Artigo de método

Complexo polielectrólito de ligação à heparina de entrega osteogénica Factor de Crescimento Domínio

DOI:

10.3791/54202

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22 de agosto de 2016

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1Department of Orthopaedic Surgery, Yong Loo Lin School of Medicine, National University of Singapore, 2Centre for Research in Medical Devices (CÚRAM), National University of Ireland Galway, 3Department of Bioengineering, Faculty of Engineering, National University of Singapore, 4Tissue Engineering Program, National University of Singapore, 5Department of Orthopaedic Surgery and the Orthopaedic Hospital Research Center, University of California, Los Angeles

Neste artigo

Resumo

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Complexos polieletrolíticos automontados (PEC) fabricados a partir de heparina e protamina foram depositados em grânulos de alginato para aprisionar e regular a liberação de fatores de crescimento osteogênicos. Essa estratégia de entrega permite uma redução de 20 vezes da dose de BMP-2 em aplicações de fusão espinhal. Este artigo ilustra os benefícios e a fabricação de PECs.

Resumo

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Durante cirurgias ósseas reconstrutivas, quantidades suprafisiológicas de fatores de crescimento são empiricamente carregado em andaimes para promover a fusão óssea bem sucedido. Grandes doses de agentes biológicos muito potentes são necessários devido ao factor de instabilidade do crescimento, como resultado da degradação enzimática rápida, bem como as ineficiências transportadora na localização de uma quantidade suficiente de factor de crescimento em locais de implante. Assim, estratégias que prolongam a estabilidade de factores de crescimento, tais como BMP-2 / NELL-1, e controlar a sua libertação pode realmente diminuir a dose eficaz e, assim, reduzir a necessidade de doses mais elevadas durante as futuras cirurgias de regeneração óssea. Isto por sua vez irá reduzir os efeitos secundários e os custos de factores de crescimento. PEC auto-montadas têm sido fabricados para proporcionar um melhor controlo de PMO-2 / NELL-1 entrega através de ligação à heparina e outro factor de crescimento bioactividade potenciam reforço, em estabilidade in vivo. Aqui, ilustramos a simplicidade de fabricação PEC que auxilia na DELIVERY de uma variedade de factores de crescimento durante cirurgias reconstrutivas ósseas.

Introdução

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A incidência de pseudoartrose tem sido relatada como sendo tão elevado como 10 a 45% em fusão espinal degenerativa e revisão cirurgias espinhais 1. Para reduzir a taxa de pseudoartrose durante a fusão da coluna e outras cirurgias reconstrutivas ósseas, factores de crescimento osteogénico, tais como BMP-2, Nell-1 e um factor de crescimento derivado de plaquetas (PDGF) foram introduzidos para promover a osteogénese de novo. Entre estes, BMP-2 é uma escolha popular para a fusão espinhal 2. Embora a potência de BMP-2 na indução e facilitando a formação de osso novo foi bem estabelecido 3; complicações clinicamente significativos, tais como a formação heterotópica de osso, seroma e formação de hematoma, resposta inflamatória, radiculite, osteólise corpo vertebral, e ejaculação retrógrada continuam a ser questões de preocupação devido às quantidades suprafisiológicas utilizados 4,5.

Por isso, diminuindo a dose de PMO-2 continua a ser uma estratégia relevante em pelotenta a minimizar os efeitos colaterais. Além disso, sistemas de veículo eficazes são necessários para suprimir a libertação brusca inicial de BMP-2 observado em sistemas veiculares de esponja de colagénio contemporânea e aumentar ainda mais a entrega prolongada e localizada desta citoquina potente. A auto-montagem da camada-por-camada da alternância polielectrólitos catiónicos e aniónicos podem ser utilizados como um método sintonizável para construir-se complexos de polielectrólitos na superfície de matrizes de andaime ou materiais implantáveis ​​6. A este respeito, a heparina (conhecida por ter a maior densidade de carga negativa de todos os agentes biológicos) tem sido reconhecido que se ligam avidamente com uma variedade de factores de crescimento através de domínios de ligação a heparina e electrostáticas. Com efeito, a heparina tem sido mostrada a prolongar a meia-vida e assim potenciar a bioactividade de vários factores de crescimento.

