Artigo de método

A purificação de todo o genoma de DNA circular Extracromossômica de células eucarióticas

28.7K vistas

⸱

DOI:

10.3791/54239

⸱

4 de abril de 2016

 ,  ,  ,  ,  , 
1Department of Biology, University of Copenhagen, 2National Veterinary Institute, Technical University of Denmark, 3Group Health Research Institute, 4Lewis-Sigler Institute for Integrative Genomics, Princeton University, 5Calico Life Sciences LLC

Neste artigo

Resumo

Este artigo apresenta um método sensível chamado Circle-Seq para purificar o DNA circular extracromossômico (eccDNA). O método abrange purificação de coluna, remoção de DNA cromossômico linear restante, amplificação de círculo rolante e sequenciamento de alto rendimento. O Circle-Seq é aplicável à triagem em escala genômica de eccDNA eucariótico e ao estudo da instabilidade do genoma e da variação do número de cópias.

Resumo

DNAs circulares extracromossômicos (eccDNAs) são elementos genéticos comuns em Saccharomyces cerevisiae e são relatados em outros eucariotas também. EccDNAs contribuir para a variação genética entre células somáticas em organismos multicelulares e evolução das eucariotas unicelulares. métodos sensíveis para detectar eccDNA são necessários para esclarecer como esses elementos afetam a estabilidade do genoma e como fatores ambientais e biológicos induzir a sua formação em células eucarióticas. Este vídeo apresenta um método eccDNA-purificação sensível, chamado Circle-Seq. O método envolve a purificação de DNA circular, a remoção do restante DNA linear cromossômica, amplificação rolling-círculo de eccDNA, sequenciamento de profundidade, e mapeamento de coluna. tratamento exonuclease extensa foi necessária para a degradação do DNA cromossômico linear suficiente. O passo de amplificação rolling-círculoine-height:. normal; "> φ 29 polimerase enriquecido para DNA circular sobre o DNA linear de validação do método Circle-Seq em três populações de S. cerevisiae CEN.PK de 10 a 10 células detectadas centenas de perfis eccDNA em tamanhos maiores do que 1 quilobases . resultados repetidos de ASP3-1, COS111, CUP1, RSC30, HXT6, HXT7 genes no DNA circular em ambos S288c e CEN.PK sugere que circularização DNA é conservado entre as estirpes nestes loci. em suma, o método Circle-Seq tem ampla aplicabilidade para rastreio de escala genoma para eccDNA em eucariotas, bem como para a detecção de tipos específicos eccDNA.

Introdução

Detecção de amplificação cromossómico cedo ou transiente é difícil porque requer a identificação de alterações nas moléculas de ADN em grandes populações de células. Cromossómicas variações no número de cópias (CNVs) são geralmente bem detectado após o seu estabelecimento, deixando apenas a estrutura final CNV como prova de que o mecanismo de variação gerado a 1,2. Detecção e recuperação DNA extrachromosomal circular (eccDNA) nos estágios iniciais de formação de CNV poderia elucidar os processos em curso no rearranjos genômicos.

Anteriormente, de novo descoberta de eccDNA foi de micrografias eletrônicas 3, Giemsa de cromossomos em metáfase 4 ou eletroforese bidimensional 5. Estes métodos oferecem pouca ou nenhuma informação sobre a sequência do DNA circular. Técnicas visados ​​como o Southern blotting 6,7, inverse PCR 8, ou de fluorescência em hybridizatio situn 9 fornecer provas apenas cerca elementos eccDNA específicos. Nenhum destes métodos proporcionam a sequência de todos os tipos eccDNA existentes numa população de células.

Divergência genómico em uma associação de células pode ser caracterizado por sequenciação do genoma e / ou matrizes ladrilhos 10,11. Detecção de uma deleção ou amplificação por métodos de purificação de ADN convencionais geralmente requer que um alelo mutado representam, pelo menos, 0,1-1% da população de células 12,13. Acentric eccDNAs se espera que sejam ainda mais transiente em uma cultura de células, devido à sua falta de centrómeros e potencial ausência da síntese de ADN em replicação. Assim, desde que a maioria eccDNAs presumivelmente estão em quantidades baixas e as suas sequências de se parecer com o genoma, métodos de extracção de ADN alternativos são necessários para detectar eccDNAs.

Várias técnicas de purificação de ADN circular explorar as diferenças estruturais entre os cromossomas e ADN circular. Por exemplo, ultracentrifug de alta velocidadeção em gradientes de césio-cloreto é usado para isolar 350-3000 pares de bases (pb) a partir de grandes eccDNAs a linha celular de cancro humano HeLa 14. No entanto, a alta velocidade pode quebrar ou entalhe da espinha dorsal das estruturas circulares de DNA super-enrolados, alterando a velocidade de sedimentação 15 e no rendimento eccDNA. Dutta e colaboradores desenvolveram um método para de novo, a identificação escala genoma de ADN circular a partir de tecidos de ratinho, bem como a partir de culturas de células humanas e de galinha 16,17. Seu método é a extração de núcleos de tecido homogeneizado por ultracentrifugação sacarose seguida de purificação de plasmídeos e várias rodadas de reações enzimáticas e extrações de DNA. Seu protocolo identifica principalmente 200-400 eccDNAs pb, chamados microDNAs. Dutta e colegas de trabalho também tentou a purificação de microDNAs de Saccharomyces cerevisiae, mas não foram capazes de gravar microDNA desta espécie de levedura 16.

