróforos diferentes que estão associados ou ligados por um elemento de reconhecimento (região) sensível ao analito. Essas regiões sofrem uma mudança, associação ou dissociação conformacional após a detecção do analito (por exemplo, ligação de um íon ou molécula, clivagem enzimática da região) que altera a distância entre os fluoróforos e, portanto, a magnitude do FRET (maior ou menor) 23 . Um tipo de sonda menos comum, mas útil, depende de uma mudança sensível ao analito na sobreposição espectral dos dois fluoróforos, o que altera a magnitude do FRET. As sondas raciométricas de "cadeia única" utilizam um par de fluoróforos ligados em uma única molécula. As sondas de "cadeia dupla" utilizam pares de fluoróforos em moléculas separadas, mas sua expressão pode ser acoplada sob o mesmode expressão 24. Ao contrário dos estudos com expressão de fluoróforo único (por exemplo, proteínas de fusão fluorescentes), os estudos com sondas FRET raciométricas não requerem transfecção dupla para controlar a eficiência da transfecção ou a viabilidade celular. As sondas FRET raciométricas são relativamente insensíveis à eficiência da transfecção quando expressas acima de um limite mínimo (insensível à concentração) 23 , 25 . Eles são insensíveis às flutuações da fonte de excitação e outros fatores do ambiente intracelular (por exemplo, pH, íons), desde que ambos os fluoróforos sejam responsivos de forma semelhante. Além disso, sua resposta não está sujeita a atraso transcricional, ao contrário das construções promotoras-repórter fluorescentes e bioluminescentes26,27.

As sondas FRET raciométricas são fácil e frequentemente empregadas em sistemas convencionais de microscópio de epifluorescência de campo amplo. Os microscópios de campo amplo são preferidos aos sistemas confocais de varredura de linha para imagens de células vivas devido a preocupações com o custo do sistema, branqueamento de fluoróforos e captura de alterações de sinal com resolução temporal suficiente. Além disso, a análise de célula única em uma grande população de células é possível com uma platina motorizada e captura de imagem em vários campos de visão. A microscopia de campo amplo requer análise baseada em intensidade dos sinais da sonda hetero-FRET. Embora a análise de intensidade não exija hardware complexo como outros métodos FRET, é necessário mais trabalho pós-aquisição para corrigir os efeitos dos comportamentos dos fluoróforos e das configurações do sistema de microscópio / imagem28. A intensidade de emissão capturada de um fluoróforo é uma função da energia de excitação, do rendimento quântico do fluoróforo e da sensibilidade e linearidade espectral combinada do filtro e da câmera/detector2. Estes podem ser diferentes para o doador e o aceitador e exigirão calibração para análise quantitativa. Além disso, a imagem da emissão do aceptor é influenciada pela sobreposição espectral dos fluoróforos (excitação do aceptor pela luz de excitação do doador e sangria da emissão do doador nos espectros de emissão do receptor)2. As sondas de "cadeia única" são normalizadas internamente porque seus fluoróforos são equimolares em nanoescala, enquanto os fluoróforos das sondas de "cadeia dupla" podem existir em diferentes estequiometrias em uma célula25,28. Se os fluoróforos das sondas de "cadeia única" tiverem brilho semelhante (função do coeficiente de extinção e do rendimento quântico), os efeitos da sensibilidade não linear do detector são pequenos e apenas a correção para a fluorescência de fundo e o rendimento quântico acoplado / sensibilidade do detector é necessária23. Assim, as sondas FRET raciométricas de "cadeia única" são mais facilmente implementadas em microscopia de campo amplo24.

Este artigo descreve uma técnica simples para realizar imagens FRET de células vivas em culturas de hidrogel 3D usando um microscópio epifluorescente convencional de campo amplo. Pode ser facilmente adotado por laboratórios que já realizam experimentos de FRET em 2D, bem como laboratórios interessados em sinalização intercelular em microtecidos. Aqui, demonstramos o método com medição baseada em imagem FRET dos níveis de monofosfato de adenosina cíclico (cAMP) em condrócitos vivos em hidrogéis de fotoreticulação (gel PC, dimetacrilato de polietilenoglicol) e termorresponsivos (gel TR, Matrigel). Uma sonda FRET raciométrica é utilizada com base em EPAC1 (ICUE1) para detectar os níveis de cAMP em resposta à forscolina, um agonista químico da adenilil ciclase que catalisa a conversão de ATP em cAMP. O cAMP é um dos principais segundos mensageiros que medeiam a sinalização do receptor acoplado à proteína G e ativa vários fatores, incluindo proteínas de troca a jusante diretamente ativadas pelo cAMP (EPACs). Os fluoróforos se separam após a ligação do cAMP ao domínio EPAC, resultando em uma diminuição no FRET. Aqui é descrita a preparação dos materiais de hidrogel, a transfecção celular com a sonda ICUE1 e a incorporação das células em hidrogéis 3D. O procedimento do experimento 3D FRET e a análise de imagem necessária para avaliar a atividade da sonda por célula são explicados. Também discutimos as limitações inerentes à análise FRET em 2D e 3D usando microscopia de campo amplo. A técnica aqui apresentada é uma melhoria em relação aos métodos 2D existentes, pois permite a análise em um contexto mais fisiológico e requer menos correção e calibração da imagem. Grande utilidade reside no fato de que muitos materiais transparentes podem ser usados enquanto as preferências de células e transfecção podem ser mantidas.

Protocolo

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1. Preparação de Materiais

  1. Preparar dimetacrilato de polietilenoglicol (PEGDM, 4.000 mw) por metacrilação de polietilenoglicol de acordo com os métodos descritos por Lin-Gibson et al. 29. Em alternativa, pode ser adquirido PEGDM.
  2. Sintetizar o fotoiniciador, fenil-2,4,6-trimetilbenzoilfosfinato de lítio (LAP), por meio de um processo de duas etapas, onde primeiro a dimetilfenilfosfonita reage com 2,4,6-trimetilbenzoíla corito por meio de uma reação de Michaelis-Arbuzov e, em seguida, o sal de lítio criado pela adição de brometo de lítio em 2-butanona, de acordo com Majima et al.30.
    Nota: Alternativamente, outros fotoiniciadores podem ser adquiridos, mas o LAP mostra melhor biocompatibilidade e eficiência de reticulação31.
  3. Funcionalize as lamínulas de vidro para permitir a ligação do hidrogel ao vidro e, assim, evitar o movimento durante a imagem.
    1. Em uma capa química com equipamento de proteção individual adequado, use metacrilato de 3-(trimetoxissilil) propila de acordo com o protocolo do fabricante para géis de PC e silanos epóxi (3-glicidoxipropiltrimetoxissilano) para géis TR31. Nota: Alternativamente, lâminas pré-revestidas podem ser adquiridas. Observe que a lamínula deve ser maior do que o poço da antena PDMS na Etapa 3.8.