Com base nisso, o nosso grupo de um protocolo adaptado de auto-montagem da camada-por-camada para o fabrico de um complexo à base de polielectrólito heparina (PEC) que cargas e preserva as bioatividades de fatores de crescimento osteogénico durante a imobilização 7,8. O núcleo microesferas de alginato foi fabricado por reticulação de resíduos de alginato com catiões divalentes de cálcio ou estrôncio α-L-guluronato (L). O núcleo é uma matriz de alginato biodegradável andaime; que depois da implantação, é reabsorvido no leito de fusão proporcionando espaço para crescimento ósseo. A poli-L-lisina (PLL) ou protamina é utilizada como a camada de catiónico para entrelaçar com tanto a matriz de andaime (neste caso, o núcleo de alginato transportador micropérola) e a heparina carregada negativamente; enquanto que as funções da camada de heparina aniónico para estabilizar e localizar factores de crescimento carregados. A camada tripla PEC foi mostrada para aumentar a capacidade de carga do factor de crescimento num modelo suíno 9. Recentemente, os transportadores de PEC tenham sido demonstrado com sucesso para reduzir a dose eficaz de BMP-2 em pelo menos 20 vezes em ratos 10 e modelos de suíno de fusão vertebral 8.

ntent "> Aqui, nós relatamos os métodos de PECs de fabricação para a entrega do fator de crescimento reforçada em fusão espinhal e as outras cirurgias ósseas de reconstrução utilizando BMP-2 como um factor de crescimento osteogénico modelo.

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Protocolo

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1. O alginato Preparação Solution

  1. Dissolver 200 mg de alginato de sódio (não irradiado) ou 400 mg de 8 MRad irradiado alginato de sódio em 10 ml dupla de água destilada e agitar durante 1 hora para alginato não-irradiada e 15 min para o alginato irradiado. Guardar a solução de alginato a 4 ° C durante a noite. Filtra-se a solução de alginato com um filtro de seringa de 0,2 um estéril antes da fabricação de microesferas de alginato.

2. O alginato Microbead Fabrication

  1. Desinfectar o gerador de talão eletrostática e bomba de seringa com 70% de etanol e colocá-los em uma classe II Biológica Gabinete de Segurança (Figura 1).
  2. Colocar uma bacia de vidro com uma barra de agitação magnética no interior do gerador talão.
  3. Defina o eletrodo braço do gerador de talão de 9 cm acima da bacia.
  4. Conecte o cabo de força do gerador talão para o parafuso serrilhado 2 do eletrodo braço, e despeje 80 ml ​​de solução SrCl2 nobacia.
  5. Carga de 5 ml de solução de alginato de 0,2 um filtrado para dentro do tubo da seringa e de borracha. Depois de ligar o tubo de borracha para o eléctrodo de braço, ligar a bomba de seringa a 5 ml / h durante 2 minutos para expelir o ar de dentro da tubagem e proporcionar a solução de alginato para a ponta do bocal. Desligue a bomba de seringa.
  6. Em seguida, liga o encapsulador e, em seguida, a bomba de seringa para iniciar a geração de microesferas. Definir a taxa de fluxo de alginato a 5 ml / hr ea tensão de 5,8 kV na encapsulator. Descartar as micropérolas gerados durante os dois primeiros minutos (ou a solução de alginato de 0,5 ml iniciais bombeado para fora da seringa), uma vez que estas microesferas tendem a ser irregular dimensionada e conformada.
  7. Recolha microbeads subsequentes na solução de cloreto de 0,2 M de estrôncio. Desligue a bomba de seringa e o encapsulator (nessa ordem) depois bombear o volume pré-planejada de solução de alginato. Repita esse procedimento para lotes posteriores de fabricação microbead. Após a conclusão, vire def a bomba de seringa em primeiro lugar, seguido pelo encapsulador.
  8. Armazenar as microesferas em 20 ml de solução de cloreto de 0,2 M de estrôncio a 4 ° C durante a noite para completar a ligação transversal e estabilizar o gel.

