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Ensaio de Adesão Sob tensão de cisalhamento para o Estudo da Linfócitos T-Molécula de adesão de Interações

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DOI:

10.3791/54203

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29 de junho de 2016

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1Department of Medicine, New York University School of Medicine, 2Department of Pathology, New York University School of Medicine

Neste artigo

Resumo

Este ensaio de adesão fluxo fornece um modelo de impacto simples, alta de interações celulares de células-epitelial T. Uma bomba de seringa é utilizado para gerar a tensão de corte, e microscopia confocal captura imagens para efeitos de quantificação. O objectivo destes estudos é o de quantificar eficazmente a adesão de células T utilizando condições de fluxo.

Resumo

Em geral, a adesão de células T é um componente crítico da função, contribuir para os processos distintos de recrutamento celular para os locais de inflamação e a interacção com as células apresentadoras de antigénio (APC), na formação de sinapses imunológicas. Estes dois contextos de adesão celular T diferem em que T interações célula-APC pode ser considerado estático, enquanto interações dos vasos células T no sangue são desafiados pela tensão de cisalhamento gerada pela própria circulação. interacções célula T-APC são classificados como estático em que os dois parceiros celulares são estáticos em relação ao outro. Normalmente, esta interacção ocorre dentro dos nódulos linfáticos. Como uma célula T interage com a parede do vaso sanguíneo, as células de prender e devem resistir à tensão de cisalhamento gerada. 1,2 Estas diferenças evidenciam a necessidade de compreender melhor a aderência estática e a aderência em condições de escoamento como dois processos reguladores distintos. A regulação da adesão das células T pode ser sucintamente descrito como conpesca à linha do estado de afinidade de integrina moléculas expressas na superfície da célula, e regulando assim a interacção de integrinas com os ligandos da molécula de adesão expressas na superfície da célula que interage. A nossa compreensão atual da regulação dos estados afinidade para a integrina vem muitas vezes simplista em sistemas modelo in vitro. O ensaio de adesão usando condições de fluxo descritos aqui permite a visualização e a quantificação precisa de interacções celulares de células-T epitelial em tempo real, na sequência de um estímulo. Uma adesão sujeito ao ensaio de fluxo pode ser aplicado a estudos de adesão de sinalização nas células T, após o tratamento com substâncias inibidoras ou estimuladores. Além disso, este ensaio pode ser expandido para além de sinalização de células T para qualquer população de leucócitos adesivo e qualquer integrina-molécula de adesão par.

Introdução

T medeia a adesão de linfócitos de um número de processos diferentes, em um sistema imunitário saudável, 3 desempenhando papéis críticos no tráfico de células T e a apresentação do antigénio. Se durante a vigilância imunitária ou uma resposta imunitária activa estas duas grandes funções de adesão são críticos. 4 Os eventos de sinalização fisiológicos de interacções de células de células do endotélio T são distintos de células T-célula que apresenta antigénios (APC) interacções, e, portanto, requerem métodos distintos de estudo para melhor compreender as cascatas de sinalização envolvidos. A adesão firme de uma célula T a uma parede do vaso sanguíneo durante o extravasamento de linfócitos requer activação rápida e dinâmica integrina. A interacção estreita entre uma integrina e adesão activas moléculas de estado ao longo do endotélio leva a aderência resistente ao fluxo de sangue, permitindo que as células T para rastrear ao longo da superfície em busca de uma área permissiva para a passagem de células. 5 O rastreamento de um bi células T -directionally Alonda parede do vaso sanguíneo GA é dependentes de adesão polarizada, com uma extremidade dianteira adesiva distinta da célula T. 6 Mais importante ainda, a adesão e transmigração firme requerem resistência à força de corte gerada pela circulação de fluxo sanguíneo.

Ao projetar experimentos para estudar a adesão de linfócitos, deve ser dada atenção ao estímulo específico de interesse. Enquanto a activação de integrina é um componente comum e crítica de todas as formas de adesão das células T, as cascatas de activação são susceptíveis de ser único a jusante dos receptores individuais e co-receptores. Do mesmo modo, pares de integrina e molécula de adesão funcionam em microambientes especializados e em subpopulações específicas. Desta forma, estes pares podem ser regulados de forma bastante diferente. O modelo aqui apresentado é ideal para o estudo da cascata de sinalização que levam à integrina ativação ocorrendo em condições de tensão de cisalhamento. 7 Essas interações não podem ser adequadamente compreendidas em um ADHESI estáticano sistema devido ao impacto ter sido mostrado que estas forças têm directamente no comportamento das células T. 8 Embora apresentado aqui com as células T e as células CHO (Ovário de Hamster Chinês) manipuladas para expressar (células CHO-ICAM) humano ICAM-1, o sistema pode facilmente ser modificado para estudar diferentes populações de leucócitos ou moléculas de adesão.