2. Transfecção celular

  1. Em uma capa de cultura de tecidos e usando técnicas estéreis, descongelar e plaquear as células desejadas em subconfluência (50 - 70%), aqui condrócitos bovinos a 15.000 células/cm2 em placas de cultura não tratadas de 6 poços. Nota: Pode ser utilizado qualquer tipo de célula relevante, incluindo células independentes de ancoragem.
    1. Permitir que as células recuperem durante um dia numa incubadora a 37 °C. Antes das etapas subsequentes, remova o meio, enxágue com PBS e adicione 2 ml de meio sem fenol e soro por alvéolo.
  2. No dia seguinte, para cada poço, adicione 100 μl de meio sem fenol e soro, bem como 3 μl de reagente de transfecção a um tubo de ensaio de vidro autoclavado. Para misturar, agite levemente o tubo. Incubar em RT por 5 min. Limite qualquer exposição à luz.
  3. Adicionar 1 μg de ADN da sonda FRET e agitar ligeiramente. Incubar a mistura em RT e longe da luz por 30 min.
    Nota: Neste experimento, o plasmídeo ICUE1 (cortesia do Dr. Jin Zhang33) foi usado. Os fluoróforos em ICUE1 são proteína fluorescente ciano (CFP, doador) e proteína fluorescente amarela (YFP, aceitadora). A proporção de reagente de transfecção para DNA de plasmídeo precisará de ajuste para transfecção ideal de diferentes tipos de células.
  4. Distribua a mistura preparada (~ 104 μl) gota a gota para cada um dos 6 poços contendo células mais 2 ml de meio sem fenol e soro. Não pipete para cima e para baixo. Gire suavemente o prato para misturar.
  5. Incubar a 37 °C por 48 horas. Nota: A confluência inibe a eficiência da transfecção e altera a expressão endógena dos receptores.

3. Fabricação de moldes PDMS para fundição e cultura de hidrogel

  1. Para preparar uma grande lâmina de vidro para fundir o polidimetilsiloxano (PDMS), limpe o vidro primeiro com sabão, enxágue com uma quantidade abundante de água e depois seque com isopropanol seguido de ar.
    1. Trate o vidro com um reagente siliconizante de acordo com o protocolo do fabricante para que o PDMS possa ser facilmente removido após a cura. Enxágue o reagente residual da superfície com tolueno sobre um recipiente de captação. Deixe a superfície secar completamente ao ar antes ou use calor a 100 °C para reduzir o tempo de espera.
  2. Selecione uma altura de hidrogel (por exemplo, 1 mm) e calcule 1,2 vezes o volume de PDMS necessário para cobrir a lâmina de vidro com PDMS dessa espessura usando as dimensões da lâmina de vidro e a altura do hidrogel. Nota: O PDMS não encolhe.
    1. Misture os componentes do kit PDMS na proporção de 10:1 em peso em um béquer. Depois de bem misturado, coloque o copo sob o vácuo da casa para desgaseificar. Alivie o vácuo se as bolhas começarem a transbordar do recipiente e repita.
      Nota: Outras espessuras de hidrogel podem ser usadas, mas ao custo de aumento do fundo e aumento da opacidade se a centrifugação (etapa 6.2) não for usada.
  3. Enrole papel alumínio ao redor da base e das laterais do vidro para conter o PDMS. Despeje cuidadosamente a quantidade desejada de PDMS desgaseificado neste copo cercado por papel alumínio. Meça a altura do PDMS. Lembre-se de que a altura do PDMS será a altura máxima do hidrogel. Se alguma bolha for criada ao despejar, desgaseifique novamente ou estoure-a com uma espátula ou agulha.
  4. Colocar o PDMS não curado numa superfície plana numa estufa a 100 °C durante 2 horas ou deixar em RT durante 24 horas.
  5. Remova cuidadosamente o PDMS da superfície depois de curado. Perfure a forma desejada (por exemplo, punção cilíndrica de 3 mm) para os hidrogéis.
    Nota: A fotoreticulação produzirá cilindros de gel de PC ligeiramente mais estreitos do que o diâmetro do molde devido à extinção da reação por oxigênio molecular no PDMS.
  6. Esterilize o PDMS perfurado. Para experimentos de curto prazo, mergulhe o PDMS em etanol a 70% por 1 hora.
  7. Monte o molde encaixando a base do PDMS esterilizado com uma lamínula de vidro estéril de espessura compatível com a correção objetiva do microscópio. Reserve para uso na Etapa 6.
  8. Fabrique um prato PDMS maior usando os métodos acima (com um poço mais largo e mais alto que o hidrogel) para conter o hidrogel e o meio. Acomode um volume médio pelo menos 10x maior que o hidrogel para imergir o hidrogel e minimizar a diluição do analito.

4. Preparação de soluções precursoras de hidrogel

  1. Numa capa de cultura de tecidos e utilizando técnicas estéreis, preparar as soluções precursoras de hidrogel adequadas para o estudo imediatamente antes de adicionar células. Preparar o gel de PC a partir do precursor do polímero da seguinte forma.
    1. Misture o pó de PEGDM em solução salina tamponada com fosfato (PBS, pH 7,2) a 10% (p / v).
    2. Adicione o fotoiniciador (por exemplo, LAP) a uma concentração final de 0,005 - 0,01% (p / v) e misture por pipetagem. Cubra a solução com papel alumínio ou proteção contra a luz, pois o LAP é sensível à luz.
      Nota: Aqui a matriz extracelular do fator de crescimento reduzido TR-gel é usada conforme fornecido pelo fabricante.

5. Suspensão Celular em Soluções de Hidrogel

  1. Em uma capa de cultura de tecidos e usando técnicas estéreis, aspire o meio dos poços.
  2. Adicione PBS aos poços e remova para enxaguar bem as monocamadas de células anexadas.
  3. Dissociar as células do substrato de cultura utilizando 2 a 3 ml por 25 cm2 de solução de dissociação celular. Agite suavemente e incube a 37 ° C por 10 - 20 min ou até dissociar. Bata firmemente no prato, se necessário, para desalojar as células.
    Nota: Soluções alternativas de dissociação celular estão disponíveis com seleção limitada àquelas que não afetam a via de sinalização em análise por receptores de clivagem de interesse.
  4. Depois que as células forem destacadas, adicione 2 ml de meio livre de fenol e soro, suspenda as células e conte as células com um hemocitômetro. Nota: Meio livre de soro quimicamente definido (por exemplo, suplementado com insulina, transferrina e selênio) também pode ser usado.
  5. Alíquota do número desejado de células com base no tipo de célula em frascos estéreis e pellets (por exemplo, 2,0 x 106 células por frasco).
  6. Remova o sobrenadante, adicione o volume desejado de precursor de hidrogel e suspenda as células por pipetagem. Use um volume de precursor que produzirá 2 x 105 células / cm2 no plano xy ao visualizar o eixo z do hidrogel colapsado (por exemplo, 1,0 ml por frasco para um hidrogel de 1 mm de espessura contendo 2 x 106 células / ml). Tome cuidado para não produzir bolhas.
    1. Passe rapidamente para a próxima etapa para limitar os efeitos negativos na viabilidade celular34.

