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Artigo de método

Laboratório de Simulação de um ferro (II) rico em Precambrian Marinha Ressurgência do sistema para explorar o crescimento de bactérias fotossintéticas

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DOI:

10.3791/54251

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24 de julho de 2016

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1Department of Geosciences, University of Tuebingen, 2Department of Geological and Atmospheric Sciences, Iowa State University

Neste artigo

Resumo

Nós simulamos um sistema de ressurgência marinha ferruginoso Precambrian em uma coluna de fluxo vertical-escala de laboratório. O objetivo foi compreender perfis como geoquímicas de O2 e Fe (II) evoluir como cianobactérias produzem O 2. Os resultados mostram a criação de um chemocline devido a Fe (II) oxidação pelo fotossinteticamente O produziu 2.

Resumo

Um conceito convencional para a deposição de alguns pré-cambrianas Banded Ferro Formações (BIF) parte do princípio de que o ferro ferroso [Fe (II)] ressurgência de fontes hidrotermais no oceano pré-cambriano foi oxidado pelo oxigênio molecular [O 2] produzida por cianobactérias. Os BIFs mais antigas, depositadas antes da Grande Oxidação Evento (GOE) em cerca de 2,4 bilhões de anos (Gy) atrás, poderia ter se formado por oxidação direta de Fe (II) por anoxigênicas photoferrotrophs sob condições anóxicas. Como um método para testar os padrões geoquímicos e mineralógicos que se desenvolvem em diferentes cenários biológicos, nós projetamos uma coluna de fluxo vertical, 40 cm de comprimento para simular um Fe anóxica (II) rico em representante de um oceano antigo sistema de ressurgência marinha numa escala de laboratório . O cilindro foi embalado com uma matriz de pérolas de vidro poroso para estabilizar os gradientes geoquímicos e amostras líquidas para a quantificação de ferro poderiam ser tomadas ao longo da coluna de água. O oxigénio dissolvido foidetectado de forma não invasiva através optodes a partir do exterior. Os resultados de experiências bióticos que envolvidas fluxos de ressurgência de Fe (II) a partir do fundo, um gradiente de luz distintas, de cima, e cianobactérias presente na coluna de água, mostra uma clara evidência para a formação de Fe (III) precipita minerais e desenvolvimento de um chemocline entre o Fe (II) e O 2. Esta coluna permite testar hipóteses para a formação dos BIFs por cultura de cianobactérias (e no futuro photoferrotrophs) sob condições simuladas Precambrianos marinhos. Além disso, nós supomos que o nosso conceito de coluna permite a simulação de vários ambientes químicos e físicos - incluindo marinhos ou lacustres sedimentos superficiais.

Introdução

O pré-cambriano (4,6-,541 Gy atrás) atmosfera experimentou uma acumulação gradual de fotossíntese produzido oxigênio (O 2), talvez pontuada por mudanças graduais na chamada "Grande Oxidação Event" (GOE) a cerca de 2,4 Gy atrás, e novamente no Neoproterozóico (1-,541 Gy atrás) como o 2 atmosférico se aproximarem dos níveis modernos 1. As cianobactérias são os restos evolucionários dos primeiros organismos capazes de fotossíntese aeróbica 2. Geoquímicos estudos evidências e modelagem apoiar o papel dos ambientes costeiros rasos em abrigar comunidades ativas de cianobactérias ou organismos capazes de fotossíntese aeróbica ou fototróficas oxigênicos, gerando oásis de oxigênio locais na superfície do oceano abaixo de um ambiente predominantemente anóxica 3-5.

