Desenvolvimento de um modelo organotípicas multicelular tridimensional da Mucosa Intestinal Humano cultivadas sob microgravidade

Summary

As células que crescem num ambiente tridimensional (3-D) representam uma melhoria significativa sobre o cultivo de células em ambientes 2-D (por exemplo, frascos ou pratos). Aqui nós descrevemos o desenvolvimento de um modelo organot�ica 3-D multicelular da mucosa intestinal humana cultivadas sob microgravidade fornecida pela rotação da parede dos vasos biorreatores (RWV).

Abstract

Como as células que crescem em um ambiente tridimensional (3-D) têm o potencial para preencher muitas lacunas de cultivo celular em ambientes 2-D (ex., Frascos ou pratos). Na verdade, é amplamente reconhecido que as células crescidas em frascos ou pratos tendem a des-diferenciar-se e perder características especializadas dos tecidos a partir dos quais eles foram obtidos. Actualmente, existem essencialmente dois tipos de sistemas de cultura de 3-D, onde as células são semeadas em andaimes que imitam a matriz extracelular nativa (ECM): (a) modelos estáticos e modelos (b) utilizando biorreactores. O primeiro avanço foi a modelos estáticos em 3-D. modelos 3-D usando biorreatores como a parede do vaso rotativo (RWV) biorreatores são um desenvolvimento mais recente. O conceito original dos biorreatores RWV foi desenvolvido no Centro Espacial Johnson da NASA no início de 1990 e é acreditado para superar as limitações dos modelos estáticos, tais como o desenvolvimento de hipóxia, núcleos necróticos. Os biorreatores RWV pode contornar thé problema proporcionando dinâmica dos fluidos, que permitem a difusão eficiente de nutrientes e de oxigénio. Estes biorreatores consistem em uma base rotador que serve para apoiar e girar dois formatos diferentes de recipientes de cultura que diferem pelo seu tipo de fonte de aeração: (1) lenta ficar vasos laterais (STLVs) com um oxigenador de co-axial no centro, ou (2 ) Os navios de elevado coeficiente (HARVs) com oxigenação através de uma membrana de transferência de gás de borracha de silicone plana. Estes navios permitir a transferência de gás eficiente, evitando a formação de bolhas e consequente turbulência. Estas condições resultam em fluxo laminar e força de cisalhamento mínima que os modelos reduzida gravidade (microgravidade) no interior do recipiente de cultura. Aqui, descrevemos o desenvolvimento de um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob microgravidade fornecida por o bioreactor RWV. </ P>

Introduction

O primeiro avanço na construção de um modelo 3-D foi relatado no início de 1980, quando os cientistas começaram a investigar diferentes tipos de andaime (por exemplo., Laminina, colágeno tipo I, colágeno IV e fibronectina) e cocktails de fatores de crescimento para melhorar célula-célula e interacções ECM de modelos 3-D "estáticos" ^1-7. Desde então, o problema principal com estes modelos tem sido limitações na transferência de nutrientes e de oxigénio dentro das construções de médio e de tecido ^8. Em contraste com as células no ambiente in vivo que recebe um fluxo constante de nutrientes e de oxigénio a partir de redes em torno....

Protocol

Declaração de ética: Todas as amostras de sangue foram coletadas de voluntários que participaram no número de protocolo HP-00040025-1. A Universidade de Maryland Institutional Review Board aprovou este protocolo e autorizou a coleta de amostras de sangue de voluntários saudáveis ​​para os estudos incluídos neste manuscrito. O objetivo deste estudo foi explicado aos voluntários, e todos os voluntários deram informados, assinaram termo de consentimento antes da coleta de sangue.

Nota: Veja a Tabela 1 para a preparação suplemento de meio. Ver Tabela 2 para a preparação de meios de cultura a 3-D.

1. Prepara....

Results

Anteriormente temos manipulado um modelo organotípico 3-D multicelular da mucosa intestinal humana composta por uma linha de célula epitelial intestinal e linfócitos humanos primários, células endoteliais e fibroblastos cultivados sob condições de microgravidade ²⁴ (Figura 1). Os fibroblastos e as células endoteliais foram embebidos numa matriz de colagénio I enriquecido com proteínas de membrana basal intestino adicional ⁴⁵ (isto é., Lamin.......

Discussion

Neste artigo, descreve-se o desenvolvimento de um modelo de bioengenharia da mucosa intestinal humana composta de múltiplos tipos de células incluindo linfócitos primários humanos, fibroblastos e células endoteliais, bem como linhas de células epiteliais intestinais ^24. Neste modelo 3-D, as células são cultivadas numa matriz extracelular rica em colagénio em condições de microgravidade ^24.

Como descrito anteriormente, as principais características deste modelo são:

Materials

List of materials used in this article

Name	Company	Catalog Number	Comments
Biorreator de Parede Rotativa Independente (RWV) de Rotador Quádruplo/Vaso de Parede Rotativa Independente	Synthecon	RCCs-4DQ	Para até 4 vasos. Modelos com mais ou menos vasos também estão disponíveis.
Recipiente descartável de 50 ml	Synthecon	D-405	Caixa com 4 vasos
HCT-8 células epiteliais	ATCC	CCL-244
CCD-18Co Fibroblastos	ATCC	CRL-1459
Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana	ATCC	CRL-1730	HUVEC
Fator de Crescimento de Fibroblastos-Básico	Fator de	F0291	bFGF
	Sigma	S7901	SCF
	Sigma	H1404	HGF
Endothelin 3	Sigma	E9137
Laminin	Sigma	L2020	Isolado de tumor de engelbreth-Holm-Swarm de camundongo
Fator de crescimento endotelial vascular	Fator	VEGF	V7259
	Santa Cruz	sc-4377	(LIF
Adenina	Sigma	A2786
Insulina	Sigma	I-6634
3,3',5-triiodo-L-thyronine	Sigma	T-6397	T3
Toxina da Cólera	Sigma	C-8052
Fibronectina	BD	354008	Isolado do plasma humano
apo-transferrina	Sigma	T-1147
Heparina	Sigma	H3149
Heparano sulfato  proteoglicano	Sigma	H4777	Isolado da membrana basal do camundongo  Tumor Engelbreth-Holm-Swarm
Colágeno IV	Sigma	C5533	Isolado da placenta
humana Soro fetal bovino inativado pelo calor	Invitrogen	10437-028
D-MEM, pó	Invitrogen	12800-017
10% formalina– PBS	Fisher Scientific	SF100-4
	Invitrogen	A1064401
tripsina-EDTA	Fisher Scientific	MT25-052-CI
Piruvato de Sódio	Invitrogen	11360-070
Gentamicina	Invitrogen	15750-060
Penicilina/estreptomicina	Invitrogen	15140-122
L-Glutamina	Invitrogen	25030-081
Hepes	Invitrogen	15630-080
Presunto F-12	Invitrogen	11765-054
Basal Médio Eagle	Invitrogen	21010-046	BME
RPMI-1640	Invitrogen	11875-093
Endotelial Suplemento de	Lonza	CC-3156	EBM-2
	Millipore	02-102	ECGS