6. Preparação de hidrogel

  1. Em uma capa de cultura de tecidos e usando técnicas estéreis, adicione o precursor de hidrogel contendo células aos moldes de fundição preparados na etapa 3 (por exemplo, 7,1 μl por molde de 3 mm de diâmetro x 1 mm de altura). Crie um hidrogel extra, de acordo com os mesmos métodos descritos, para usar na calibração do sistema de imagem do microscópio e na calibração da sonda (se a eficiência inerente da sonda for desconhecida).
  2. Centrifugue o precursor de hidrogel contendo células preparado antes da gelificação/reticulação para otimizar a imagem, confinando as células a um único plano focal e minimizando o sinal fora do plano (Figura 1). Ajustar o tempo e a força de centrifugação ao tipo de célula e à viscosidade do precursor (400 g durante 4 min).
  3. Gel ou reticulação da solução
    1. Para o hidrogel PC-gel, irradiar o precursor contendo células com uma fonte de luz UV-A (λ = 365 nm) por um tempo de exposição igual a 3,2 J/cm2 por milímetro de espessura à fotoreticulação.
      Nota: Use uma espessura mínima de 1 mm no cálculo. As exposições devem cair na faixa de 1 a 5 minutos. Use o tempo mínimo de exposição. Evite a irradiação excessiva das células, pois isso diminuirá a viabilidade e branqueará o doador de CFP. No entanto, tempos de exposição inferiores a 60 s não são recomendados porque a irradiação de alta intensidade leva à autoextinção radical e baixa viabilidade celular.
    2. Para o hidrogel TR-gel, coloque o molde preenchido em uma placa de Petri e vá para uma incubadora para gelar termicamente. Incubar a 37 °C durante 30 min.
  4. Depois de gelificar ou reticular o hidrogel, remova o molde de fundição de hidrogel PDMS e substitua-o pelo prato PDMS maior preparado (da etapa 3.5). Pressione o PDMS para baixo no vidro com uma espátula estéril para colá-lo.
    1. Coloque esta placa PDMS com lamínula em um recipiente estéril, como uma placa de Petri. Adicione meio sem soro sem fenol ou meio quimicamente definido (meio livre de soro suplementado com insulina, transferrina e selênio (etapa 5.4)) ao poço criado com o prato PDMS e lamínula para manter o hidrogel imerso. Incubar a 37 °C por 30 min.
      Nota: Se estiver usando um prato especializado com uma lamínula, coloque a lamínula nele e adicione meio da mesma forma.
    2. Como alternativa, execute esta etapa no dia anterior à imagem FRET para permitir que as sondas se recuperem à medida que os comprimentos de onda de irradiação se sobrepõem ao espectro de excitação do doador CFP.

7. 3D FRET Imaging

  1. Remova a placa PDMS com o hidrogel da placa de Petri, preparada na etapa 6.4, e prenda-a em um suporte de amostra ajustável para o estágio do microscópio XY (Figura 2). Posicione o suporte da amostra na platina do microscópio. Aplique óleo na objetiva, se necessário. Use uma objetiva de pelo menos 40X e de alta abertura numérica (NA) (ou seja, 1,3 NA) para capturar as emissões de fluoróforo relativamente fracas.
  2. Configure os campos de visão (FOVs) para aquisição de imagens: selecione células para imagens usando imagens de luz transmitida e verifique a transfecção com imagens de fluorescência. Escolha pelo menos 15 células diferentes.
    1. Selecione células que não sejam nem muito brilhantes nem muito fracas (o que poderia levar à saturação excessiva da sonda ou baixa sensibilidade) e com a razão FRET entre 0,0 e 1,0 (o que indica dano ou decaimento da sonda binária). Em seguida, desligue a luz para limitar a exposição.
    2. Selecione FOVs próximos ao centro do hidrogel e com as células de interesse dentro do campo de iluminação relativamente plano (consulte a Figura 3B e a Etapa 9.2 abaixo).
  3. Defina as configurações da câmera para os canais de imagem FRET. Escolha entre algumas células próximas ao centro do FOV para otimizar as "configurações ópticas" (ou seja, exposição e ganho por canal de imagem).
    Nota: A nomenclatura abaixo varia dependendo do software usado para operar o microscópio e a câmera. O software do microscópio, NIS-Elements, é usado aqui para captura e análise de imagens.
    1. Para análise FRET de sondas de cadeia única, selecione dois canais de imagem por FOV: Emissão temperada (QE), que é a emissão doadora sob excitação doadora e Emissão aceptor sob excitação aceptor (Aem).
      Nota: Para a sonda ICUE1 CFP-YFP, um par de filtros de excitação e emissão CFP para QE (418 - 442 ex, 458 - 482 em) e um par de excitação e emissão YFP para Aem (490 - 510 ex, 520 - 550 em) são usados.
    2. Defina a exposição para QE e Aem para adquirir a intensidade máxima do sinal sem saturação (e se estiver usando um CCD, com o mínimo ganho possível) para minimizar o ruído de fundo. Mantenha as configurações ópticas as mesmas para ambos os fluoróforos e durante todo o experimento, bem como entre os grupos experimentais para evitar viés nos resultados (ou seja, potência de excitação, tamanho da íris, exposição e ganho da câmera) (Figura 3A).
    3. Adquira canais de imagem adicionais para permitir mais opções de análise após a aquisição (por exemplo, imagens de emissão sensibilizada corrigida (cSE) (ver Discussão)). Para a sonda ICUE1 CFP-YFP, adquira os canais de excitação (Ex) e emissão (Em) das configurações Exdoador -Em doador (QE, selecione CFP-CFP no software do microscópio),Ex doador -Em aceitador (SE, selecione CFP-YFP), Exaceitador - Emaceitador (Aem, selecione YFP-YFP) e Exaceitador -Em doador (YFP-CFP) (consulte a Figura 3A).
  4. Configure a taxa de captura para aquisição de imagem com lapso de tempo.
    1. Diminua a taxa de captura se limitado pelo hardware. Para ensaios de curto prazo (por exemplo, 30 a 60 min), denote cerca de 12 aquisições por minuto para cada FOV (taxa de amostragem de 5 segundos) para capturar a cinética de sinalização. Use a taxa mínima de amostragem necessária para evitar o fotobranqueamento significativo da sonda.
    2. Defina a taxa de aquisição digitando a periodicidade das capturas no software do microscópio. Para ensaios de longo prazo (por exemplo, 24 horas), comece com a alta taxa de aquisição para capturar a resposta inicial do pulso e, em seguida, mude para uma baixa taxa de aquisição, por exemplo, a cada 5 a 10 minutos.
  5. Selecione "Executar agora" no software do microscópio para iniciar a aquisição de imagens e capturar imagens por 5 minutos para estabelecer uma linha de base para a resposta da sonda nos FOVs designados.
  6. Após 5 minutos de aquisição da imagem, pipete no analito agonista ou antagonista desejado (por exemplo, Forscolina a 100 nM), misture por pipetagem e continue a imagem.