Este ensaio proporciona um método para quantificar a aderência de células T e a activação da integrina utilizando tensão de corte, fornecendo um modelo para a fase de adesão firme dos leucócitos extravasamento. Através da utilização de células CHO-ICAM a afinidade de LFA-1 para o seu ligando em células vivas pode ser examinada em tempo real, em resposta a vários estímulos de interesse. Esta técnica requer facilmente obtida, câmaras de micro-fluxo disponíveis comercialmente em combinação com uma bomba de seringa, o que simplifica grandemente o equipamento necessário para modelar o fluxo sanguíneo e tensão de cisalhamento, em comparação com outros modelos. 9 Uma outra vantagem principal deste ensaio é que a sinalização específicacascatas e do estado de activação das integrinas resultante individuais podem ser estudados de forma limpa através da utilização de células CHO modificadas que expressam moléculas de adesão humanos de interesse. Além disso, a combinação dos dados quantitativos com imagem de células vivas é uma vantagem significativa do presente método. Em geral, embora um certo número de ensaios de adesão de células T estática ter sido descrito que bem modelar as interacções célula T-APC, estes modelos são insuficientes na captura do processo dinâmico de adesão celular epitelial-T. Por este motivo, quando a escolha de um ensaio de adesão do estímulo em questão deve ser considerado.

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Protocolo

1. plaqueamento das células CHO-ICAM

Nota: O objectivo deste passo é a chapear as células CHO-ICAM nas câmaras de fluxo para o crescimento durante a noite com o objectivo de gerar uma monocamada confluente.

  1. Manter as células CHO-ICAM em 10 cm de cultura de tecidos tratados pratos de cultura de 10 ml de meio RPMI suplementado com 10% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina / estreptomicina (CHO-ICAM meio de cultura completo) a 37 ° C com 5% CO 2.
  2. Para recolher as células, adicionar 1 ml de 0,5% de tripsina-EDTA e incubar à temperatura ambiente durante 1 min com agitação suave. Neutraliza-se a tripsina com 4 ml de meio.
  3. Contar as células CHO-ICAM usando um hemocitômetro e calcular 0,75 x 10 5 células por câmara. Nota: Neste experimento: 2,25 x 10 5 células serão necessários para semear 3 câmaras.
  4. Centrifugar 0,75 x 10 5 células CHO-ICAM por câmara durante 5 minutos a 500 xg, à temperatura ambiente e ressuspender o sedimento celular em 30 ul por câmara de CHO-ICAM Meios de cultura completos.
    Nota: Neste experimento serão necessários 90 l para semear 3 câmaras.
  5. Lentamente adicionar as células para um reservatório da câmara de fluxo. Permitir que as células que se contentar com 5 min na incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.
  6. Adicionar 200 ul de meios de cultura completos entre os dois reservatórios de cada câmara. adições alternar entre os dois para evitar o movimento das células como o sistema equilibra.
  7. Incubar as células durante a noite dentro de uma incubadora a 37 ° C com 5% de CO 2.

2. Preparação das células T

Nota: Este ensaio pode ser feito com células T humanas primárias ou de uma linha de células T. Um protocolo de isolamento de células T do sangue foi descrita anteriormente. Se 10 utilizando células T humanas primárias utilização de células isoladas de fresco para obter os melhores resultados. Se utilizar uma linha de células T, seguir o protocolo de cultura especificado pela fonte de células. A fim de detectar as células em uma microsco fluorescentepe as células T são marcadas com éster de succinimidilo de fluoresceína carboxi (CFSE).

  1. Contar as células T utilizando um hemacitómetro e calcular 2 X 10 6 células por câmara. Nota: Neste experimento, serão necessários 6 x 10 6 células por 3 câmaras.
  2. Centrífuga 2 x 10 6 células T por câmara, durante 5 minutos a 500 xg, à temperatura ambiente e ressuspender as células em 1 ml de fosfato salino tamponado (PBS) contendo 1% de glucose ou 2% de FBS.
  3. Adicionar CFSE a 1: 1000 de diluição (estoque feito para 5 mM). Cubra da luz e incubar durante 8 min a RT
  4. Girar a 500 xg durante 5 min, temperatura ambiente.
  5. pellet celular Ressuspender com 240 ul por condição (ver secção 4 "Nota") de soro falta mídia RPMI. Nesta experiência, ressuspender o sedimento celular em 720 ul de meio RPMI simples. Dividir as células vazias em tubos de 1,5 ml rotulados para cada câmara, 240 ul por tubo. Manter as células em um bloco de calor C 37 ° até utilização.