A deposição de formações ferríferas (BIFs) a partir de água do mar ao longo dos pontos Precambrianos de ferro (II) (Fe (II)) como um importante geoquímico Constituent da água do mar, pelo menos localmente, durante a sua deposição. Algumas das maiores BIFs são depósitos de águas profundas, formando fora da plataforma e talude continental. A quantidade de Fe depositado é incompatível a partir de um ponto de vista o equilíbrio de massa com (ou seja, resistência) de origem predominantemente continental. Portanto, grande parte da Fé devem ter sido fornecidos de alteração hidrotermal de máfica ou fundo do mar ultramafic crosta 6. As estimativas da taxa de Fe depositado popa dos ambientes costeiros são consistentes com Fe (II) fornecido à superfície do oceano através de ressurgência 7. Para que Fe para ser transportado em correntes de ressurgência, deve ter estado presente na forma reduzida, mobile - como Fe (II). O estado de oxidação de Fe média preservada em BIF é 2.4 8 e pensa-se geralmente que BIF preservar Fe depositado na forma de Fe (III), formado quando ressurgência de Fe (II) foi oxidado, possivelmente por oxigénio. Portanto, explorar Fe (II) mecanismos potenciais de oxidação ao longo environme inclinaçãonts é importante entender como BIF formado. Além disso, refinado caracterização geoquímica de sedimentos marinhos identificou que as condições ferruginosos, onde Fe (II) esteve presente em uma coluna de água anóxica, eram uma característica persistente dos oceanos em todo o pré-cambriano, e não pode ter sido limitado a apenas o tempo e lugar onde BIF foram depositados 9. Portanto, há pelo menos dois bilhões de anos de história da Terra, interfaces de redox entre Fe (II) e O 2 nos oceanos rasos eram susceptíveis comum.

Numerosos estudos utilizar sites modernos que são análogos químicos e / ou biológicos de características diferentes do oceano pré-cambriano. Um bom exemplo são lagos ferruginosos, onde Fe (II) é estável e presente nas águas de superfície iluminada pelo sol, enquanto a atividade fotossintética (incluindo por cianobactérias) foi detectado 10-13. Os resultados destes estudos fornecem informações sobre as características geoquímicas e microbianas de um ico para anóxico / ferchemocline ruginous. No entanto, estes sites são geralmente fisicamente estratificada com pouca mistura vertical 14, em vez de as interfaces químicas que ocorrem em um sistema de ressurgência, e são pensados ​​para apoiar a produção mais oxigênio no tempo pré-cambriano 4.

Um análogo natural para explorar o desenvolvimento de um oásis de oxigênio marinho sob uma atmosfera anóxica, e por um (II) sistema de ressurgência rico em Fe na coluna de água de superfície iluminada pelo sol não está disponível na Terra moderna. Portanto, é necessário um sistema de laboratório que podem simular uma zona de ressurgência ferruginosas e também apoiar o crescimento de cianobactérias e photoferrotrophs. A compreensão e identificação de processos microbianos e sua interação com um meio aquoso ressurgência que representa a água do mar pré-cambriano promove a compreensão e pode complementar as informações obtidas a partir do disco de rock, a fim de compreender totalmente os processos biogeoquímicos distintivas na Terra antiga.

Para esse fim, uma coluna de escala laboratorial foi concebido em que o Fe (II) rico em meio de água do mar (pH neutro) foi bombeada para a parte inferior da coluna, e bombeado para fora a partir do topo. Iluminação foi fornecido na parte superior para criar um 4 cm de largura "zona photic" que apoiou o crescimento de cianobactérias no top 3 cm. Os ambientes naturais são geralmente estratificada e estabilizado por gradientes físico-químicas, como salinidade ou temperatura. A fim de estabilizar a coluna de água sobre uma escala de laboratório, o cilindro coluna foi empacotada com uma matriz de pérolas de vidro porosa que ajudou a manter o estabelecimento de padrões geoquímico que se desenvolveram durante o experimento. Um fluxo contínuo de gás N2 / CO 2, foi aplicada para lavar o espaço superior da coluna, a fim de manter uma atmosfera anóxica reflectora de um oceano antes da GOE 15. Depois de um fluxo constante de Fe (II) foi estabelecida, cianobactérias foram inoculados através da coluna, e a sua growth foi monitorizada por contagem de células em amostras retiradas através de portas de amostragem. O oxigénio foi monitorada in situ, colocando folhas optode sensíveis ao oxigénio sobre a parede interna do cilindro de coluna e as medições foram feitas com uma fibra óptica a partir de fora da coluna. Aquosa Fe especiação foi quantificada por amostras remoção dos portos de amostragem horizontal de profundidade resolvida e analisados ​​com o método Ferrozine. Os experimentos de controle abióticos e resultados demonstram uma prova de conceito - que um análogo de escala de laboratório da coluna de água antigo, mantido em isolamento da atmosfera, é realizável. Cianobactérias cresceu e produziu o oxigênio, e as reações entre Fe (II) e oxigênio foram resolúvel. Aqui, a metodologia para a concepção, preparação, montagem, execução e amostragem de tal coluna são apresentados, juntamente com os resultados de um 84 horas de execução da coluna enquanto inoculados com a cianobactéria marinha Synechococcus sp. PCC 7002.