8. Calibração FRET

  1. Calibração do sistema: Use o hidrogel de calibração adicional, fabricado conforme descrito na etapa 6, para adquirir imagens AEM de pelo menos 6 células representativas usando os mesmos critérios de FOV, configurações ópticas e configurações de câmera usadas para imagens FRET acima (Etapas 7.1, 7.2 e 7.3).
    Nota: A quantificação do rendimento quântico e da sensibilidade espectral (QS) para o sistema combinado de sonda e imagem microscópica é necessária para a análise FRET "absoluta", mas não para o FRET "relativo".
    1. Fotobranqueie o fluoróforo aceptor selecionando uma exposição de 5 minutos à luz de excitação em intensidade total (excitação no canal Aem). Use uma abertura estreita para branquear apenas as células de interesse. Verifique se o sinal do AEM é pelo menos 10% menor que o sinal original comparando o histograma de intensidade do sinal (janela "LUT") antes e depois do fotobranqueamento. Continue o fotobranqueamento se a perda de sinal for inferior a 90%.
      Observação: Certifique-se de que o fluoróforo do doador não seja branqueado durante este procedimento usando filtros de excitação AEM que não se sobreponham ao espectro de excitação do doador.
    2. Adquira a emissão do doador sob excitação do doador com o fluoróforo aceptor (Dem) agora branqueado usando a mesma configuração óptica do QE na etapa 7.3.
    3. Calcule QS por pixel como Dem dividido por Aem após a correção de fundo, como na Seção 9 abaixo. QS = Dem/Aem
    4. Calcule o QS médio entre as células a partir das médias celulares.
  2. Estime a eficiência FRET inerente da sonda (Ei) usando a amostra de calibração. Induzir o FRET máximo da sonda e calcular Ei = 1 - QE/(Aem x QS) como no ponto 9 abaixo. Alternativamente, use Ei = cSE/Aem, ou Ei calculado usando um ensaio de endpoint convencional para eficiência FRET com Ei = 1 - (QE/Dem).
    Nota: Ei é necessário para quantificar a fração absoluta de sondas ativadas (FAP, ou seja, fração de analito de ligação de sondas), mas não é necessário para análise FRET "relativa".
    1. Saturar a resposta da sonda estimulando a cultura com um agonista da produção/ativação do analito para sondas que aumentam em FRET após interação com o analito.
    2. Inibir a interação da sonda com o analito usando um antagonista de sinalização para sondas que diminuem em FRET ao ligar o analito. Nota: No caso da sonda ICUE1, suprima os níveis de cAMP com inibidores da adenil ciclase, como 2',5'-Didesoxiadenosina (específico) ou 3-isobutil-metil-xantina (não específico).

9. Cálculo da taxa FRET

  1. Desenhe e designe uma região de interesse (ROI) por FOV próximo às células para definir o nível de fundo (Figura 3B) em cada FOV ao longo do tempo, mas restrinja a ROI à área de iluminação relativamente homogênea sobre o centro da imagem (Figura 4A). Consulte a discussão para obter uma explicação das opções de correção de plano de fundo.
    1. Com o software do microscópio: Selecione a seta no "Ícone ROI de fundo" e selecione "Desenhar ROI de fundo elíptico" (outras formas funcionarão). Certifique-se de que a opção "Continuar atualizando o deslocamento em segundo plano" esteja selecionada. Ative a visualização do ROI em segundo plano clicando no ícone ROI em segundo plano. Como alternativa, use o "Ícone de ROI" e as propriedades de ROI definidas como "Usar como ROI em segundo plano" e "As ROIs são diferentes em cada multiponto".
    2. Com ImageJ: Use a barra de ferramentas para selecionar a ferramenta de desenho circular. Em seguida, adicione a forma ao gerenciador de ROI por meio do menu "Analisar→ Ferramentas→ Gerenciador de ROI". Defina uma cor diferente para o ROI de fundo no ROI Manager, se desejar.
    3. Para cada FOV e canal de imagem (por exemplo, QE e Aem), subtraia o valor médio dentro do ROI de fundo por ponto de tempo para criar uma imagem corrigida por canal, por exemplo, sQEt,p = QEt,p - bQEt,p onde t é o tempo de aquisição, p é o FOV (ou seja, posição xy) e bQE e bAem são os valores escalares do sinal dentro do ROI de fundo. Use as funções aritméticas de imagem disponíveis no software.
      1. Com o software do microscópio, use o "Ícone de fundo ROI" e selecione "Subtrair fundo usando ROI". Na janela pop-up, selecione "Todas as imagens" em "Subtrair ROI de fundo ativado" e selecione "Todos os quadros" em "Aplicar a".
        Observação: um ROI em segundo plano deve ser definido em cada FOV para que essa função funcione corretamente (por exemplo, a função não subtrai corretamente os planos de fundo do FOV com ROIs do plano de fundo se alguns FOV tiverem ROIs do plano de fundo indefinidos).
      2. Com o ImageJ, use a macro "BG Subtraction from ROI" escrita por Michael Cammer (http://microscopynotes.com/imagej/macros/).
    4. Salve a série temporal corrigida de imagens selecionando "Salvar como" para as etapas de análise a seguir.
  2. Defina um ROI ao redor da célula usando uma máscara binária para cada célula em análise em cada FOV (Figura 4B). Use o canal AEM para limitar a imagem por FOV no início do experimento, identificar os limites da célula e definir os ROIs. Salve os ROIs.
    1. Com o software do microscópio: Para cada quadro (ou seja, FOV), primeiro use o menu "Binário→ Definir limite" e selecione "aplicar ao quadro atual". Ajuste o valor do limite inferior para selecionar as células. Em seguida, use a função "Binary→ Close" para preencher os buracos na máscara binária, se necessário. Em seguida, use o ícone ROI para selecionar "Copiar binário para ROI"; A camada binária é excluída automaticamente.
      1. Acrescente ROIs para quadros subsequentes ao pool existente de ROIs. Exclua quaisquer ROIs espúrios. Em seguida, clique com o botão direito do mouse nos ROIs e certifique-se de que suas propriedades sejam "Use as Standard ROI" e "ROIs são diferentes em cada multiponto".
      2. Com ImageJ: Para cada FOV, primeiro use o menu "Imagem→ Ajustar→ Limiar". Em seguida, use "Analisar→ Analisar partículas" com Mostrar contornos e Adicionar ao gerente selecionados. Use "Binary→ Close" para preencher "buracos" na máscara binária, se necessário. Exclua ROIs espúrios. Plugins gratuitos estão disponíveis para automatizar esse processo.
  3. Calcule a razão FRET baseada em QE em cada pixel, sQE/sAem para análise relativa (consulte a Etapa 10) e EQE = sQE/(QS x sAem) para análise absoluta (consulte a Etapa 10) com QS obtido na Etapa 8.1. Use a divisão de ponto flutuante das imagens. Consulte a seção de discussão para obter uma explicação das derivações de razão.
    1. Com o software do microscópio: Use o menu "Imagem →Operações de imagem" e selecione "Ponto flutuante".
    2. Com ImageJ: Use a função "Processar →Calculadora de Imagens" ou o plug-in "Calculator_Plus.java". Nota: Em alternativa, a macro "pH_ratioMacro".txt" pode ser adaptada para calcular os rácios FRET. Ele emprega a macro de correção de fundo descrita acima e está disponível em
  4. Exporte a proporção média por célula (ou seja, por ROI) para uma planilha e um software gráfico.
    1. Com o software do microscópio: Use o botão de exportação ND no controle de análise "ROI Statistics" ou o botão "Spreadsheet Export" no controle de análise "Time Analysis".
    2. Com ImageJ: Primeiro selecione o menu "Analisar →Definir Medidas" e certifique-se de que "Valor médio" e "Desvio padrão" estejam selecionados. Em seguida, use o ROI Manager e selecione o botão "Medir". Salve a janela de resultados gerados.