3. Tamanho Medição de microesferas de alginato

  1. Recolha 0,5 ml de microesferas de alginato com uma pipeta de plástico e coloque-o sobre uma lâmina de vidro. Ver as microesferas sob um microscópio óptico com aumento de 10x. Tome dez imagens das microesferas com um microscópio de câmara CCD. Guardar as imagens com barra de escala (500 mm) em formato TIFF com resolução de 2.048 x 1.536.
  2. Usando as ferramentas de comprimento em ImageJ, medir o tamanho das microesferas e barra de escala (Figura 2). Converter o comprimento a partir de microesferas de pixel para micrómetro.
    1. Clique nas ferramentas de linha e desenhar uma linha através do meio do cordão de alginato.
    2. Clique em "Analisar" na barra de menu e selecione "Measure". Uma janela pop-up irá aparecer.
    4. Converter o diâmetro do cordão de alginato com o comprimento real por meio da seguinte fórmula: comprimento de drageia de alginato / comprimento da barra de escala x 500 mm. Por exemplo, 1.420 (diâmetro medido pelo ImageJ) / 2.657 (comprimento da barra de escala medido pelo ImageJ) * 500 mm = 267 mm.
  3. Considere o tamanho médio das microesferas de 100 (média ± desvio padrão) medida que o tamanho representativas de cada lote de microesferas.

4. Esterilização

  1. Recolher as microesferas utilizando uma peneira de nylon de 100 um e lava-se as pérolas com água destilada duas vezes.
  2. Com uma espátula, transferir todas as microesferas feitas a partir de 0,1 ml de solução de alginato para um tubo de microcentrifugação de 2 ml e cobrir com gaze para evitar a secagem.
  3. Finalmente, esterilizar as microesferas por autoclavagem usando o modo de líquido (115 ° C, 15 min) ou em conformidade com mespecificações do ABRICANTE. Adicionar 1,5 L de água destilada para a câmara para impedir os grânulos de secagem.

5. Revestimento de protamina e heparina

  1. No interior do capuz NB-2, incubar as micropérolas estéreis, com 1 ml de 2 mg / ml de solução de protamina (esterilizada utilizando um filtro de seringa de 0,2 uM) durante 1 h à temperatura ambiente.
  2. Após incubação das microesferas durante 1 h (Passo 5.1), recolher 150 uL da solução de protamina para o teste de micro ácido bicinconínico (MicroBCA) (ver secção 6).
  3. Lavam-se as microesferas de protamina revestidos duas vezes com água duplamente destilada. Girar para baixo usando uma centrífuga de bancada superior a 200 xg durante 3 minutos à temperatura ambiente. Após centrifugação, aspirar a água através de uma seringa.
  4. Incubar protamina micropérolas revestido com 1 ml de 0,5 mg / ml de solução de heparina (esterilizada utilizando um filtro de seringa de 0,2 uM) durante 30 minutos para criar complexo polielectrólito (PEC).
  5. Após incubação a protamina revestidas microesferas fou 30 min (Passo 5.4), recolher 400 ml da solução de heparina para determinar o teor de heparina (secção 7).
  6. Após a incubação, lavar a heparina não ligada de PECs por lavagem duas vezes com água duplamente destilada.

