Method Article

Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

DOI:

10.3791/54148

⸱

July 25th, 2016

 ,  , 
1Center for Vaccine Development, Department of Pediatrics, University of Maryland School of Medicine, 2Mucosal Immunology and Biology Research Center, Massachusetts General Hospital for Children

In This Article

Summary

$$\rightleftharpoonup{xx}$$ $$\longleftharp{xx}$$, $$\longrightharp{xx}$$,

As células que crescem num ambiente tridimensional (3-D) representam uma melhoria significativa sobre o cultivo de células em ambientes 2-D (por exemplo, frascos ou pratos). Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo organot�ica 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivadas sob microgravidade fornecida pela rotação da parede dos vasos biorreatores (RWV).

Abstract

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Como as células que crescem em um ambiente tridimensional (3-D) têm o potencial para preencher muitas lacunas de cultivo celular em ambientes 2-D (ex., Frascos ou pratos). Na verdade, é amplamente reconhecido que as células crescidas em frascos ou pratos tendem a des-diferenciar-se e perder características especializadas dos tecidos a partir dos quais eles foram obtidos. Actualmente, existem essencialmente dois tipos de sistemas de cultura de 3-D, onde as células são semeadas em andaimes que imitam a matriz extracelular nativa (ECM): (a) modelos estáticos e modelos (b) utilizando biorreactores. O primeiro avanço foi a modelos estáticos em 3-D. modelos 3-D usando biorreatores como a parede do vaso rotativo (RWV) biorreatores são um desenvolvimento mais recente. O conceito original dos biorreatores RWV foi desenvolvido no Centro Espacial Johnson da NASA no início de 1990 e é acreditado para superar as limitações dos modelos estáticos, tais como o desenvolvimento de hipóxia, núcleos necróticos. Os biorreatores RWV pode contornar thé problema proporcionando dinâmica dos fluidos, que permitem a difusão eficiente de nutrientes e de oxigénio. Estes biorreatores consistem em uma base rotador que serve para apoiar e girar dois formatos diferentes de recipientes de cultura que diferem pelo seu tipo de fonte de aeração: (1) lenta ficar vasos laterais (STLVs) com um oxigenador de co-axial no centro, ou (2 ) Os navios de elevado coeficiente (HARVs) com oxigenação através de uma membrana de transferência de gás de borracha de silicone plana. Estes navios permitir a transferência de gás eficiente, evitando a formação de bolhas e consequente turbulência. Estas condições resultam em fluxo laminar e força de cisalhamento mínima que os modelos reduzida gravidade (microgravidade) no interior do recipiente de cultura. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob microgravidade fornecida por o bioreactor RWV. </ P>

Introduction

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O primeiro avanço na construção de um modelo 3-D foi relatado no início de 1980, quando os cientistas começaram a investigar diferentes tipos de andaime (por exemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV e fibronectina) e cocktails de fatores de crescimento para melhorar célula-célula e interacções ECM de modelos 3-D "estáticos" 1-7. Desde então, o problema principal com estes modelos tem sido limitações na transferência de nutrientes e de oxigénio dentro das construções de médio e de tecido 8. Em contraste com as células no ambiente in vivo que recebe um fluxo constante de nutrientes e de oxigénio a partir de redes em torno dos vasos sanguíneos, a natureza estática destes modelos dificulta a distribuição eficaz deles para as células. Por exemplo, os agregados celulares gerados em modelos in vitro estáticos que excedem alguns milímetros de tamanho irá invariavelmente desenvolver hipóxicas, centros necróticos 9. Os biorreatores RWV pode contornar este problemafornecendo a dinâmica dos fluidos, que permitem a difusão eficiente de nutrientes e oxigénio 10-12. No entanto, até à data, os trabalhos utilizando biorreactores RWV têm sido limitados à inclusão de um ou dois tipos de células 13-17. Além disso, em vez de uma orientação espacial semelhante a tecidos nativos, as células formaram agregados celulares. A principal razão para estas limitações tem sido a falta de uma estrutura de suporte capaz de incorporar células de uma forma integrada. Os andaimes utilizados nos biorreatores RWV até à data consistem, com poucas exceções 16-18, principalmente de microesferas sintéticas, cilindros tubulares ou pequenas folhas 13-15,19-23. Estes são materiais rígidos e cuja composição de flexibilidade não pode ser manipulado, e para a qual as células são ligadas à sua superfície. Assim, é improvável que estes modelos irá proporcionar um sistema no qual a avaliar, de uma forma integrada, os vários componentes celulares, tais como células do estroma (por ex., F ibroblastos, células do sistema imunológico e endoteliais) que should ser disperso dentro do andaime para imitar de perto o tecido humano.

Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais, fibroblastos e 24. Estas células foram cultivadas sob microgravidade fornecer pelo biorreator RWV 13,25-30. No nosso modelo 3-D, o ECM possui muitas propriedades distintas, tais como uma osmolalidade semelhante ao meio de cultura (por ex., Sistemas de retenção de difusão insignificante durante a cultura) e a capacidade de incorporar células e outras proteínas da matriz extracelular relevantes, bem como a rigidez adequada para ser utilizada em biorreactores de 24. Os sistemas biológicos são muito complexos, e ao longo dos últimos anos, tem havido uma mudança no foco da pesquisa da mucosa para o exame de interacções de células com o meio envolvente, em vez de estudá-los no isolation. Em particular, a importância das interacções célula-célula em influenciar a sobrevivência das células do intestino e a diferenciação está bem documentada 31-34. Especificamente, a comunicação entre as células epiteliais e os seus nicho tem uma profunda influência sobre a expansão de células epiteliais e diferenciação 35. Com efeito, é amplamente aceite que não só a célula-célula mas também as interacções célula-ECM são essenciais para a manutenção e diferenciação de células epiteliais em modelos de cultura de 3-D. Estudos anteriores demonstraram que as proteínas de ECM intestino, tais como colagénio I 24,36,37, laminina e fibronectina 38 39 são instrumentais em influenciar células epiteliais intestinais para adquirir orientação espacial semelhante à mucosa nativa. Assim, o desenvolvimento de novas tecnologias, como o nosso modelo 3-D 24, que pode imitar a diversidade é necessária fenotípica do intestino se pesquisadores pretendem recriar a arquitectura celular e estrutural complexoe função do microambiente intestinal. Esses modelos representam uma ferramenta importante no desenvolvimento e avaliação de novos medicamentos orais e vacinas candidatas.

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Protocol

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Declaração de ética: Todas as amostras de sangue foram coletadas de voluntários que participaram no número de protocolo HP-00040025-1. A Universidade de Maryland Institutional Review Board aprovou este protocolo e autorizou a coleta de amostras de sangue de voluntários saudáveis ​​para os estudos incluídos neste manuscrito. O objetivo deste estudo foi explicado aos voluntários, e todos os voluntários deram informados, assinaram termo de consentimento antes da coleta de sangue.

Nota: Veja a Tabela 1 para a preparação suplemento de meio. Ver Tabela 2 para a preparação de meios de cultura a 3-D.

1. Preparação de recipientes de cultura

  1. Desapertar a tampa da porta de enchimento do ml-embarcação 50 e preencha com 50 ml de meio de cultura estéril (por exemplo., RPMI). Efectuar todos os procedimentos sob condições estéreis em uma capa laminar.
  2. Coloque a tampa e limpe qualquer meio derramado em qualquer superfície com etanol 70%.
  3. Autorizará a embarcação a incubcomeu durante pelo menos 15 min a O / N à temperatura ambiente.
  4. Utilizar a porta de enchimento de se desfazer o meio de cultura e adicionar 30 ml de meio de cultura 3-D.
  5. Limpe qualquer meio derramado em qualquer superfície com etanol 70%.