10. Análise do Rácio FRET

  1. Calcule a proporção média de FRET celular ao longo do tempo a partir das taxas médias por célula (exportadas na Etapa 9.4). Considere as razões FRET basais (a razão antes da administração do analito) neste cálculo.
    Nota: O software de planilha e gráfico é usado aqui para traçar as taxas FRET médias subtraídas da linha de base e seu erro padrão da média (SEM) usando uma regressão linear na linha de base, como nas etapas 10.1.2 e 10.1.3 abaixo (Figuras 5 e 6).
    1. Análise Relativa (magnitude da resposta): Normalize cada curva para uma amostra de referência comum (por exemplo, amostra não tratada).
    2. Análise absoluta (curso de tempo de resposta): Mude as curvas para um ponto inicial comum, normalizando cada curva com sua razão FRET de linha de base.
      1. Na planilha e no software gráfico, intercale os dados (colunas de proporções médias por célula) com novas colunas, de modo que cada coluna original seja emparelhada com uma nova coluna contendo apenas dados de proporção para o período de linha de base (proporções antes da adição do analito). Selecione "Inserir coluna" para inserir uma coluna vazia após cada coluna de dados. Em seguida, copie os dados da linha de base para as colunas vazias emparelhadas.
      2. Na planilha e no software gráfico, selecione "Inserir → nova análise → transformar Remover linha de base" e, em seguida, defina "Coluna selecionada" como "todas as outras", selecione "assumir que a linha de base é linear" e selecione "Diferença" em "Cálculo".
      3. Calcule a proporção celular média e estatísticas descritivas. Na planilha e no software gráfico, selecione "Inserir → nova análise → análises XY → médias de linha com SD ou SEM" e, em seguida, selecione "Médias de linha com SEM" na janela pop-up.

Resultados

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Todos os precursores de hidrogel, células e moldes de fundição foram preparados conforme descrito acima. As soluções precursoras carregadas de células foram fundidas em moldes PDMS e depois centrifugadas antes da gelificação/fotoreticulação para imobilizar as células próximas à lamínula e facilitar a análise de imagem FRET (Figura 1). Os hidrogéis com lamínulas anexadas foram colocados dentro de poços de imagem PDMS preparados para imagens microscópicas (Figura 2). As configurações ópticas e os parâmetros de aquisição de imagem foram então definidos conforme mostrado na Figura 3A. A captura de todos os quatro canais de imagem relacionados ao FRET para pares de fluoróforos CFP-YFP é demonstrada (veja em "Optical Conf." na Figura 3), como é necessário para sondas não binárias. No entanto, neste trabalho, apenas duas imagens são necessárias para a sonda ICUE1 binária de cadeia única, QE = "CFP CFP" e Aem = "YFP YFP" (emissão de excitação). Foram selecionados múltiplos FOVs (posições xy) nos quais várias células residiam dentro da área de iluminação homogênea (Figura 3B). Após a aquisição de lapso de tempo, os dados de sinal para a sonda foram exportados. As ROIs para correção de fundo de sinais de canal e para análise de células foram designadas usando imagens Aem limiares desde o início dos experimentos (Figura 4). As células foram selecionadas entre o pool de células como aquelas que expressam sonda suficiente (não muito fraca), mas não muito alta (excessivamente brilhante) (Figura 4B). As razões QE e SE FRET por pixel em cada aquisição foram calculadas usando a divisão de ponto flutuante dos canais de imagem subtraídos de fundo. A razão FRET média por célula (ou seja, por ROI) foi calculada, normalizada para o sinal de linha de base antes da estimulação (ou seja, uma regressão na linha de base subtraída de todos os pontos de tempo) e plotada com barras de erro como o erro padrão da média (SEM). As proporções de FRET baseadas em QE e cSE detectam o aumento da atividade do cAMP em condrócitos sob estimulação com forscolina (100 nM, Figura 5). A razão QE FRET foi mais sensível à correção de fundo do que a razão cSE FRET porque o sinal QE foi menor devido ao baixo nível basal de atividade do cAMP nos condrócitos incorporados nos hidrogéis. Ambos os tipos de hidrogel (TR-gel e PC-gel) mostraram um aumento na razão FRET ao longo do tempo (Figura 6), indicando um aumento da resposta de sinalização do cAMP à adição de Forskolin. Conforme indicado pela razão QE FRET, os condrócitos em hidrogéis PC-gel mostram uma maior alteração no cAMP (mostrado) e um nível basal mais alto de cAMP (EQE = 0,19 em PC-gel vs. EQE = 0,09 em TR-gel, não mostrado na figura subtraída da linha de base).

figure-results-1
Figura 1: Distribuição Celular em Hidrogel Fotoreticulado (PC-gel)
R: O precursor de hidrogel carregado de células foi centrifugado para maximizar o número de células em um plano focal próximo à lamínula. B: Isso aumenta o número de células no FOV e minimiza o sinal de fundo de células fora do plano. (Barra de escala = 200 μm) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 2: Hidrogel no PDMS Dish
O hidrogel foi colocado dentro de um poço alto de PDMS (10x o volume de hidrogel) com uma base de lamínula para imagens microscópicas e estimulação do analito. Os hidrogéis de gel PC são transparentes e colados à lamínula para que permaneçam no lugar durante todo o ensaio. O poço PDMS pode ser aumentado para conter 10x mais meio do que o volume de hidrogel usando um punção de biópsia mais largo, além de uma folha de PDMS mais espessa. (Barra de escala = 2 mm) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-3
Figura 3: Configuração de aquisição para imagens FRET
R: A aquisição foi configurada para captura de imagem a cada 7 segundos em vários locais. Para o cálculo da razão QE FRET, apenas dois canais de imagem são necessários para a sonda ICUE1 usada aqui (sonda binária de cadeia única), QE = "CFP CFP" e Aem = "YFP YFP" (emissão de excitação) na coluna "Optical Conf." na guia λ do software do microscópio. B: FOVs (posições "XY") foram selecionados nos quais várias células residiam dentro da área de iluminação homogênea. O gráfico abaixo da imagem mostra a intensidade da iluminação ao longo da linha de seta azul que atravessa o centro do FOV. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

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Figura 4: Seleção de ROIs para análise de imagem FRET
R: Uma região de interesse (ROI) livre de células foi selecionada para corrigir o sinal de fundo em cada canal. Uma imagem de um hidrogel livre de células pode ser usada para subtração de fundo se a densidade ou migração celular for alta, ou se uma máscara de sombreamento não for usada quando as células não estiverem dentro de um campo de iluminação homogêneo. B: As ROIs da célula foram selecionadas usando limite de imagem e mascaramento binário do canal Aem. A seleção de um ROI maior que as células afetará adversamente o cálculo da razão FRET média por célula devido à inclusão de proporções extracelulares geradas a partir do ruído de fundo. O cálculo da razão FRET celular usando a média de cada canal por célula não é recomendado, pois isso subestima a razão. (Barra de escala = 50 μm) Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-5
Figura 5: Comparação das razões FRET em hidrogel termorresponsivo (TR-gel)
As relações FRET baseadas em QE e SE detectam o aumento da atividade do cAMP em condrócitos sob estimulação com forscolina. A forscolina é um agonista da adenil ciclase que induz a produção de cAMP. A FRET diminui quando a sonda ICUE1 se liga ao cAMP e, portanto, a razão QE FRET (EQE = sQE/(sAem x QS)) aumenta. Por outro lado, a razão SE FRET diminui e, portanto, é plotada como ESE = 1 - cSE/sAem. Nos condrócitos embebidos em hidrogel, a razão QE FRET é mais sensível à correção de fundo do que a razão SE FRET porque o sinal QE é baixo devido à baixa atividade basal do cAMP. Barras de erro = SEM, n = 25. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-6
Figura 6: Comparação da razão FRET em diferentes hidrogéis
Os condrócitos em ambos os tipos de hidrogel responderam à estimulação da forscolina com um aumento na atividade do cAMP, conforme demonstrado pelo aumento da razão QE FRET ao longo do tempo. O tipo de hidrogel afeta a resposta celular por meio de vários efeitos, incluindo diferenças na permeabilidade à forscolina e na atividade do cAMP celular basal (EQE = 0,19 no PC-gel vs. EQE = 0,09 no TR-gel, não mostrado). Barras de erro = SEM, n para TR-gel = 25, n para PC-gel = 15. Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Discussão