Conteúdo 6. protamina

  1. Realizar o teste MicroBCA de acordo com as instruções do fabricante. Resumidamente, adicionar 150 ul de solução de protamina (recolhido antes e após a incubação com microesferas) numa placa de 96 poços. Adicionar 150 uL de solução de trabalho MicroBCA.
  2. Use solução de albumina (0, 0,5, 1, 2, 5, 10, 20, 40 e 200 ug / ml) como padrões de calibração.
  3. Incubar a mistura durante 60 min a 60 ° C. Medir a absorvância com um espectrofotómetro a 562 nm.
  4. Utilizar a curva padrão para determinar a concentração de protamina de cada amostra desconhecida de acordo com as instruções do fabricante.
  5. Determinar o teor de protamina das microesferas, subtraindo a quantidade total de protamina nasolução de revestimento (antes da incubação com microesferas) a partir da quantidade de protamina restante na solução de revestimento (após incubação com microesferas).

7. A heparina conteúdo

  1. Preparar 10 ml de solução de trabalho por dissolução de 4 mg de azul de toluidina e 20 mg de cloreto de sódio em ácido clorídrico 0,01 N.
  2. Adicionar 400 ul de amostra (a partir do passo 5.5) para a solução de trabalho a uma razão de 2: 3 e vortex durante 30 seg.
  3. Adicionar 600 ul de n-hexano (volume equivalente à solução do reagente de trabalho) e agitar com vortex a mistura para extrair o complexo heparina azul de toluidina.
  4. Aspirar 200 ul da fase aquosa através de uma seringa após a separação de fases.
  5. Medir a quantidade de azul de toluidina extraiu-un contido na fase aquosa utilizando um espectrofotómetro a 631 nm.
  6. Prepare soluções padrão de heparina de 0-20 ug / ml.
  7. Traçar a leitura 631 nm de cada padrão de heparina versus concentração de heparina em mg / meu. Utilizar a curva padrão para determinar a concentração de heparina de cada amostra.

8. confocal Imagem de estrutura de camada por camada

  1. Fabricar protamina, heparina e NELL-1 / BMP-2 analógico fluorescente CF-405 protamina (azul), CF 594 heparina (vermelho) e FITC NELL-1 / FITC (verde) BMP-2 + heparina + protamina acordo com o fabricante do folha de dados técnicos.
  2. Revestimento 100 ug micropérolas com 300 ul de análogo fluorescente (método de revestimento tal como descrito no 5,3-5,6) CF-405 protamina (azul) (2 mg / mL, incubação de 1 hora), CF 594 heparina (vermelho) (0,5 mg / ml, 30 min) e marcado com FITC NELL-1 / marcado com FITC (verde) BMP-2 (1,5 mg / ml, durante a noite). Lavam-se as microesferas por duas vezes com água destilada para eliminar a não ligado fluorescente protamina, heparina e NELL-1 / BMP-2.
  3. Observar a estrutura camada-por-camada (Figura 3) usando um microscópio confocal de ampliação 10X. 7

9. BMP-2e NELL-1 Captação e Lançamento

  1. Carregar 13,3 ul de 1,5 mg / ml de solução de BMP-2 ou NELL-1 em 100 g de PEC. Incubar PEC a 4 ° C sob agitação durante 30 rpm 10 h.
  2. Mergulhar as microesferas em 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS) a 37 ° C com agitação constante (30 rpm).
  3. Recolha de 1 ml do sobrenadante e substitui-la com 1 ml de PBS, depois 1, 3, 6, 10 e 14 dias.
  4. Avaliar a absorção e libertação eficiência de BMP-2, utilizando o método de ELISA de acordo com o protocolo do fabricante. Avaliar a absorção e libertação de eficiência NELL-1 usando o método de ensaio de proteína carboxibenzoílo quinolina-2-carboxaldeído (CBQCA) de acordo com o protocolo do fabricante.
  5. Determinar a libertação cumulativa no momento (t):
    libertação cumulativa no momento (t) = Lançamento no momento (t) + versão anterior no momento (t-1).
  6. Traçar libertação cumulativa de BMP-2 e NELL-1 contra o tempo.