Desenvolvemos um novo método para adetecção de novo de eccDNA de fungo chamado Círculo-Seq. Este método permite pesquisas escala genoma para moléculas circulares de DNA, grandes o suficiente para transportar genes inteiros e tão grande como o DNA 86 quilobases (kb) mitocondrial (mtDNA). O método de círculo-Seq foi desenvolvido a partir de um método de purificação de plasmídeo procarióticos bem estabelecida 18,19, optimizado para as células de levedura e eucariotas combinado com sequenciação profunda. Utilizando a abordagem Círculo-Seq, 1756 eccDNAs diferentes, todo maior do que 1 kb, foram detectados a partir de dez S. cerevisiae S288c populações 20. Um tamanho de corte foi escolhido para se concentrar em eccDNA que eram grandes o suficiente para transportar genes inteiros. Circle-Seq foi altamente sensível; ele detectou um único eccDNA dentro de milhares de células 20. No estudo atual, Circle-Seq foi usado para isolar e identificar 294 eccDNAs de três repetições biológicas de outro S. cerevisiae cepa de levedura, CEN.PK. Os dados revelam que eccDNA é um eleme genética comumnt em S. cerevisiae.

Protocolo

NOTA: Uma visão geral da purificação DNA circular e método de sequenciação (Circle-Seq) é ilustrada na Figura 1.

1. A cultura, celular e de colheita de plasma de membrana Perturbação

  1. Inoculação das células de levedura (por exemplo Saccharomyces cerevisiae) a partir de uma cultura D / N em 50 ml de meio nutriente completa de dextrose peptona de levedura (YPD). Inocular a uma densidade celular inicial baixo de 1-3 x 10 5 células / ml ou uma densidade óptica de aproximadamente 0,01 OD 600.
    1. Incubar as células a 30 ° C com agitação a 150 voltas por minuto (rpm) até que as células atingir a densidade máxima de células de cerca de 1 x 10 10 células, aproximadamente após 24 a 48 horas ou uma densidade óptica a 600 OD> 10.0.
      NOTA: O tempo de cultura não é crucial como concentrações mais baixas de células pode ser utilizado.
  2. Transferir a cultura superada para um tubo cónico de 50 ml, sedimentar as células por centrifugação a800 xg durante 3 minutos e descartar o sobrenadante.
  3. Lavar o sedimento com 25 ml de solução tampão de Tris-Cl 10 mM, EDTA 1 mM, pH 8,0, re-sedimentar as células por centrifugação a 800 xg durante 3 minutos e descartar o sobrenadante.
  4. Ressuspender o sedimento de células em 1,2 ml de tampão de ressuspensão fornecido a partir de um kit de plasmídeo coluna de purificação.
  5. Etapa opcional: Adicionar plasmídeos altamente diluídas como controles para a purificação de elementos circulares de DNA, 20.
    NOTA: No conjunto de dados atual, uma mistura do plasmídeo 7.7 l foi aplicado para cada amostra contendo 10 a 10 células. A mistura da plasmídeo consistiu de três plasmídeos em diferentes concentrações; pBR322, a 38 ng / amostra, pUC19 a 0,5 ng / amostra, e pUG72 a 0,01 ng / amostra.
  6. Transferir a suspensão celular em dois tubos de 2 ml de micro-centrífuga, cada um complementado com contas de vidro de 0,5 mm a uma razão de 1: 3 do volume total de suspensão.
  7. Vortex cada tubo à velocidade máxima por 10 min para perturbar células plasmáticasmembranas. Sedimentar as pérolas por centrifugação a 268 xg durante 30 seg e transferir os 1,2 ml de sobrenadante combinado a partir dos dois tubos de microcentrífuga para um novo tubo.
    NOTA: Alternativa para o passo 1,6-1,7, usar zimoliase para romper as células em solução tampão 0,6 ml de ressuspensão. Dez unidades de zimoliase pode perturbar 5 x 10 7 células dentro de 1,5 h a 35 ° C.

2. EccDNA Enriquecimento por cromatografia em coluna

  1. Seguir o protocolo de um kit de purificação de plasmídeos coluna. Em resumo, o tratamento de cada amostra com uma solução de 1,2 ml alcalina, misture delicadamente e incubar 3 min a RT.
  2. Adicionar 1,2 ml de tampão de neutralização, misturar suavemente e centrifugar a 9650 xg durante 5 min.
  3. Carregar a solução numa coluna equilibrada com solução 1 ml de equilíbrio e permitir que o líquido a fluir através da coluna por gravidade.
  4. Lava-se a coluna com uma solução de lavagem de 4 ml. Quando a solução foi passada através da resina, adicionar cuidadosamente 0,3 ml de eluição assimlução para substituir a maior parte do volume de vazio de 0,35 ml de coluna.
  5. Elui-se o ADN para um novo tubo de recolha com uma solução de 1 ml de eluição e precipitar o ADN pela adição de 0,8 ml de mistura de precipitação. Centrifuga-se a 9650 xg durante 10 min.
  6. Lava-se a pelete de ADN com 0,5 ml de etanol a 70%, centrifugar a 9650 xg durante 5 min, de ar seco durante 5 a 15 minutos e dissolve-se o ADN purificado em 25 uL de água estéril.
    NOTA: Apenas armazenamento a curto prazo de DNA em água é recomendado. Preferencialmente, seguir diretamente para a etapa 3.