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Este trabalho demonstra como a imagem FRET pode ser usada para analisar a sinalização celular em hidrogéis 3D. Embora estudos anteriores tenham demonstrado imagens FRET de células semeadas em substratos de hidrogel35-37, de interações extracelulares com hidrogéis38 e de moléculas presas em hidrogéis39-41, esta é a primeira publicação a descrever a análise intracelular baseada em imagens FRET de células incorporadas em hidrogéis 3D. O trabalho resolve vários problemas de implementação ao traduzir imagens FRET de 2D para 3D. Primeiro, objetivas de alta abertura numérica são necessárias para que a imagem FRET colete sinal de emissão suficiente, mas limitam a profundidade de campo. As células aqui podem se assentar ligeiramente por centrifugação para aumentar o número de células em um plano focal próximo ao vidro para compensar isso. Em segundo lugar, os andaimes de hidrogel 3D podem flutuar no campo de visão durante a imagem, o que complica a análise. Os hidrogéis aqui são ligados à lamínula para que permaneçam fixos durante todo o experimento. Em terceiro lugar, a seleção de composições de hidrogéis apropriadas para FRET 3D é essencial porque os hidrogéis podem dificultar a visualização das células. Aqui, são usados hidrogéis transparentes de PC-gel e TR-gel. No entanto, reunir as células com centrifugação em um plano focal próximo à lamínula pode ser usado para obter imagens de células em hidrogéis com maior difração. A escolha do hidrogel depende das condições do microambiente que devem ser simuladas, que podem ser encontradas em uma revisão sobre hidrogéis42. Em quarto lugar, um cálculo alternativo é empregado aqui para a razão FRET da sonda ICUE1 de cadeia única (ou seja, EQE = QE / cAem) para minimizar o número de canais de imagem necessários para análise e, assim, minimizar o fotobranqueamento. A taxa FRET média por célula é calculada como a média das taxas por pixel dentro de uma célula para minimizar a subestimação da taxa FRET real. Finalmente, é descrita uma análise raciométrica linear e meios para calcular a fração ativada de sondas binárias de cadeia única.

Existem vários aspectos críticos da realização de experimentos FRET bem-sucedidos usando microscopia de campo amplo. Com relação ao hardware, a câmera deve ser sensível o suficiente para resolver pequenas mudanças de sinal, deixando as câmeras CMOS científicas mais recentes e os CCDs multiplicadores de elétrons mais adequados do que os CCDs convencionais. Para melhor analisar a distribuição espacial da razão FRET, a câmera deve, no mínimo, possuir o dobro da resolução espacial da função de propagação de pontos da objetiva (critério de Nyquist). Isso torna os sistemas de visão dupla menos adequados para a tarefa. Mais crucial é selecionar uma exposição apropriada e taxa de aquisição de imagem para o par FRET fornecido, de modo a minimizar o fotobranqueamento dos fluoróforos. Uma taxa de aquisição reduzida é recomendada à medida que a duração do experimento aumenta. O uso de rodas de filtro rápido aumenta a taxa de aquisição e o número de FOVs para análise, evitando os problemas de registro de imagem com cubos de filtro de torre e visão dupla. O campo de iluminação não homogêneo complica a correção da fluorescência de fundo que surge da autofluorescência da amostra e do ruído do sistema da câmera. Alguns hidrogéis, particularmente aqueles que contêm proteínas colágenas, são altamente autofluorescentes43,44. Os índices FRET são subestimados sem correção de fundo. Aqui, empregamos um método simples de correção de fundo que se baseia no campo de iluminação relativamente plano, que muitas vezes pode ser configurado com iluminação de epifluorescência sobre o centro da imagem (Figura 3B, Etapa 7.2). Este método, portanto, restringe as células de interesse àquelas dentro deste campo de iluminação. A correção de fundo descrita aqui não leva em conta a autofluorescência celular nos comprimentos de onda lidos para a sonda binária. Nesse caso, as células não marcadas (sem transfecção de sonda) devem ser visualizadas nas mesmas condições e subtraídas o fundo. Uma combinação de células rotuladas e não rotuladas pode ser usada e as células não rotuladas selecionadas para o ROI de fundo. Métodos alternativos que fornecem análise celular em todo o campo da imagem incluem o uso de uma máscara de sombreamento, várias ROIs de fundo ou amostras idênticas sem células e um protocolo está disponível mediante solicitação.

Especificamente para imagens 3D FRET, a resposta da sonda é altamente sensível à permeabilidade do hidrogel ao analito (Figura 6). Portanto, as mesmas regiões de hidrogel são comparadas entre os tratamentos experimentais, de preferência em um ponto de simetria geométrica, como próximo ao centro do andaime, conforme usado aqui. Alternativamente, câmaras / biorreatores microfluídicos podem ser empregados para perfundir rápida e uniformemente o hidrogel com solução analita45. Um sinal FRET pode não ser detectado (a relação sinal-ruído é muito baixa) quando a autofluorescência do hidrogel é muito alta; Um hidrogel mais fino ou uma sonda diferente (fluoróforos diferentes) devem ser usados. Com relação à imagem 3D FRET em hidrogéis fotoreticulados, recomenda-se o uso de exposição mínima à irradiação e comprimentos de onda fora dos espectros de excitação dos fluoróforos da sonda. O LAP pode ser usado com uma fonte de luz visível a 405 nm para minimizar ainda mais o dano celular potencial31,46. No entanto, o uso de LAP com irradiação de 365 nm é recomendado porque isso minimiza o branqueamento da sonda. 365 nm situa-se na extremidade final do espectro de excitação do doador CFP, enquanto 405 nm situa-se no pico de excitação. Como alternativa, a expressão do teste pode ser recuperada por um dia. O uso de sondas binárias minimiza questões de sensibilidade a diferenças nos níveis de expressão e na difusão molecular dos fluoróforos doadores e aceptores. Sondas não binárias podem ser usadas, mas com SE em vez de imagem QE e correção adicional para sangramento espectral de espectros de excitação e emissão (veja abaixo). Além disso, a baixa disponibilidade comercial e a complexidade no projeto de sondas FRET podem ser um obstáculo. O fator mais crítico para experimentos bem-sucedidos continua sendo a correção e análise adequadas dos sinais de fluorescência.