10. in vitro A bioactividadede NELL-1

Nota: A bioactividade de NELL-1 libertado da PEC foi avaliada medindo a sua capacidade para aumentar a expressão de fosfatase alcalina (ALP) nas células estaminais de medula óssea de coelho (rBMSC).

  1. Semente 20000 rBMSCs por poço numa placa de 24 poços, permitindo-lhes crescer durante um dia com 1 ml de Meio de Eagle Modificado por Dulbecco (DMEM) + 10% de soro fetal bovino (FBS) a 37 ° C e CO2 a 5%.
  2. Após 24 h, substituir o meio com 1 ml de um meio osteogénico (DMEM suplementado com 10% de FBS, 2% de penicilina estreptomicina, / ml de ácido ascórbico a 50 ^ g, 10 mmol / L de beta-glicerofosfato, e 10 -8 mol / L dexametasona ) durante 7 dias a 37 ° C e 5% de CO 2.
  3. Coloque 300 ug PEC-NELL-1 (a partir do passo 8.2) e PEC dentro inserções de cultura de células (inserção TC) para manter os PEC em separado a partir das células (isto evita a lavagem de micropérolas PEC durante a mudança de meio osteogénico). Lugar TC inserir no 24 bem plcomeu por 14 dias.
  4. Uma vez a cada três dias, aspirado 1 ml de meio osteogênico, colocando uma agulha fora da inserção TC, e substituir com 1 ml de meio osteogênico fresco.
  5. Após 7 e 14 dias de incubação, determinar a actividade de ALP com um kit de ensaio de ALP em conformidade com o protocolo do fabricante do kit.
    1. Lisar as células com tampão de ensaio contendo 0,1% de Triton X-100 a 4 ° C durante 10 min. Raspar células aderidas usando um raspador de células. Incubar suspensão de células a 4 ° C sob agitação durante pelo menos 60 min.
    2. Centrifugar a suspensão de células a 2500 x g a 4 ° C durante 10 min. Recolhe-se o sobrenadante para o ensaio de ALP.
    3. Adicionar 50 uL de solução padrão de fosfatase alcalina diluída em série 200-0 ng / ml para os poços de uma placa de 96 poços. Os valores finais do padrão de fosfatase alcalina são 10, 5, 2,5, 1,2, 0,6, 0,3, 0,15 e 0 ng / poço.
    4. Adicionar o sobrenadante do passo 10.5.2 (50 uL / ​​poço) e dilui-se com diluição bpode ser prejudicado.
    5. Adicionar 50 ul de solução de fosfato (pNPP) substrato de p-nitrofenilo em cada poço. Misturar os reagentes agitando cuidadosamente a placa durante 30 segundos. Incubar a mistura durante 30 min no escuro. Medir a absorvância a 405 nm pelo leitor de placas.
    6. Calcular a actividade de ALP usando a curva de calibração.
  6. Determinar o teor de proteína utilizando o kit de ensaio de proteínas MicroBCA de acordo com as instruções do fabricante. Normalizar a actividade ALP dividindo a actividade de ALP em teor proteico.

Viabilidade 11. celular

  1. Incubar 200 mg de PEC-NELL-1 com 1 ml de DMEM + 10% FBS a 37 ° C durante 24 h para a 3- (4,5-dimetiltiazol-2-il) -2,5-difeniltetrazólio (MTT) ensaio.
  2. Semente rBMSCs 2.000 por cavidade (em 100 ul de DMEM com FBS a 10%) numa placa de 96 poços e incuba-se durante 1 dia a 37 ° C, 5% de CO 2.
  3. Substituir DMEM + FBS a 10% com 100 ul de extracto de PEC-NELL-1 / PEC e incubara 37 ° C, 5% de CO 2.
  4. Após 1 dia ou 3 dias de incubação, adicionar 10 uL de 5 mg de solução de MTT / ml e ainda mais incubar a 37 ° C, 5% de CO 2 durante 4 h na escuridão.
  5. Adicionar 100 ul de solução de DMSO a cada poço para dissolver cristais de formazano.
  6. Determinar a absorvância a 570 nm utilizando um leitor de microplacas.
  7. Calcula-se a taxa de crescimento relativa:
    figure-protocol-1