3. Criação de the Input / Output Hosing e bomba de seringa

  1. Aquece-se a câmara de imagem ao vivo microscópio para 37 ° C.
  2. Preparar a mangueira de entrada:
    1. Encha uma garrafa de vidro de 500 ml com água e fazer 2 furos na tampa. Rotular os buracos "in" e "out". Isto irá actuar como um banho de água de aquecimento para os meios de entrada.
    2. Executar a mangueira de entrada através dos orifícios na tampa e para dentro do banho de água. Certifique-se de que o lado da mangueira que liga à seringa vem através da "em" buraco eo lado que vai ligar para o reservatório de entrada vem através do "fora" buraco.
    3. Lave a mangueira de entrada com 60 ml de água para remover o ar do sistema.
    4. Primeiro a entrada de mangueira com meio RPMI sem soro aquecido a 37 ° C. Encha uma seringa de 60 ml e empurre através da mídia até que a mangueira é completamente preparado e falta quaisquer bolhas de ar.
      Nota: Dependendo do length de tubo utilizado o volume necessário para preparar irão variar.
      1. Calcular o volume dos meios de comunicação necessários para a experiência multiplicando a taxa de fluxo (aqui 0,3 ml / min) ao número de minutos (5 min), com o número de câmaras na experiência (aqui três); neste experimento, use 4,5 ml de mídia. Nota: Recomendamos que tem 5 ml volume extra (neste caso, totalizando 9,5 ml) que permanece na seringa após priming.
    5. Coloque toda a configuração de entrada para o recinto de imagens ao vivo do microscópio para manter 37 ° C. Execute o mangueiras e seringa para fora do gabinete e carregar a seringa na bomba de seringa.
  3. Preparar a mangueira de saída:
    1. Fazer um furo na tampa de um frasco de 250 ml para usar como resíduos de saída.
    2. Executar o tubo de saída através do orifício e para dentro da garrafa. Vagamente fixar a tampa, não fechar todo o caminho.
    3. Coloque a configuração de saída para dentro do gabinete imagens ao vivo da microscope.
  4. Calcula-se a taxa de fluxo (mL / min) necessária para gerar a tensão de cisalhamento desejada (dyn / cm 2). A tensão de cisalhamento varia em diferentes compartimentos vasculares, portanto, ter em conta o modelo global, incluindo tipos de células a serem estudados e tratamentos Ao decidir sobre um nível de tensão de cisalhamento.
    Nota: Estas experiências são realizadas em 0,4 dyn / cm 2 para perto imitar um cenário veia pequena.
    1. Tome as dimensões da câmara em conta no cálculo tensão de cisalhamento. Use a seguinte fórmula (fornecido pelo fabricante 11) para as câmaras de fluxo usados ​​aqui (Ver Tabela de Materiais): T = η * 176,1 * o onde o stress T = cisalhamento, η = viscosidade dinâmica, o = taxa de fluxo. Nota: A viscosidade dinâmica do meio RPMI a 37 ° C é 0,007.

4. Carregando do Fluxo de Chambers e estimulação das células

Nota: Para iniciar a adesão,As células T deve ser estimulada. Na experiência seguinte as células ou permanecerá não estimuladas ou estimuladas com a SDF-1α 12 ou acetato de miristato de forbol (PMA; controlo positivo) 13. Para apresentação adequada de quimiocina para células T, as células CHO-ICAM são pré-incubados com SDF-1α (seguido por lavagens em série), permitindo a apresentação na superfície celular. PMA é um éster de forbol que é estruturalmente semelhante ao do segundo mensageiro glicerol diacil (DAG); aqui é usado como um controlo positivo. As células T são tratados directamente com PMA antes de carregar para dentro da câmara de fluxo.