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Protocolo

1. Preparação de cultura médio

Nota: As informações sobre os equipamentos necessários, produtos químicos e materiais para a preparação do meio de cultura é listado na Tabela 1 Itálico códigos alfanuméricos entre parênteses referem-se a equipamentos discriminados na Tabela 2 e mostrado na Figura 1..

  1. Prepare 5 L de meio marinho fotoautotrófico (MP) (adiante designado por "meio") seguindo o protocolo de Wu et al. 16. Ajustar o pH para 6,8 utilizando HCl M anóxica e estéril 1 ou 0,5 M NaCO3. Como fonte para o Fe (II), adicionar 3,5 ml de um 1 M anóxica e estéril FeCl2 -solution para alcançar uma Fe final (II) a concentração de 500 uM após filtrar a solução forma no passo seguinte.
  2. Armazenar a solução de meio a 5 ° C durante 48 horas, a fim de precipitar o Fe (II) de carbonato e fosfato minerais. Fe (II) adição e precipitação de Fe mineral resulta em um pH mudança, portanto, reajustar o pH de volta para 6,8. Filtra-se o meio numa caixa de luvas anóxica (100% N 2) através de uma unidade de filtro de 0,22 um. Repartir o meio filtrada para um frasco estéril 5 L de vidro (E.'1) dentro de um porta-luvas e tampa com uma tampa de borracha butílica estéril.
  3. Lavar o espaço superior do frasco de meio com N2 / CO2 (v / v, 90/10) por inserção de uma agulha descartável ligada à linha de gás para a rolha, e uma segunda agulha que actua como um respiradouro. Certifique-se de alterar o volume do headspace 10 vezes. Por exemplo, com um fluxo de gás constante de 10 ml / seg, lave o volume superior de 50 ml durante pelo menos 50 seg (comparar Hungate & Macy 17).
  4. Cobrir a garrafa meio (E), que está agora pronto para usar com folha de alumínio e armazenar a RT em ambientes escuros para impedir a oxidação de Fe (II). Permitir que 3 dias para a preparação médio.

2. Preparação da Cultura

"> Nota:.. A cultura de Synechococcus PCC 7002 SP que é usado na experiência da coluna é descrito como marinho unicelular género cianobactérias photoheterotrophic 18 Foi fornecida pelo Dr. M. Eisenhut (Instituto de Bioquímica, Universidade de Duesseldorf, Alemanha) . Para o estudo atual da cultura material foi cultivado em meio anóxico MP sem Fe adicional (II).