Um cálculo alternativo da razão FRET é utilizado por várias razões adicionais, além da minimização do fotobranqueamento. Para sondas binárias de cadeia única, a razão comumente relatada é a emissão do doador sob excitação do doador (emissão sensibilizada, SE) para a emissão do doador sob excitação do doador (emissão extinta, QE), ou seja, razão FRET = SE/QE25,47,48. SE/QE é não linear em relação às mudanças na eficiência do FRET21,22,47. Ou seja, a razão tem uma relação exponencialmente não linear com a eficiência FRET inerente da sonda (Ei) (Donius, AE, Taboas, JM trabalho não publicado. (2015)), com a proporção mais linear para Ei inferior a aproximadamente 15%. SE/QE também subestimará a fração de sondas ativadas (FAP, ou seja, fração de analito de ligação de sondas). Portanto, a análise de SE/QE requer um estudo complicado de resposta à dose de equilíbrio e ajuste de curva. Felizmente, as razões de SE ou QE para a emissão do aceptor sob excitação do aceptor (Aem) são lineares em relação a Ei e ao FAP, ou seja, as razões FRET SE/Aem e QE/Aem. SE/Aem é frequentemente usado para sondas binárias e requer apenas calibração de ponto final (sem atividade de sonda e atividade total da sonda), mas a sinalização celular basal torna isso difícil. Para eliminar a necessidade de calibração de ponto final, o SE pode ser corrigido (cSE) para sobreposição espectral de espectros de excitação e emissão de doadores e aceptores (sangramento espectral) e para o rendimento quântico e sensibilidade espectral (QS) dos fluoróforos de sonda combinados e sistema de imagem microscópica. A razão SE FRET corrigida com base em cSE define a eficiência FRET observada das sondas dentro de cada pixel de uma imagem, ou seja, ESE = cSE/Aem. Software comercial e livre está disponível para corrigir o SE para esses efeitos e o leitor é encaminhado para o trabalho de Chen e Periasamy 2006 para uma explicação detalhada dos métodos50. No entanto, o cálculo de ESE requer a captura de três canais de imagem por ponto de tempo (SE, QE, Aem). Portanto, neste trabalho também empregamos uma razão FRET alternativa EQE = 1 - QE/cAem, que requer a captura de apenas dois canais de imagem (QE e Aem). O cálculo de EQE desses canais requer apenas a correção de Aem para QS (cAem = Aem x QS). QS = Dem/Aem é facilmente estimado usando duas imagens de uma amostra de calibração, onde Dem é a emissão do doador sob excitação do doador com o aceptor branqueado. O FAP a qualquer instante pode ser calculado comparando ESE ouE QE com o Ei da sonda.

Em última análise, a seleção da razão FRET (ESE = cSE/Aem vs. EQE = QE/cAem) deve ser baseada na consideração do tipo de sonda e dos canais com melhor sinal. Ambas as abordagens incluem correção de ruído de fundo de imagens por quadro, conforme descrito acima, para levar em conta as mudanças na autofluorescência ao longo do tempo. Eles não assumem nenhuma sobreposição da luz de excitação Aem no espectro de excitação Dem, o que geralmente é o caso devido ao design da sonda e à configuração do filtro do microscópio. As sondas de cadeia única podem usar qualquer um e a seleção é baseada no melhor sinal da sonda (brilho) para o ruído da câmera e para o sinal de fundo nos canais SE e QE. Para a sonda ICUE1 e as condições experimentais usadas aqui (tipos de células e hidrogel), SE tem um sinal mais forte do que QE. As sondas de cadeia dupla requerem o uso de ESE devido à distribuição não equimolar de fluoróforos doadores e aceptores. Para sondas que diminuem em FRET ao ligar o analito, como ICUE1, a eficiência do FRET pode ser "invertida" para apresentar uma mudança de sinalização positiva ao ligar o analito como fazemos aqui, com ESE = 1 - cSE/Aem ou EQE = QE/(Aem x QS).

A análise da PAF é sensível à correção adequada dos índices de FRET e à estimativa de Ei. Pode ser estimado com a mesma amostra de calibração usada para QS e um ensaio de eficiência FRET de endpoint convencional como Ei = 1-(QE/Dem) (imagem QE seguida de fotobranqueamento do aceptor e uma imagem Dem)28, mas deve-se tomar cuidado para minimizar o branqueamento acidental do doador. Descrevemos uma versão modificada em que a estimativa de Dem com base em Aem ajustada para QS é substituída, ou seja, Ei = 1 - (QE/(Aem x QS)). Alternativamente, Ei = cSE/Aem pode ser usado. A estimativa de Ei em células vivas requer que todas as sondas sejam conduzidas ao FRET completo. Isso é difícil de conseguir na prática para sondas, como ICUE1, que diminuem no FRET ao ligar o analito. Um cálculo in vitro de Ei usando lisados celulares e analito purificado é o melhor, mas fora do escopo deste trabalho. Aqui, recomendamos o uso de 2′,5′-didesoxiadenosina para diminuir o cAMP nas células. No entanto, um PAF relativo pode ser calculado usando uma estimativa de Ei derivada do nível basal de sinalização. Por esses motivos, os estudos geralmente relatam a razão FRET (como feito aqui) ou um FAP relativo com base na calibração do endpoint, onde a linha de base de sinalização antes da adição do agonista é o limite inferior e o sinal após a adição de um segundo agonista que satura a sinalização é o limite superior. A forscolina é frequentemente usada como um agonista de controle para saturar o sinal de cAMP. Alternativamente, um análogo de cAMP pode ser usado, como 8-Bromoadenosina 3',5'-monofosfato cíclico. Recomenda-se o uso de controles positivos na conclusão dos estudos para identificar possíveis alterações na via de sinalização entre os tratamentos experimentais.

O cálculo da resposta média de sinalização por célula requer a consideração de vários fatores. Primeiro, a razão FRET média deve ser calculada como a média das proporções em cada pixel dentro de uma célula, ou seja, (∑(QE⁄cAem))/(número de pixels), em vez da proporção da média QE e Aem em uma célula, ou seja, (∑QE)⁄(∑cAem). Embora este último não exija um mascaramento cuidadoso, pois o ruído de fundo é baixo, ele subestima severamente a verdadeira taxa média de FRET. No entanto, as proporções de pixels exigem cálculo de ponto flutuante e mascaramento binário cuidadoso da área da célula para definir as ROIs e evitar a inclusão de proporções espúrias geradas a partir do ruído de fundo fora da célula. Toda a área celular deve ser quantificada para evitar viés nos resultados da forma celular. O mascaramento pode precisar ser redefinido ao longo do tempo, dependendo das mudanças na forma da célula e da migração. Como alternativa, ROIs maiores que a célula podem ser usadas se os critérios de exclusão forem definidos para remover proporções de pixels de sinais QE e Aem que ficam bem abaixo dos níveis celulares e estão próximos dos níveis de fundo. Os métodos de análise descritos detalham as etapas básicas usadas neste trabalho para análise de FRET sem software/plugins especializados. Os fabricantes de microscópios e outros fornecedores vendem módulos adicionais para seu software de microscópio, que suportam análise raciométrica automatizada e FRET. Da mesma forma, o software ImageJ de domínio público possui vários plugins disponíveis para análise de partículas e FRET, como o RiFRET. Em segundo lugar, a razão FRET média baseada em pixels subestima a verdadeira proporção média da estrutura celular 3D porque uma imagem 2D é usada. Os sinais 2D representam e calculam a média ao longo do eixo z. O cálculo da distribuição espacial 3D das razões FRET em células vivas não é possível sem imagens 3D de alta velocidade (por exemplo, usando microscopia confocal de disco giratório). Este é um problema para culturas 2D e 3D, mas tem um efeito maior em 3D, pois mais da estrutura celular existe fora do plano. Isso é de grande preocupação para sondas que se localizam em estruturas celulares, como a sonda de membrana plasmática EPAC1 PM-ICUE. Ver Spiering et al. 2013 para sugestões para corrigir os efeitos da espessura celular nos cálculos de proporção24. A análise da distribuição de Aem pode ser usada para detectar se a sonda se acumula em regiões da célula e no plano de imagem ajustado. Isso também ajudará a interpretar a distribuição espacial das razões FRET e a eliminar resultados espúrios, por exemplo, identificando a saturação da sonda (ou seja, uma região Aem baixa terá baixa concentração de sonda e pode exibir saturação da sonda e alta razão FRET). Em terceiro lugar, diferentes níveis basais de FRET podem indicar uma diferença na eficiência da transfecção, expressão da sonda ou sinalização basal entre os grupos experimentais. A "Análise Relativa" (Etapa 10.1.1) ajuda a remover o desvio na razão FRET ao longo do tempo, se presente. Facilita a comparação da magnitude relativa das respostas entre as amostras, mas impede a comparação com o curso temporal da resposta para a amostra de referência (o gráfico de controle é uma linha plana). A "Análise Absoluta" (Etapa 10.1.2) facilita a comparação da taxa de resposta entre as amostras, mas dificulta a comparação da magnitude da resposta porque cada linha é dimensionada por uma constante diferente. Os estudos geralmente usam uma regressão linear na linha de base para corrigir o desvio na razão FRET ao longo do tempo.