3. A digestão do ADN cromossómico restante linear

  1. Passo opcional: Para facilitar a digestão específica de ADN linear pela exonuclease, tratar o ADN purificado com uma endonuclease rara de corte, tais como Notl. Para 5 ug de ADN, usar uma unidade de Notl, 5 ul de tampão de digestão de 10x e água estéril para um volume total de 50 ul. Incubar a reacção a 37 ° C durante 16 h e inactivar pelo calor a endonuclease a 80 ° C durante 5 min.
  2. Adicionar 20unidades de exonuclease (2 ul), 4 ul de ATP (25 mM), 34 ul de água estéril e 10 ul de 10x tampão de reacção directa com o ADN clivado-endonuclease de 50 ul para chegar a um volume de reacção de 1x de 100 ul, usando a exonuclease dependente de ATP kit.
  3. Realizar hidrólise de ADN de cadeia simples e de cadeia dupla linear, a 37 ° C durante 5 dias ou mais. Adicionar um ATP adicional de 4 mL (25 mM), 0,6 ul de 10x tampão de reacção e 20 unidades de exonuclease cada 24 horas para prosseguir a digestão enzimática do ADN a um volume de reacção 1x.
  4. Após a remoção do DNA linear, amostra de 2 ul da solução tratada com exonuclease para confirmar a eliminação do ADN cromossómico linear por reacção em cadeia da polimerase quantitativa (qPCR), usando um marcador cromossómico, tais como o gene da actina ACT1 20.
    1. Cada 20 ul qPCR volume reaccional contém 2 mL de amostra tratados com exonuclease, a 150 nm, os iniciadores 5'-ACT1 TCCGTCTGGATTGGTGGTTCTA-3 'e 5'-TGGACCACTTTCGTCGTATTC-3 ', 2% (volume / volume) de dimetil sulfóxido, e fluorescente mistura principal 10 ul verde.
    2. Utilizar a condição de reacção; 3 min a 95 ° C, seguido de 45 ciclos de 15 seg a 95 ° C e 30 segundos a 60 ° C.
      NOTA: ACT1 é um marcador particularmente adequado para DNA linear desde variações no número de cópias deste gene são deletérios 21-23 tão eccDNA não deve levar ACT1.
    3. Alternativas a análise da digestão de DNA por qPCR são PCR padrão (4.3) ou coloração com iodeto de propídio (4.4).
      1. Use 2 jil de amostra tratada com exonuclease como molde de PCR com os iniciadores 5'-ACT1 TGGATTCTGGTATGTTCTAGC-3 'e 5'-GAACGACGTGAGTAACACC-3'. Como controlo positivo ACT1, usar 50-100 ng S. genómico ADN cerevisiae como molde. condições de reacção de PCR; 3 min a 95 ° C, seguido de 35 ciclos de 30 seg a 95 ° C, 30 seg a 56 ° C e 1 min a 72 ° C.
      2. Executar reacções de PCR por gel electrophoreSIS em 1% de agarose com 0,5 ug / ml de brometo de etídio. Olhe para uma banda ACT1 0,8 kb.
    4. A ausência ou a presença de DNA linear também pode ser examinado por coloração com iodeto de propidio antes e depois de amplificação de DNA.
      1. Misturar cada amostra de ADN numa mistura 1: 1 de volume com uma mistura 1: H 2 O 1,000 solução diluída de estoque 20 mM de iodeto de propídio. Deixar solução no escuro durante 10-20 min à temperatura ambiente e analisar a coloração de ADN por microscopia de fluorescência de uma ampliação de 100X, utilizando um filtro de excitação de fluorescência vermelha em 663-738 nm e um tempo de exposição de 5 a 30 seg. Como controlo ADN-coloração, uso O29-ADN genómico amplificado a partir de levedura e / ou plasmídeo amplificado-O29.
  5. Inactivar pelo calor a solução da exonuclease a 70 ° C durante 30 min.

4. DNA Amplification

  1. Amplificar o purificado e enriquecido eccDNA a partir do passo 3.5) com DNA polimerase de O29 24-26 acordoção com o protocolo do fabricante polimerase.
    1. Em resumo, misture 5 ul enriquecidos eccDNA com tampão de desnaturação 5 mL.
    2. Depois de 3 minutos à temperatura ambiente, adicionar 10 ul de tampão de neutralização. Misturar suavemente e adicionar 30 ul de mistura mestre contendo tampão de reacção de 29 ul e 1 ul de polimerase de ADN O29. Incubar a reacção a 30 ° C durante 16 horas ou mais (até 72 h). Calor inactivar a polimerase de ADN de O29 a 65 ° C durante 3 min.

5. Seqüenciamento e Análise de Dados

  1. Tosquiarás o eccDNA amplificado com um ultrasonicator focada para um tamanho médio de pico alvo de 300 pb. Utilize as seguintes definições para uma amostra de DNA ul 130: poder 450W pico de intensidade, 60 seg tratamento, factor de utilização de 30%, a 200 ciclos por explosão, temperatura de 7 ° C.
  2. Adicione etiquetas de índice de código de barras e adaptadores para o fragmentado lê para a síntese de bibliotecas para sequenciação, utilizando um método adequado para a preparação da biblioteca.
  3. São profundas sequenciação, por exemplo, como 141-single nucleotide-fim lê numa plataforma de sequenciação de alto rendimento.
  4. Mapa lê o genoma de referência de levedura sob investigação e permitir que lê para mapear para várias regiões. Por exemplo, usar um sistema de fluxo de trabalho disponíveis gratuitamente 27,28 e curto leitura software de mapeamento alinhador 29.
  5. Identificar lê a partir de regiões de putativas eccDNAs contígua utilizando leituras, por exemplo, mais do que sete contígua lê (> 1 kb), sem lacunas 20.
    NOTA: O software está disponível 27,28 para explorar mapeados lê em regiões genômicas de interesse.