2. Preparação das Células

  1. Linhagem humana de células epiteliais (HCT-8) 24,40.
    1. Células de cultura em meio RPMI suplementado com 100 U / ml de penicilina, 100 ug / ml de estreptomicina, 50 ng / ml de gentamicina, 2 mM de L-glutamina, piruvato de sódio 1 mM, HEPES a 10 mM de tampão e soro fetal de bovino inactivado pelo calor a 10% (FBS ) (suplemento 1). A 70% de confluência, as células de divisão em uma proporção de 1: 5.
  2. Fibroblastos humanos (células do cólon CCD-18Co) 24,41.
    1. Células de cultura em meio de Basal de Eagle enriquecido com suplemento de 1 em confluência, as células de divisão em uma proporção de 1: 3..
  3. Veia Umbilical Humana Células endoteliais (HUVEC) 24,42.
    1. Células de cultura em Meio Basal Endotelial (EBM) meio enriquecido com 100 ug / ml de heparina, 3 ug / ml de Suplemento de Crescimento de Células Endoteliais (ECGS), e Suplemento 1 a 70% de confluência, as células de divisão em uma proporção de 1:. 2.
  4. Os linfócitos / monócitos
    1. Isolar células mononucleares do sangue periférico (PBMC) a partir do sangue por centrifugação com gradiente de densidade usando técnicas padrão 43.
      1. Resumidamente, utilizando uma pipeta de 10 ml-, adicionar cuidadosamente 30 ml de sangue diluído (1: 1 sangue: Solução Salina Tamponada com Fosfato (PBS)) para um tubo de 50 mL cónico contendo 10 ml de meio de centrifugação de densidade. Após o passo de centrifugação, linfócitos e monócitos vai residir no "branco" camada entre os meios de centrifugação de densidade e camadas de plasma.
      2. Recolher a camada de branco, utilizando uma pipeta de transferência. Evitar contaminação de granulócitos através da limitação da recolha de meios de centrifugação de densidade. Depois de lavar 43, uSE PBMC como é ou criopreservadas em N2 líquido.
        Nota: É importante destacar que consiste em grande parte de PBMC de linfócitos e monócitos, com uma pequena proporção de células dendríticas e outros tipos de células.
  5. Cresça todas as células sob condições de cultura padrão, a 37 ° C numa atmosfera de 5% de CO 2.