O método 3D FRET descrito é uma maneira útil e prática de fabricar e realizar imagens de lapso de tempo de hidrogéis 3D carregados de células, que podem ser aplicados a outras sondas e modalidades de imagem. Outros sistemas FRET além de sondas binárias de cadeia única exigirão uma correção mais complexa de sinais baseados em intensidade, conforme discutido acima. Como alternativa, a imagem de fluorescência durante o tempo de vida do FRET (FLIM-FRET) pode ser usada para calcular a eficiência do FRET por meio de uma mudança no tempo de vida de emissão do doador da sonda. Ao contrário do FRET baseado em intensidade, o FLIM-FRET é insensível ao ruído de fundo, sangramento espectral, eficiência quântica e sensibilidade espectral do detector2. No entanto, os sistemas FLIM são caros, complexos e incomuns, e funcionam melhor com fluoróforos com decaimento de expoente único e sem escoamento FLIM 49. O método descrito também pode ser usado com plataformas de microscópio mais avançadas (por exemplo, FRET-TIRF, anisotropia de fluorescência e correlação espectral FRET). A aplicação deste método a imagens 3D com microscopia confocal e multifotônica de alta velocidade facilitará a análise da distribuição subcelular da resposta de sinalização e aumentará a precisão da análise de sinalização. Este método FRET 3D permitirá estudos avançados de biologia celular em microambientes celulares 3D simulados. Como tal, pode ser prontamente aplicado às necessidades de farmacologia e medicina regenerativa, incluindo o estudo da sinalização intercelular e a triagem da resposta a medicamentos em microtecidos à base de hidrogel projetados.

Divulgações

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores não têm conflitos a declarar.

Agradecimentos

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

Os autores reconhecem o apoio financeiro da Escola de Medicina Dentária da Universidade de Pittsburgh, o prêmio K01 AR062598 do National Institutes of Health e a concessão do P30 DE030740. Os autores também agradecem ao Dr. Jin Zhang pelo plasmídeo ICUE1, Wayne Rasband pelo desenvolvimento do ImageJ e Michael Cammer pela macro ImageJ.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Polidimetilsiloxano (PDMS) [Kit de Elastômero Sylgard 184]Fisher Scientific (Adesivos Ellsworth)NC0162601Reagentes
Dimetacrilato de Polietilenoglicol (PEGDM)Preparado de acordo com Lin-Gibson com PEG da Sigma Aldrich95904Reagentes
3- (Trimetoxissilil)metacrilato de propilaReagentes Sigma AldrichM6514
3- glicidoxipropiltrimetoxissilanoSigma Aldrich440167Reagentes
Dimetil FenilfosfonitaSigma Aldrich149470-5g
Reagentes 2,4,6-trimetilbenzoíla CloretoFisher ScientificAC244280100Reagentes
2-ButanonaFisher ScientificAC149670010Reagentes
Brometo de LítioFisher ScientificAC199871000Reagentes
IsopropanolSigma Aldrich190764 Reagentes
Sigmacote (reagente siliconizante)Sigma AldrichSL2Reagentes
Tolueno Reagentes Fisher ScientificAC36441-0010
Tamponados com Fosfato Salino (PBS)HycloneSH3025601Reagentes
Opti-MEM Soro Reduzido Médio, sem vermelho de fenol (meio sem fenol e soro)Life Technologies11058-021Reagentes
FuGENE HD Reagente de Transfecção (reagente de transfecção)PromegaE2311Reagentes
Cellstripper (célula solução de dissociação)Reagentes Corning25-056-CI
Redução do Fator de Crescimento Matrigel, Livre de FenolReagentes 356231 Corning
ForskolinSigma AldrichF6886Reagentes
Pontas de Pipeta (10,200,1,000 μ l) Fisher Scientific02-707-474, 02-707-478, 02-707-480Equipamento de laboratório descartável
Luvas de exame sem póFisher Scientific19-149-863BEquipamento de laboratório descartável
Folha de alumínioFisher Scientific01-213-100Equipamento de laboratório descartável
Punção de biópsia (3 mm)Miltex3332Equipamento de laboratório descartável
Lamínulas de vidroFisher Scientific12-544CEquipamento de laboratório descartável
Lamínulas de vidro pré-revestidas (epóxisilano)ArrayitCCSLEquipamento de laboratório descartável
Lâmina de vidroFisher Scientific12550DEquipamento de laboratório descartável
Frascos estéreis (15 ml, 50 ml cônicos)Fisher Scientific14-959-70C, 14-959-49AEquipamento de laboratório descartável
Prato de cultura de células (6- bem)Falcon351146Equipamento de laboratório descartável
Microscópio epifluorescente com platina motorizadaNikonMEA53100 (Eclipse TiE invertido)Equipamento de laboratório grande/não descartável
Suporte de amostra ajustável para palco XYNikon77011393Equipamento de laboratório não descartável
60X (1.3 NA) objetivo (CFI Plan Apochromat 60XH Lamda)NikonMRD01605Equipamento de laboratório não descartável
Fonte de luz CFP/YFP e suportes de filtro de excitação/emissão (fonte de luz e roda Lambda, sistema de filtro de emissão Lambda)Nikon (revendedor Sutter Instrument)77016231, 77016088Equipamento de laboratório não descartável Conjunto de
filtros CYF/YFPNikon (Chroma Technology Corp)77014928Equipamento de laboratório não descartável
Câmera (ORCA Flash 4.0 v1)Nikon (Hamamatsu revendedor)77054076Equipamento de laboratório não descartável
NIS-Elements 40.20.02 software de microscópioNikonMQS31100 Equipamento de laboratório não descartável
Prism (software de planilha e gráfico)GraphPad Software, IncVersão 6 Equipamentode laboratório não descartável
OmniCure S1000 UV Sistema de Lâmpada de Cura a Ponto com filtro de 365nm ou outra fonte de luz (λ = 365 ou 405)OmniCureS1000Equipamento de laboratório grande/não descartável
Auxiliar de pipeta Drummond Scientific Co.DP-100Equipamento de laboratório não descartável
HemacitômetroHausser ScientificReichert Bright-Line 1475Equipamento de laboratório não descartável
Câmara de dessecador a vácuo/desgaseificador Qualquerequipamento de laboratório grande/não descartável
Capuz para Cultura de Tecidos Qualquerequipamento de laboratório grande/não descartável
Capuz de Fumaça Química Qualquerequipamento de laboratório grande/não descartável
FornoQualquerequipamento de laboratório grande/não descartável
EspátulaQualquerequipamento de laboratório não descartável
CopoQualquerequipamento de laboratório não descartável
Incubadora Qualquerequipamento de laboratório grande/não descartável
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Referências

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