Resultados

Para validar o método Circle-Seq, três S. populações cerevisiae CEN.PK de 1 x 10 10 células foram testadas depois as células foram cultivadas separadamente em meio YPD durante dez gerações. Eliminação cromossómica de ADN linear foi confirmada pela ausência de um sinal de qPCR ACT1 como descrito anteriormente 20 (dados não mostrados). eccDNA purificado e enriquecido foi sequenciado até 68 milhões lê (141 single-nucleotide-end lê) e mapeado para o genoma de referência CEN.PK113-7D (versão 19 de junho de 2012). As gravações de eccDNAs putativos das três amostras chamados C1, C2 e C4 foram atribuídos a regiões genómicas mapeados por contígua lê mais do que 1 kb. Com base em 10.000 simulações de Monte Carlo, o significado de cada região contígua lê mapeado por mais do que uma kb foi estimada. A partir deste regiões 79, 159 e 56 foram anotados como sequências eccDNA prováveis ​​(p <0,1, Dataset 1). O número de contiguo gravadanos lê> 1 kb aumentou em função da profundidade de sequência, sugerindo que, mesmo mais elementos eccDNA teria sido registada se as amostras tinham sido sequenciados mais (Figura 2). Como esperado, o método de círculo-Seq extraída numerosos lê a partir de um número de elementos conhecidos circulares de DNA incluindo o plasmídeo 2μ, DNA mitocondrial, genes de ARN ribossomal no cromossoma XII, e os três plasmídeos de controlo interno pBR322, pUC19 e pUG72 que foram misturados em amostras apenas antes da purificação em coluna (Figura 3).

O vídeo mostra um exemplo de contígua lê que mapeada para o locus de HXT7 _ARS432_ HXT6 no cromossoma IV. Anteriormente, o [HXT6 / 7 círculo] foi detectada por Círculo-Seq em dez populações S288C (cada um com 1 x 10 10 células) e a estrutura de ADN circular foi confirmada por análise de PCR inverso 20. A ci [HXT6 / 7rcle] também foi registada em cada uma das três populações CEN.PK (Figura 4A). Além disso, a maioria dos genes comuns eccDNA entre as amostras replicadas de CEN.PK sobreposto eccDNA genes a partir de conjuntos de dados S288C (Figura 4B).

Para testar a especificidade do protocolo Círculo-Seq para a purificação de ADN circular, de duas amostras, cada uma com o ADN genómico de 30 ug, foram testados. Uma amostra foi suplementado com 100 ng de DNA plasmídeo e eccDNA de ambas as amostras foram purificadas pelo protocolo Círculo-Seq. Após separação em coluna, o rendimento de ADN foi de 1,27% (380 ng) para a amostra sem plasmídeo (GD) e 1,60% (480 ng) para a amostra com o plasmídeo (GD + P). A eficiência do tratamento de exonuclease foi testado para o teor de ADN linear após 29 h e 72 h utilizando PCR contra ACT1. Sem amostras continham amplificado ACT1 (dados não mostrados). Uma fracção de cada amostra tratada com exonuclease foi ainda umamplified pelo O29 polimerase e os produtos de reacções enzimáticas foram analisadas por coloração com iodeto de propídio (Figura 5A-F) e electroforese em gel de agarose (Figura 5G). As amostras após o tratamento de exonuclease mostrou mínima de propídio iodo-mancha (Figura 5A-B). O O29 - amostra amplificada com apenas ADN genómico revelou estruturas fio (Figura 5C) semelhantes à amostra controle (Figura 5E). O O29 - amostra amplificada que tinha plasmídeo acrescentou revelou focos (Figura 5D) assemelham-se o controle de plasmídeo (Figura 5F). As imagens indicou que O29 polimerase de ADN enriquecido para circular sobre o ADN linear. A maioria do ADN cromossómico linear foi removido a partir de amostras após o tratamento 29 horas exonuclease (Figura 5A-B, G). No entanto, a extensa tratamento exonuclease por mais de 100 horas e usando mais de 100 unidades foi necessária para remover todo o ADN cromossómico linear, como O29 - amostras amplificadas ainda mostrou um fundo de estruturas em forma de fio após 72 horas de tratamento com exonuclease (Figura 5C-D).

figure-results-1
. Figura 1. Esquema do método de círculo-Seq O protocolo possui 5 etapas: 1) cultura das células, 2) purificação e do enriquecimento de eccDNA por cromatografia em coluna, 3) digestão de ADN cromossómico restante linear da fracção de eluato, 4) de amplificação ADN por O29 a polimerase de ADN, e 5) a sequenciação de eccDNA altamente enriquecido e mapeamento das leituras para a S. genoma de referência cerevisiae. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

p_upload / 54239 / 54239fig2.jpg "/>
Figura 2. Adjacente lê> 1 kb como função da profundidade sequência. EccDNA a partir de 1 x 10 10 células aumentam em função da profundidade de sequência (em milhões de mapeado lê). Mostrado: triplicados biológicos de haplóides CEN.PK S. cerevisiae populações (C1, C2, C4) separados por 10 a 10 divisões celulares. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-2
Figura 3. Detecção de elementos de DNA circular conhecidos. (AB) Espalhe parcelas de cobertura de leitura (ler densidade) em por cento para plasmídeos em CEN.PK biológica replica C1, C2 e C4. (A) lê mapeada para os plasmídeos de levedura endógenos foram: 2μ; [Círculo rDNA] (genes de ARN ribossómico de cromossoma XII); e mtDNA (o ADN mitocondrial). (B) original lê mapeado para controlar plasmídeos. plasmídeos de controlo foram doseadas em amostras antes da purificação em coluna. rácios de plasmídeo por célula foram: pBR322 (mais sinais) 1: 1, pUC19 (círculos) 1:50, e pUG72 (triângulos) 1: 2500.