3. Preparação de células de colágeno-incorporados

  1. Determinar o número de inserções necessário, com base no número de condições experimentais para ser ajustado para cima. Coloque o número apropriado de inserções para os poços de uma placa de 6 poços.
  2. Prepara-se uma suspensão de fibroblastos e HUVEC:
    1. Lavam-se as frascos de duas vezes em PBS e separar as células usando tripsina, 0,25% (1x), com etilenodiaminotetra-acetato 0,05% de tripsina-tetrassódico (tripsina-EDTA). Adicionar uma solução de tripsina suficiente para cobrir a totalidade da área da superfície da cultura de células. Descolamento geralmente ocorre dentro de 5 a 15 min
    2. coletarcélulas isoladas em um tubo de 50 ml contendo 30 ml de meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) e 30% de FBS médio.
    3. Centrifuga-se o tubo a 500 xg durante 10 min.
    4. Ressuspender as células em 30 ml de DMEM-30% FBS forma.
    5. Contar o número total de células viáveis ​​por diluição de 20 ul das células ressuspensas com 20 ul de tripano de corante azul. Carregar o hemocitómetro com a mistura de células. PBMC viáveis ​​será branco claro; inviável PBMC irá adquirir o corante e tornar-se azul.
      1. Ressuspender cada tipo de células em DMEM-FBS a 30% meio a uma concentração de 5 - 8 x 10 7 células ml - 1.
  3. Preparar géis de colagénio contendo células
    Nota: Cada vaso irá requerer a preparação de ~ 5 ml de gel de colagénio contendo as células.
    1. Num tubo de 50 mL cónico-se preparar a mistura de colagénio por adição de 1 x meios DMEM suplementado com 50 ug / ml de gentamicina, 2 mM de L-glutamina e 10% de calor-inactivatEd FBS mais 3 mg / ml de colagénio bovino-I, 10 ug / laminina ml, 40 ug / mL de colagénio IV, 10 ug / mL de fibronectina, de 2 ug / ml de proteoglicano de sulfato de heparina e de NaOH a 15 mM (para atingir o pH fisiológico).
    2. Fechar o tubo e misturar por inversão do várias vezes até que a mistura está completamente homogeneizada. Evitar a formação de bolhas.
      IMPORTANTE: Mantenha a mistura em gelo para evitar gelificação.
      1. Passo crítico: Se a mistura desenvolve uma aparência ácida (cor amarelada), adição de algumas gotas de NaOH 1 N estéril para neutralizar a mistura.
    3. Adicionar HUVEC e concentrada fibroblastos a uma densidade de 1,0 - 1,2 e 1,5 - 2,0 x 10 6 células / ml, respectivamente para o colagénio-mistura enriquecida (descrito acima). Feche os tubos e misturar por inversão do várias vezes até que a mistura está completamente homogeneizada. Evitar a formação de bolhas. IMPORTANTE: Mantenha a mistura em gelo para evitar gelificação.
    4. Adicionar 4 - 5 ml de colagénio contendo célulasgel para cada inserção, previamente carregado dentro de um poço de placa 6, e deixou-se gelify na capa com pouco ou nenhum movimento, durante 1 h.
    5. Após 1 h, transferir a placa de 6 poços a uma temperatura de 37 ° C, 5% de CO2 durante 1 - 2 horas adicionais.
    6. Retorno da placa de 6 poços para a capa, e com a ajuda de um fórceps estéril assepticamente e bisturi de corte da membrana a partir da inserção de retirar o gel contendo as células a partir da membrana. Corte o gel destacada em pequenos quadrados (~ 5 x 5 mm).
    7. Adicionar os pequenos quadrados contendo as células em uma HARV 50-ml com a porta de enchimento.
  4. Prepara-se uma suspensão de 8 HCT-células epiteliais:
    1. Lavam-se as frascos de duas vezes em PBS e separar as células usando tripsina, 0,25% (1x), com tratamento com tripsina-EDTA. Adicionar uma solução de tripsina suficiente para cobrir a totalidade da área da superfície da cultura de células. Descolamento geralmente ocorre dentro de 10 a 15 min.
    2. Recolher as células isoladas em 30 mL de DMEM-30% FBS forma.
    3. CentrifUGE meio com FBS a 30% de DMEM-tubo contendo a 500 xg durante 10 min.
    4. Ressuspender as células em 30 ml de DMEM-30% FBS forma.
    5. Contar o número total de células viáveis ​​como descrito em 3.2.5.
    6. Ressuspender as células epiteliais HCT-8 em DMEM-FBS a 30% no meio de uma concentração de 10 células 7 ml - 1.
    7. Adicionar 1 ml das células epiteliais HCT-8 concentrado em 50 ml HARV usando a porta de enchimento.
  5. Ao utilizar a porta de enchimento, adicionar meio de cultura adicional 3-D até que o recipiente está quase cheio (~ 20 ml).
  6. Coloque a tampa e limpe a borda do orifício de enchimento com 70% de etanol.
  7. Coloque uma seringa em cada porto de seringa da RWV: coloque uma seringa ml 5 contendo 3-4 ml de meio de cultura 3-D em um porto e uma seringa de 5 ml vazio na outra porta.
  8. Remover quaisquer bolhas visíveis puxando para a seringa vazia, enquanto aproximadamente o mesmo volume de meio é injectado através do outro orifício de seringa.
  9. Coloque os vessels no biorreator, ligue a alimentação e defina a velocidade para cerca de 13 a 14 rotações por minuto.
    Nota: passo crítico: velocidade de rotação pode necessitar de ser ajustado várias vezes durante uma experiência para manter as células que orbitam no interior do vaso, evitando assim o contacto com as paredes dos vasos.
  10. Células de cultura a 37 ° C, 5% de CO 2 sob microgravidade, fornecidos pelo biorreator RWV.
  11. meio de cultura mudam a cada 3 - 4 dias, substituindo cerca de 30 ml com meio de cultura 3-D fresco.
  12. Após 4 dias (± 1 dia), remova os navios do biorreator e adicionar linfócitos / monócitos aos vasos (2 x 10 7 / vaso).
  13. Colocar os vasos de volta no bioreactor a 37 ° C, 5% de CO 2 durante um adicional de 5 dias (± 1 dia).
  14. Após os 5 dias adicionais (dia 9 da cultura), adicionar linfócitos / monócitos aos vasos (2 x 10 7 / vaso) e continuar as culturas para até 12 dias adicionais.
  15. meio de cultura mudam a cada 3 - 4 dias, substituindo cerca de 30 ml com meio de cultura 3-D fresco.