12. Embalagem para Andaime e BMP-2 & NELL-1 Carregando

  1. Embalar os PEC para dentro dos poros de um Policaprolactona de grau médico bioreabsorv�el - fosfato de tri-cálcio (mPCL-TCP) andaime utilizando uma espátula esterilizada dentro de uma câmara de NBS-2.
  2. Adicionar 1,5 mg / ml, solução de BMP-2 ou NELL-1 para o andaime mPCL-TCP embalado com PEC e incubar durante a noite a 4 ° C.

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Resultados

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No nosso transportador, protamina foi escolhido como substituto de poli-L-lisina, uma vez que tem propriedades químicas semelhantes e é aprovado pela FDA como um antídoto de heparina. resultados da microscopia óptica mostrou que as microesferas não-irradiados foram de forma esférica com um diâmetro de 267 ± 14 pM. (0,35 mm de bocal, taxa de fluxo de 5 ml / h e 5,8 kV). A maioria das micropérolas são irradiados de forma de lágrima. O diâmetro medido na parte turno das microesferas irradia...

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Discussão

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Este protocolo apresenta um método para a preparação de CPE através de camada-por-camada de auto-montagem. A estrutura de camada-por-camada é visualizada utilizando análogos fluorescentes de protamina, heparina, BMP-2 e NELL-1 e microscopia confocal. Captação e testes de libertação mostram que heparinas de PEC medeia a captação fator de crescimento osteogénico e solte. A eficiência de absorção do método de PEC é: NELL-1: 86,7 ± 2,7%, BMP-2: 70,5 ± 3,1%. O transportador PEC tem uma melhor modulação da libertação NELL-1 (...

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Divulgações

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Nós não temos nenhum conflito de interesses.