figure-results-3
Figura 4. Elementos eccDNA comum em CEN.PK e S288c. (A) diagrama de Venn exibindo sobreposição entre os 476 genes em 294 eccDNA elementos nas três amostras CEN.PK (C1, C2, C4). Os 16 sobrepostas genes eccDNA / plasmídeos comuns são anotados (todos os nomes de genes estão em Dataset 1). (B) diagrama de Venn de todos os genes registados em eccDNAs putativos das três amostras CEN.PK (C1, C2, C4), em comparação com todos os genes registados em eccDNAs putativas a partir de 10 amostras de S288C: S1-S2, R1-R4, Z1-Z4 (ver referência 20). São mostrados 13 repetições biológicas (S1-S2, R1-R4, Z1-Z4, C1-C3) com genes / plasmídeos e regiões eccDNA putativos que se sobrepunham um mínimo de 2 estirpe origens e 3 ou mais experimentais configurações. As amostras C, CEN.PK; amostras R e Z, S288c BY4741; Amostras S, S288c M3750. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

figure-results-4
Figura 5. A visualização das amostras de ADN depois de exonuclease e O 2 9 de tratamento. (AF) de iodeto de propídio a coloração do ADN. Barra de escala, 10 | im. (A, C e E) com amostras de ADN genómico (GD); (B e D) GD amostras com mais de plasmídeo (GD + P). ( ong> AB) Após o tratamento exonuclease 29 hr (EXO 29 h); (CD) após o tratamento com exonuclease 72 h seguido por O29 a amplificação com polimerase (exo 72 H +) O29. (E) o controle DNA genômico depois e: a amplificação da polimerase O29; (F) Controlo de plasmídeo (5,5 kb) depois amplificação 29 polimerase; (Ø G) agarose gel-eletroforese. A partir da esquerda: L, 1 marcadores kb; P, o controlo de plasmídeo (5,5 kb) depois EXO 29 h; GD, após EXO 29 h (amostra, tal como em A); GD + P, depois de EXO 29 hr (amostra como B); GD e GD + P, depois de EXO 29 hr + O29; GD e GD + P, depois de EXO 72 hr + O29 (amostra como no CD). Veja a Tabela S1 para fornecer mais detalhes. Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.

Aset 1 "src =" / files / ftp_upload / 54239 / 54239dataset1.jpg "/>
Conjunto de Dados 1. regiões DNA circularização potenciais em CEN.PK. Por favor clique aqui para baixar esse arquivo.
São mostrados os dados de sequências e análises para 348 regiões. As colunas são AD, mapeamento eccDNA. A (primeira coluna a partir da esquerda), a amostra a partir do qual foi identificado eccDNA putativo; B, cromossoma; CD, início e fim coordenadas eccDNAs putativos. EH, o conteúdo eccDNA. E, sequência de replicação autónoma (ARS) na região; F, gene completo da região; L, parte do gene incluído na região; H, BLASTN do gene identificado. IO, a cobertura EccDNA e valores de p. I, região mais longo com uma sequência anotada exclusivamente no pb; J, número de todos mapeados lê; K, a cobertura de todos mapeados lê por fragmentos por kb a partir de um milhão mapeado lê (FPKM); L, p-valor para o putativo eccDNA comparado a ocorrência por acaso a partir de simulações de Monte Carlo; M, número de uniquely mapeados lê; NÃO; como K e L utilizando apenas mapeados exclusivamente lê (UFPKM). Parâmetros para mapeamento de leituras e simulações de Monte Carlo foram descrito 20.

Discussão

O método Circle-Seq permite a detecção escala genoma de eccDNA a partir de células de levedura com resolução de nível sequência. O método é uma purificação eccDNA leve que não requer vórtice intensiva ou pipetagem e usa a separação da coluna pela força da gravidade para limitar eccDNA ruptura que levaria a digestão de exonuclease no passo subsequente. Estas características do método pode ser crucial para a detecção de grandes eccDNAs que contêm sequências de genes. Circle-Seq detectado numerosas eccDNAs incluindo genes completos (Conjunto de Dados 1). Ele também detectou a 86 kb levedura DNA mitocondrial. Assim, esse protocolo facilita a purificação de grandes elementos circulares de DNA. Mantendo o número de passos de extracção de ADN para um mínimo reduz o risco de perda eccDNA e maximiza o rendimento. Com base nos resultados de controlo, cravado-em plasmídeos, Círculo-Seq é altamente sensível, a detecção de um único ADN circular de 2.500 células. Além disso, a remoção de plasmídeos endógenos abundantes tais como 2μ; plasmídeo ou ADN mitocondrial pode melhorar significativamente a sensibilidade. Cura de 2μ a partir de culturas de levedura foi descrito 30. Alternativamente, 2μ e remoção do DNA mitocondrial pode ser alcançada com uma endonuclease rara de corte, tais como SwaI. No entanto, o passo enzima de restrição poderia ter como alvo outras eccDNAs de interesse e limitar o rendimento total eccDNA.

As etapas críticas para a detecção eccDNA foram remoção de ADN linear (passo 3) e sequenciação de DNA (passo 5) a uma profundidade adequada. Para gravar a maioria dos eccDNAs a partir de uma população de células, sequenciamento de profundidade pode ser necessária 20. sequenciamento-end emparelhado deve fornecer uma confiança ainda maior de detecção eccDNA, como se espera junções circulares de DNA para produzir emparelhado-end lê esse mapa discordantemente. Estas discrepâncias suporta a descoberta de estruturas de ADN circular e pode, potencialmente, ser utilizado como um filtro de detecção de eccDNA adicional.

O Círculo-Semétodo q foi validado utilizando três S. independente populações cerevisiae CEN.PK. Sequências detectadas incluído anteriormente relatado eccDNAs, plasmídeos endógenos e cravado-in plasmídeos e centenas de eccDNAs putativos (Conjunto de Dados 1). Estes resultados suportam conjuntos de dados Círculo-Seq anteriores de S. cerevisiae S288c 20. A descoberta de vários eccDNAs comuns para as populações CEN.PK S288C e indica que estes loci têm uma propensão para existir como elementos circulares (Figura 4). Temos anteriormente demonstrado que o [círculo GAP1] é enriquecido em condições limitadas de nitrogênio no fundo CEN.PK 8, embora não tenha sido encontrada evidência de [círculo GAP1] em outra estirpe fundos. Encontrar de eccDNA do CUP1-1 RSC30, ASP3-1, COS111 e HXT6 HXT7 loci tanto S288c e CEN.PK sugere que uma predisposição para a circularização do DNA é conservido entre as estirpes de levedura. Ele continua a ser mostrado se [HXT6 / 7 círculo], [círculo ASP3-1], [círculo COS111] e [círculo CUP1-1 RSC30] conferem vantagens selectivas para células ou se a sua existência é meramente um efeito de altas taxas de circularização do ADN.