4. Colheita 3-D Culturas para Histologia

  1. Com o auxílio de uma pipeta de transferência de colheita de cada fragmento de gel pequeno, agora chamado "construção", numa placa de seis poços contendo 10 ml de tampão de formalina a 10%. Deixar durante 3 h à TA ou a 12 - 16 h a 4 ° C.
  2. Prepare o processamento de tecidos e cassetes de incorporação, rotulando e adicionando dois pedaços de almofadas de espuma biópsia em cada cassete.
  3. Mergulhar as cassetes em tampão de formalina a 10%.
  4. Com o auxílio de uma pinça colocar as construções-fixas entre as duas almofadas de espuma.
  5. Mergulhar as cassetes em tampão de formalina a 10%.
  6. Prosseguir com os procedimentos padrão para a incorporação, corte e coloração 44.

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Results

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Anteriormente temos manipulado um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob condições de microgravidade 24 (Figura 1). Os fibroblastos e as células endoteliais foram embebidos numa matriz de colagénio I enriquecido com proteínas de membrana basal intestino adicional 45 (isto é., Lamin...

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Discussion

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Neste artigo, descreve-se o desenvolvimento de um modelo de bioengenharia da mucosa intestinal humana composta de múltiplos tipos de células incluindo linfócitos primários humanos, fibroblastos e células endoteliais, bem como linhas de células epiteliais intestinais 24. Neste modelo 3-D, as células são cultivadas numa matriz extracelular rica em colagénio em condições de microgravidade 24.

Como descrito anteriormente, as principais características deste modelo são:

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Disclosures

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Os autores declaram que um Pedido de Patente Não Provisório dos EUA foi depositado no Escritório de Marcas e Patentes dos EUA (Número: 13/360.539).

Acknowledgements

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Este trabalho foi apoiado, em parte, pelas bolsas federais de pesquisa NIAID, NIH, DHHS R01 AI036525 e U19 AI082655 (CCHI) para MBS e por DK048373 de concessão do NIH para AF. O conteúdo é de responsabilidade exclusiva dos autores e não representa necessariamente as opiniões oficiais do Instituto Nacional de Alergia e Doenças Infecciosas ou dos Institutos Nacionais de Saúde.

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Materials

List of materials used in this article
NameCompanyCatalog NumberComments
Biorreator de Parede Rotativa Independente (RWV) de Rotador Quádruplo/Vaso de Parede Rotativa Independente SyntheconRCCs-4DQPara até 4 vasos. Modelos com mais ou menos vasos também estão disponíveis.
Recipiente descartável de 50 mlSyntheconD-405Caixa com 4 vasos
HCT-8 células epiteliais ATCCCCL-244
CCD-18Co Fibroblastos ATCCCRL-1459
Células Endoteliais da Veia Umbilical HumanaATCCCRL-1730HUVEC
Fator de Crescimento de Fibroblastos-Básico Fator deF0291bFGF
SigmaS7901SCF
 SigmaH1404HGF
Endothelin 3SigmaE9137
LamininSigmaL2020Isolado de tumor de engelbreth-Holm-Swarm de camundongo
Fator de crescimento endotelial vascular FatorVEGFV7259
Santa Cruzsc-4377(LIF
AdeninaSigmaA2786
InsulinaSigmaI-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine SigmaT-6397T3
Toxina da CóleraSigmaC-8052
FibronectinaBD354008Isolado do plasma humano
apo-transferrinaSigmaT-1147
HeparinaSigmaH3149
Heparano sulfato  proteoglicanoSigmaH4777Isolado da membrana basal do camundongo  Tumor Engelbreth-Holm-Swarm
Colágeno IVSigmaC5533Isolado da placenta
humana Soro fetal bovino inativado pelo calor Invitrogen10437-028
D-MEM, póInvitrogen12800-017
10% formalina– PBS Fisher ScientificSF100-4
 InvitrogenA1064401
tripsina-EDTA Fisher ScientificMT25-052-CI
Piruvato de SódioInvitrogen11360-070
Gentamicina Invitrogen15750-060
Penicilina/estreptomicina Invitrogen15140-122
L-GlutaminaInvitrogen25030-081
HepesInvitrogen15630-080
Presunto F-12Invitrogen11765-054
Basal Médio EagleInvitrogen21010-046BME
RPMI-1640Invitrogen11875-093
Endotelial Suplemento deLonzaCC-3156EBM-2
Millipore02-102ECGS
Células-Tronco Sigma Fator de Crescimento de Hepatócitos Inibidor de Leucemia Sigma Colágeno tipo I bovino crescimento de células endoteliais médio basal

References

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