  1. Colocar a lâmina câmara de fluxo no microscópio e definir o plano focal sobre a monocamada de células CHO-ICAM usando a objectiva de 20x.
  2. Manter as células T CFSE manchada por todas as outras condições no bloco de calor C 37 °. Preparar as células CHO-ICAM ou T como se segue imediatamente anterior ao ensaio para esta condição:
    1. Para a condição de não estimulada (câmara 1), mantenha um ch / tubo de fluxoâmbar não tratado, para servir como controlo negativo para a estimulação.
    2. Para a estimulação de PMA (câmara 2), estimular um tubo de células T com PMA (10 ng / ml) para servir como controlo positivo; tratar imediatamente antes do carregamento na câmara de fluxo.
    3. Para a estimulação SDF-1α, (a câmara 3), estimular a câmara de fluxo terceiro com SDF-1α (100 ng / ml), removendo 70 ul de cada vez 3 vezes a partir do reservatório superior (reservatório de saída) e, em seguida, adicionar 70 ul de SDF -1α (100 ng / ml) para dentro do reservatório inferior de (reservatório de entrada). Incubar durante 5 min.
  3. Remover e descartar 70 ul de cada vez 3 vezes a partir do reservatório de uma câmara de saída.
  4. Adicionar 70 ul de suspensão de células pré-tratadas (conforme o caso) T para dentro do reservatório de entrada 3 vezes. Esperar 5 min para permitir que as células se mover a partir da entrada da câmara ( "In"), e para alcançar a saída proximal ( "out") da câmara.
  5. Durante esse tempo, a imagem 5campos para células T CFSE manchada. Escolha campos que estão dispersas por todo o centro da câmara (Figura 1). Use as seguintes condições de excitação / emissão: excitação laser de comprimento de onda: 488 nm; emissão de filtro de recolha: 500 - 540 nm. Estas imagens servirá como as contagens de células pré-fluxo.
  6. Conecte a tubulação de entrada e saída simultaneamente para os reservatórios de câmara de fluxo.
    Nota: Colocar o tubo em simultâneo é essencial de modo a não introduzir bolhas de ar para dentro da câmara de equilíbrio e manutenção geral no interior da câmara.
  7. Inicie o fluxo a 0,3 ml / min (0,4 dines / cm2), visualizando as células T-coradas com CFSE. Como o fluxo começa, especialmente com a primeira câmara, existe muitas vezes um atraso entre o início do fluxo e observação de rolamento de células T, por conseguinte, começar a cronometragem 5 min, no início do movimento de células T.
  8. Terminar fluxo após 5 min, e de imagem 5 campos no canal CFSE. Escolha campos dispersos aleatoriamente throughout o centro da câmara de fluxo (Figura 1). Estas imagens servirá como as contagens de células pós-fluxo.

5. determinação da percentagem de células aderentes

Nota: a determinação do número de células nas imagens adquiridas é feito objectivamente com software automatizado. Para os nossos estudos, utilizamos o Volocity software (versão 6.2.1), mas outros softwares como o ImageJ (versão 1.48V) também são aplicáveis.

  1. Determinar o número de células por campo pré-fluxo para cada condição. A média dos 5 domínios é a "contagem média de células pré-fluxo." 7
  2. Determinar o número de células por campo de pós-fluxo para cada condição. A média dos 5 campos é a "contagem de células média de pós-fluxo." 7
  3. Calcula-se a percentagem de células aderentes utilizando a seguinte fórmula: Percentagem de células aderentes = (contagem média de células pós-fluxo) (contagem de células pré-fluxo médio) / x 100%.

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Resultados

Os resultados representativos são apresentados a partir do ensaio de adesão de Jurkat e de fluxo utilizando células T CD3 + humanos primária, tal como indicado, estimuladas com SDF-1α. Os controlos negativos em todas as experiências mostradas são células não estimuladas. Um limiar basal percentagem de adesão das células não estimuladas é entre 5 - 10%; adesão de base notadamente acima dessa faixa indica uma experiência problemática e sugere a população início de células T fora...

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Discussão

A fim de analisar adequadamente a adesão de células T, o estimulante seja incluída no estudo deve ser considerado na escolha de um método in vitro. Embora existam vários ensaios para estudar os sinais que conduzem a LFA-1 e ICAM-activação uma ligação todos os métodos não são intercambiáveis. Um ensaio de adesão estático 10 é o mais adequado para estudar as interações de células T-APC; Alternativamente, o método de tensão de corte detalhado aqui é ideal para modelar as interacções das células de célul...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

A Rheumatology Research Foundation e o Hirschil Trust apoiaram este trabalho.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Amostras de células T (linha celular ou primária)ATCCTIB-152Células T humanas periféricas
Células CHO-ICAM-1ATCCCRL-2093
µ-Slide VI 0.4 ibiTreatibidi80606
Frasco de vidro de 500 mlFisherFB800500
Frasco de vidro de 250 mlFisherFB800250
Silicone tubulação 0,8 mmibidi10841
Microscópio confocal com câmara de incubadoraZiess700Qualquer microscópio fluorescente de campo amplo
Bomba de seringaNew Era Pump SystemsNE-300
Seringa de 60 mlBD309653
CFSEeBioscience65-0850
SDF-1αR& D350-NS-010/CF
RPMILonza12-702F/12
PBS Microcentrífuga Lonza17-516F
Eppendorf 5424
D-GlucoseSigma AldrichG8270 
PMASigma Aldrich16561-29-8
Software VolocityPerkin ElmerVersão 6.2.1
Software ImageJNIHVersão 1.48V
Placas de cultura tratadas com cultura de tecidosFalcon353003
Tripsina-EDTA (0,25%) Vermelho de fenolGibco25200114
FBS inativado por calorDenvilleFB5001-H
Penicilina / EstreptomicinaFisherBP295950

Referências

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