Tomados em conjunto, os resultados indicam que o círculo-Seq é bem adequado para detectar eccDNAs quilobases de tamanho e tem vantagens para a identificação de genes completos com eccDNAs. Circle-Seq é um método altamente sensível que permite telas inteiras escala genoma de eccDNAs de levedura. O método Circle-Seq poderia abrir um novo campo de investigação destinada a elucidar o papel de eccDNA na geração de deleções de genes e amplificações. Dado que a arquitetura e estrutura do DNA são em grande parte conservada desde levedura eucariótica para eucariotas superiores, o método Circle-Seq deve, em princípio, ser applicablE para todas as células eucarióticas, com ligeiras modificações. Actualmente, o método não parece ter quaisquer limitações, embora a sua capacidade de purificar eccDNAs tamanho Megabase-se ainda a ser mostrado. Além disso, a utilização de O29 ADN-polimerase, que utiliza um método de amplificação de rolamento-círculo 31, cria uma tendência para as pequenas eccDNAs eccDNA tornando mais difícil a quantificação. Circle-Seq detecta eccDNAs grandes o suficiente para transportar genes completos, tornando-o adequado para estudos de DNA minutos circular dupla a partir de células somáticas humanas. Minutos duplas podem contribuir para o câncer quando proto-oncogenes são amplificados sobre esses elementos 32-37. Estudos de eccDNAs em células germinativas poderia ser usado para medir as taxas de mutação germinativa e avaliar a qualidade do esperma, por exemplo, na pecuária. Assim, Círculo-Seq tem o potencial para produzir insights sobre a taxa a que a variação genética surge sob a forma de variação do número de cópias, e levam a uma nova compreensão das doenças que envolvem contra cópia do genevariação do número 38-40.

Divulgações

Os autores declaram que não têm interesses financeiros concorrentes.

Agradecimentos

Obrigado a Kenn D. Møller e Claus Sternberg (DTU) pela assistência técnica e a Tue S. Jørgensen pela análise quantitativa de PCR.

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Bacto peptonaBD Difco211677produto alternativo pode ser usado.
Brilliant III SYBR Green PCR Master Mix Agilent Technologies600882Para análise de qPCR. Produto alternativo pode ser usado.
Dextrose (D-glicose)Carl RothHN06.4Produto alternativo pode ser usado.
Grânulos Disruptores, 0,5 mmScientific Industries, Inc.SI-BG05Grânulos de vidro para romper as membranas das células plasmáticas. Produto alternativo pode ser usado.
Brometo de etídioCarl Roth2218.2Coloração em gel de agarose para detecção de DNA/RNA.
Kit de minipreparação de plasmídeo GeneJetThermo FisherK0502Purificação de plasmídeo de bactérias. Produto alternativo pode ser usado.
NotI, FastDigestLife Technologies -  Thermo Fisher Scientific, EUAFD0594Endonuclease. Produto alternativo pode ser usado. 
Kit Plasmid Mini AX A & Um010-50usado para purificar eccDNA.   
Kit DNase dependente de ATP seguro para plasmídeoEpicentro, EUAE3105K. Produto alternativo pode ser usado.
Iodeto de propídioSigma-Aldrich, EUA81845Produto alternativo pode ser usado.
plasmídeo pUG6EUROSCARF, AlemanhaP30114Gene marcador: loxP-PAgTEF1-kanMX-TAgTEF1-loxP.
QIAGEN genômica-ponta 100/G Qiagen, EUA13343Purificação de DNA genômico de levedura. Produto alternativo pode ser usado.
Protocolo REPLI-g Mini Kit Qiagen, EUA150023Amplificação do eccDNA pela polimerase phi29.
Extrato de leveduraBD Difco210929produto alternativo pode ser usado.
Zymolyase 100T (Lyticase, Enzima Lítica de Levedura)Nordic BioSite, SuéciaZ1004-3Produto alternativo pode ser usado.
Acesso a dados a arquivos de sequênciaEuropean Nucleotide Archive Conjunto de dados EccDNA de Saccharomyces cerevisiae CEN. PK113-7D. Número de acesso do estudo PRJEB9684. O 2º número de acesso é ERP010820. O prefixo da tag locus é BN2032. 
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Cepas
Saccharomyces cerevisiae CEN. PK113-7DGenótipo MATa MAL2-8c SUC2
Saccharomyces cerevisiae pool de biblioteca de deleção de leveduraEUROSCARF, AlemanhaS288c BY4741 pool de 4400 mutantes viáveis de deleção de um único gene eliminados pelo módulo KanMX. Genótipos MATa his3Δ 1 leu2Δ 0 met15Δ 0 ura3Δ 0 genexxx::KanMX.
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Equipamentos
DNA Spectrophotometer Espectrofotômetro NanoDrop 1000, Thermo FisherMedindo a concentração de DNA. Produto alternativo pode ser usado.
Microscopia de fluorescênciaNikon Optronics Magnafire. Filtro de fluorescência de excitação vermelho, 663-738 nm.Produto alternativo pode ser usado.
Sistema robótico de construção de bibliotecaApollo 324, IntegenX Inc.Preparação da biblioteca de DNA. Produto alternativo pode ser usado.
Plataforma de sequenciamentoPlataforma Illumina HiSeq 2000, Illumina Inc.Sequenciamento de DNA. Produto alternativo pode ser usado.
UltrasonicatorCovaris LE220, microTUBE AFA Fiber tubesProduto alternativo pode ser usado.
NomeEmpresaNúmero de CatálogoComentários
Métodos
2% YPD media Misture 10 g de Dextrose, 10 g de extrato de levedura, 20 g de Bacto peptona e adicione H2O a um volume total de 1000 ml e autoclave.
Teste Circle-Seq em DNAO DNA genômico foi purificado (Qiagen) de um pool da biblioteca de deleção de leveduras (Euroscarf). A concentração de DNA foi medida por nanodrop e 30 µ g DNA genômico foi pipetado em dois tubos de microcentrífuga. Um tubo de microcentrífuga foi suplementado com plasmídeo de 100 nanogramas (pUG6). As amostras de DNA foram purificadas por Circle-Seq, omitindo as etapas do protocolo 1.1-1.3 e 1.5-1.7. As concentrações de DNA eluído foram medidas por nanogota e todo o rendimento de DNA das amostras GD e GD+P foi tratado com exonuclease por um período de 29 horas. Uma fração de 10% foi coletada para amplificação de phi29 e análise de PCR, enquanto o DNA restante foi submetido a tratamento com exonuclease de 72 horas. As amostras foram analisadas quanto ao conteúdo de DNA linear por PCR, utilizando o gene ACT1 como marcador cromossômico. Uma fração de 5% de cada uma das amostras tratadas com exonuclease foi amplificada pela DNA polimerase phi29 por 16 horas (Qiagen). A presença de DNA em cada amostra foi examinada carregando uma quantidade igual (7 µ l) em poços em 0,5 µ g/ml de gel de agarose de brometo de etídio a 0,9% após a execução de eletroforese em gel. 
Software de mapeamentoBowtie2 alinhador, John Hopkins UniversityAlinhamento de leitura curta ultrarrápido. Referência: 29.
Imagensde DNA corado com iodo de propídio foram capturadas por microscopia de fluorescência com ampliação de 100x (óleo 100x/1,30, Nikon) no canal RFP (filtro de fluorescência de excitação vermelho, 663-738 nm) usando tempo de exposição idêntico (5 segundos). 
Sistema de bioinformática de fluxo de trabalhoGalaxy, Open source.Uma plataforma gratuita baseada na web para pesquisa biomédica intensiva em dados. Referências: 27-28.
kit de purificação de plasmídeos da Biotechnology, Poland Kit de exonuclease dependente de ATP genômico