Agradecimentos

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Esses estudos foram financiados pelo National Medical Research Council Clinician Scientist - Individual Research Grant (CS-IRG) NMRC/CIRG/1372/2013 e NMRC EDG/0022/2008.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Ciências da Vida Acrodisc 25  mm Filtro de Seringa com 0.2  µ m Supor MembranaPALL PN4612Solução estéril de protamina, heparina por ultrafiltração
de 24 poçosCell Star 662160
Placa de 96 poços Nuclon Delta SurfaceThermo Fisher Scientific167008
(3-(4,5-Dimetiltiazol-2-il)-2,5-Difeniltetrazólio Brometo), MTTSigma AldrichM5655Meça a citotoxicidade de PEC-NELL-1
AcetonaFisher ScientificA/0600/17Precipitado CF-405
Protamina marcada
Alamar BlueInvitrogen, Life TechnologiesDAL 1025Meça a citotoxicidade do kit de
ensaio de ensaio de fosfatase alcalina (ALP)AnaspecAS-72146
Cloreto de amônioMerckArt 1145Reagente de parada na rotulagem FITC
Dimetil sulfóxido anidro (DMSO)Invitrogen, Life TechnologiesD12345Solvente para isotiocianato fluorescente I
Dimetil Sulfóxido ( DMSO)Sigma AldrichDissolve  formazan 
AutoclaveHirayamaHU-110Esterilize grânulos de alginato a vapor
Beta-glicerofosfatoSigmaAldrich G9422
BMP-2 (Kit de Enxerto Ósseo Infundido Grande II) Medtronic Sofarmor Danek, Memphis TN, EUA7510800Fator de Crescimento Osteogênico, a diálise é necessária para remover o componente estabilizador que interfere no acoplamento FITC
Carboxibenzoil quinolina-2-Carboxaldeído (CBQCA) Thermo Fisher ScientificA-6222Para quantificar a proteína NELL-1
Cell Strainer (100  µ m)BD Science352360Hold PEC para ALP assay
Cell Scraper 290  mm Largura da lâmina 20  mmSPL Life Science90030Separe a célula da placa de 24 poços
CF 405S, éster succinimidilSigma AldrichSCJ4600013Corante fluorescente azul para marcação de protamina
CF 594, HidrazidaSigma AldrichSCJ4600031Corante fluorescente vermelho escuro para marcação de heparina
CentrífugaBeckman CoulterMicrofuge 22R
Olympus FV1000
DexametasonaSigma AldrichD4902Componente do meio de crescimento osteogênico
Dextran Colunas de DessalinizaçãoPierce (Thermo Scientific) 43230
DMEMGibco 12320
BMP-2 Quantikine ELISA KitR& D SystemDBP200Determine a liberação de BMP-2
Soro Fetal Bovino FBSHycloneSV30160.03
Fluoesceína Isotiocianato, Isômero ISigma AldrichF7250Corante fluorescente verde para rotulagem NELL-1 e BMP-2
Inserções de Cultura de Células ThinCert,
Para placas de 24 Poços,		Greiner 662630Previne a lavagem do PEC ao trocar o meio osteogênico
Bomba de seringa Havard Appartus (11 plus)Aparelho Havard70-2208
n-hexano (>99%)Sigma Aldrich139386
heparinaSigma AldrichH3149Liga-se ao fator de crescimento osteogênico < br / > com domínio de ligação à heparina
Ácido clorídrico (37%)Merck100317Pasta de
incubadoraC8150
Kit de ensaio de proteína MicroBCAThermoscientific23235
Leitor de microplacasTecanInfinite M200para ensaios ALP e microBCA
Encapsulador de células NiscoNisco Engineering IncUnidade de encapsulamento VAR V1
Microscópio fluorescenteOlympusAndaime IX71
mPCL-TCP (Tamanho do poro é 1.3  mm)OsteoporePCL-TCP 0/90Hold PEC para estudo in vivo
Penicilina-Estreptomicina 10.000 unidade/ml, 100  mlHyclone Cell CultureSV30010Antibiótico
10x Solução salina tamponada com fosfato (PBS)VivantisPB0344-1L10x,
Poli-L-lisina de grau ultrapuro MW 15.000-30.000Sigma AldrichP2568Polication
Protamine Sulfato sal, de SalmãoSigma AldrichP4020Polycation
ShakerLabnetS2025
Tubo de Diálise de Pele de Cobra 3.500 MWCO 22  mm x 35 pésThermo Fisher Scientific68035Remova o FITC não reagido por diálise
Cloreto de SódioMerck1.06404.1000
Hidróxido de SódioQrecS5158
Bicarbonato de SódioUS BiologicalS4000Buffer
Carbonato de SódioSigma AldrichS7795-500GBuffer
Cloreto de Estrôncio Reticulador hexa-hidratadoSigma Aldrich255521para espátula de alginato
3dia
seringa de 5 mlTerumo140425RO diâmetro da seringa afeta a taxa de fluxo
75 cm2 Frasco de cultura de células Pescoço inclinadoCorning730720
Toluidina BlueSigma Aldrich52040Ensaio
tripsina 1xHycloneSH30042.01
Alginato de sódioNovamatrix (FMC Biopolymer, Princeton, NJ)Pronova UPMVGMaterial do núcleo de microesferas
placa PEC-BMP-2 Microscópio confocal Estéril; altamente corrosiva de heparinaCultura de células de

Referências

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  1. Yuan, W., et al. NELL-1 based demineralized bone graft promotes rat spine fusion as compared to commercially available BMP-2 product. Orthop Sci. 18, 646-657 (2013).
  2. Anderson, C. L., Whitaker, M. C. Heterotopic ossification associated with recombinant human bone morphogenetic protein-2 (infuse) in posterolateral lumbar spine fusion: a case report. Spine. 37, 502-506 (2012).
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