Referências

  1. Kugelberg, E., Kofoid, E., et al. The Tandem Inversion Duplication in Salmonella enterica.: Selection Drives Unstable Precursors to Final Mutation Types. Genetics. 185 (1), 65-80 (2010).
  2. Reams, A. B., Kofoid, E., Savageau, M., Roth, J. R. Duplication Frequency in a Population of Salmonella enterica. Rapidly Approaches Steady State With or Without Recombination. Genetics. 184 (4), 1077-1094 (2010).
  3. Smith, C. A., Vinograd, J. Small polydisperse circular DNA of HeLa cells. Journal of Molecular Biology. 69 (2), 163-178 (1972).
  4. Carroll, S. M., DeRose, M. L., et al. Double Minute Chromosomes Can Be Produced from Precursors Derived from a Chromosomal Deletion. Molecular and cellular biology. 8 (4), 1525-1533 (1988).
  5. Cohen, S., Yacobi, K., Segal, D. Extrachromosomal Circular DNA of Tandemly Repeated Genomic Sequences in Drosophila. Genome research. 13 (6A), 1133-1145 (2003).
  6. Horowitz, H., Haber, J. E. Identification of Autonomously Replicating Circular Subtelomeric Y' Elements in Saccharomyces cerevisiae. Molecular and cellular biology. 5 (9), 2369-2380 (1985).
  7. Moore, I. K., Martin, M. P., Dorsey, M. J., Paquin, C. E. Formation of Circular Amplifications in Saccharomyces cerevisiae by a Breakage-Fusion-Bridge Mechanism. Environmental and molecular mutagenesis. 36 (2), 113-120 (2000).
  8. Gresham, D., Usaite, R., Germann, S. M., Lisby, M., Botstein, D., Regenberg, B. Adaptation to diverse nitrogen-limited environments by deletion or extrachromosomal element formation of the GAP1 locus. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 107 (43), 18551-18556 (2010).
  9. Windle, B., Draper, B. W., Yin, Y. X., O'Gorman, S., Wahl, G. M. A central role for chromosome breakage in gene amplification, deletion formation, and amplicon integration. Genes & development. 5 (2), 160-174 (1991).
  10. Gresham, D., Ruderfer, D. M., et al. Genome-Wide Detection of Polymorphisms at Nucleotide Resolution with a Single DNA Microarray. Science. 311 (5769), 1932-1936 (2006).
  11. Kidd, J. M., Cooper, G. M., et al. Mapping and sequencing of structural variation from eight human genomes. Nature. 453 (7191), 56-64 (2008).
  12. Gresham, D., Desai, M. M., Botstein, D., Dunham, M. J. The Repertoire and Dynamics of Evolutionary Adaptations to Controlled Nutrient-Limited Environments in Yeast. PLoS Genetics. 4 (12), 1-19 (2008).
  13. Lang, G. I., Botstein, D., Desai, M. M. Genetic Variation and the Fate of Beneficial Mutations in Asexual Populations. Genetics. 188 (3), 647-661 (2011).
  14. van Loon, N., Miller, D., Murnane, J. P. Formation of extrachromosomal circular DNA in HeLa cells by nonhomologous recombination. Nucleic Acids Research. 22 (13), 2447-2452 (1994).
  15. Vinograd, J., Lebowitz, J. Physical and Topological Properties of Circular Dna. Journal of General Physiology. 49 (6P2), 103(1966).
  16. Shibata, Y., Kumar, P., et al. Extrachromosomal MicroDNAs and Chromosomal Microdeletions in Normal Tissues. Science. 336 (6077), 82-86 (2012).
  17. Dillon, L. W., Kumar, P., et al. Production of Extrachromosomal MicroDNAs Is Linked to Mismatch Repair Pathways and Transcriptional Activity. Cell Reports. 11 (11), 1749-1759 (2015).
  18. Li, L. L., Norman, A., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. Metamobilomics - our knowledge on the pool of plasmid encoded traits in natural environments using high-throughput sequencing. Clinical microbiology and infection : the official publication of the European Society of Clinical Microbiology and Infectious Diseases. 18, 5-7 (2012).
  19. Brown Kav, A., Sasson, G., Jami, E., Doron-Faigenboim, A., Benhar, I., Mizrahi, I. Insights into the bovine rumen plasmidome. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109 (14), 5452-5457 (2012).
  20. Møller, H. D., Parsons, L., Jørgensen, T. S., Botstein, D., Regenberg, B. Extrachromosomal circular DNA is common in yeast. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. , 201508825(2015).
  21. Drubin, D. G., Miller, K. G., Botstein, D. Yeast Actin-Binding Proteins - Evidence for a Role in Morphogenesis. The Journal of cell biology. 107 (6), 2551-2561 (1988).
  22. Magdolen, V., Drubin, D. G., Mages, G., Bandlow, W. High levels of profilin suppress the lethality caused by overproduction of actin in yeast cells. FEBS letters. 316 (1), 41-47 (1993).
  23. Sandrock, T. M., Brower, S. M., Toenjes, K. A., Adams, A. Suppressor analysis of fimbrin (Sac6p) overexpression in yeast. Genetics. 151 (4), 1287-1297 (1999).
  24. Blanco, L., Bernad, A., Lázaro, J. M., Martìn, G., Garmendia, C., Salas, M. Highly Efficient DNA Synthesis by the Phage ø29 DNA Polymerase. The Journal of biological chemistry. 264 (15), 8935-8940 (1989).
  25. Dean, F. B. Rapid Amplification of Plasmid and Phage DNA Using Phi29 DNA Polymerase and Multiply-Primed Rolling Circle Amplification. Genome research. 11 (6), 1095-1099 (2001).
  26. Hutchison, C. A., Smith, H. O., Pfannkoch, C., Venter, J. C. Cell-free cloning using ø29 DNA polymerase. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 102 (48), 17332-17336 (2005).
  27. Goecks, J., Nekrutenko, A., Taylor, J., Galaxy Team, T. Galaxy: a comprehensive approach for supporting accessible, reproducible, and transparent computational research in the life sciences. Genome Biology. 11 (8), 86(2010).
  28. Giardine, B., Riemer, C., et al. Galaxy: A platform for interactive large-scale genome analysis. Genome research. 15 (10), 1451-1455 (2005).
  29. Langmead, B., Salzberg, S. L. Fast gapped-read alignment with Bowtie 2. Nature Methods. 9 (4), 357(2012).
  30. Tsalik, E. L., Gartenberg, M. R. Curing Saccharomyces cerevisiae of the 2 micron plasmid by targeted DNA damage. Yeast. 14 (9), Chichester, England 847-852 (1998).
  31. Norman, A., Riber, L., Luo, W., Li, L. L., Hansen, L. H., Sørensen, S. J. An Improved Method for Including Upper Size Range Plasmids in Metamobilomes. PLoS ONE. 9 (8), e104405(2014).
  32. Storlazzi, C. T., Lonoce, A., et al. Gene amplification as double minutes or homogeneously staining regions in solid tumors: Origin and structure. Genome research. 20 (9), 1198-1206 (2010).
  33. Von Hoff, D. D., Needham-VanDevanter, D. R., Yucel, J., Windle, B. E., Wahl, G. M. Amplified human MYC localized to replicating submicroscopic circular DNA molecules. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 85 (13), 4804-4808 (1988).
  34. Raymond, E., Faivre, S., et al. Effects of hydroxyurea on extrachromosomal DNA in patients with advanced ovarian carcinomas. Clinical cancer research : an official journal of the American Association for Cancer Research. 7 (5), 1171-1180 (2001).
  35. Shimizu, N. Extrachromosomal Double Minutes and Chromosomal Homogeneously Staining Regions as Probes for Chromosome Research. Cytogenetic and genome research. 124 (3-4), 3-4 (2009).
  36. Eckhardt, S. G., Dai, A., Davidson, K. K., Forseth, B. J., Wahl, G. M., Von Hoff, D. D. Induction of differentiation in HL60 cells by the reduction of extrachromosomally amplified c-myc. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 91 (14), 6674-6678 (1994).
  37. Vogt, N., Lefèvre, S. -H., et al. Molecular structure of double-minute chromosomes bearing amplified copies of the epidermal growth factor receptor gene in gliomas. Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 101 (31), 11368-11373 (2004).
  38. Ahn, K., Gotay, N., et al. High rate of disease-related copy number variations in childhood onset schizophrenia. Molecular psychiatry. 19 (5), 568-572 (2013).
  39. Girirajan, S., Johnson, R. L., et al. Global increases in both common and rare copy number load associated with autism. Human molecular genetics. 22 (14), 2870-2880 (2013).
  40. Vogt, N., Gibaud, A., Lemoine, F., de la Grange, P., Debatisse, M., Malfoy, B. Amplicon rearrangements during the extrachromosomal and intrachromosomal amplification process in a glioma. Nucleic Acids Research. , (2014).

Reimpressões e permissões

Solicitar permissão para reutilizar o texto ou as figuras deste artigo JoVE

Solicitar permissão

Etiquetas

Purifica o de DNA CircularM todo Circle SeqAmplifica o de C rculo RolanteTratamento com ExonucleaseSequenciamento ProfundoSaccharomyces CerevisiaeEstabilidade do GenomaRecombina o Hom logaEnriquecimento de Plasm deos

Artigos relacionados