  1. Preparação de 100 ml de meio de MP seguindo o protocolo de Wu et al. 16, mas o cloreto férrico substituto com 1 ml de L citrato de amónio / férrico com 6 mg / ml.
  2. Em condições anóxicas (luvas, 100% N2), dispensar o meio em um 120 ml de garrafas de soro estéril, tampa com uma tampa de borracha butílica estéril e friso com cápsula de alumínio. Alterar o headspace para N 2 / CO 2 (v / v, 90/10) (compare Hungate & Macy 17) e inocular com 5% da cultura estoque. Subsequentemente armazenar a cultura numa incubadora de luz a 25 ° C e 600 Lux a partir de um Tungsten lâmpada.
  3. Desde Synechococcus sp. PCC 7002 é fotossensível, após a transferência, cobrir o frasco de soro com uma toalha de papel fino para o primeiro 24 horas na incubadora luz. Permitir que a cultura a crescer durante 6-8 dias. actividade fotossintética irá resultar na oxidação de Fe (II) e Fe (II) não será estático para a escala de tempo de crescimento celular, por conseguinte transferir a cultura depois de 7 dias para manter o Fe (II) no meio e as células adaptadas a Fe (II).
  4. Monitorar a densidade celular por recolha de amostras para a densidade óptica (DO) medições: A densidade de células (células / ml) da cultura pode ser determinado através da absorvância da amostra de suspensão de células em uma foto-espectrómetro, num comprimento de onda de 750 nm 19. A relação linear entre OD 750 e contagem de células microscópicas diretos de uma cultura em fase log irá determinar a densidade absoluta de célula 20.
  5. Assim que uma densidade celular de 10 8 células / ml é atingida,embrulhar a garrafa de soro com folha de alumínio, a fim de parar a produção de oxigênio pela fotossíntese.
  6. Remover o O2 na suspensão de células utilizando um filtro de seringa estéril de 0,22 um ligado a uma longa (100 mm) da agulha descartável inserido no meio líquido. Lave o headspace e da bolha da cultura com N 2 / CO 2 por 5 min (compare Hungate & Macy 17). Manter a amostra no escuro até a inoculação na coluna.

3. Preparação de Itens e peças individuais para Experimental Set-up

Nota: As informações sobre o equipamento necessário para o conjunto experimental, quantidades e especificações estão listadas na Tabela 2.   Partes dos itens que serão utilizados para a montagem experimental são preparados com antecedência e são rotuladas individualmente com uma letra maiúscula única (AG), listadas na Tabela 2 e mostrado como close-ups na Figura 1 bem. Itálico códigos alfanuméricos entre parênteses no protocolo referem-se ao equipamento discriminada na Tabela 2 e são mostrados na Figura 1.

  1. A fim de preparar as portas de amostragem (D) para a coluna, fechar as portas fechadas por uma rolha de borracha butílica apertada (A.3). Inserir uma agulha de aço inoxidável (D. ') na tampa de borracha butílica. Certifique-se de que a ponta da agulha está no centro da coluna.
    1. Conectar-se a agulha para um tubo de borracha (D.2) e selar a ligação com um tubo termorretráctil (D.3). Conecte a outra extremidade do tubo a um pequeno conector Luer tubo de bloqueio ( 'D.5), selar a ligação com um tubo termorretráctil (D.3) e tape o conector do tubo com uma tampa de plástico apropriado (D.6) .
      Nota: Dependendo do número desejado de pontos de amostragem é necessário fornecer uma porta principal com várias portas de amostragem - therefore inserir as agulhas de aço inoxidável (D.1) em um ângulo oblíquo na rolha de borracha butílica.
  2. Para conectar as garrafas de médio e de descarga para a coluna, modificar rolhas de borracha butílica seguintes os seguintes passos:
    1. Insira dois capilares de aço inoxidável (E.3; E.4) na tampa de borracha butílica (E.2). Ligue os tubos de borracha apropriados (E.6) para estes capilares e selar a conexão com tubos de calor encolhe (E.5).
    2. Adicionar uma ligação de tubo (E.7) para a outra extremidade do tubo capilar mais do (E.3) e também fixar este conector com um tubo termo-retráctil (E.5).
    3. Conectar uma agulha de aço inoxidável (E.11) à extremidade livre do outro tubo ligado ao capilar de mais curto (E.4), selar as ligações com termorretráctil tubos (E.5), e inserir a outra extremidade do agulha de aço inoxidável em uma rolha de borracha butílica menor (E.10).
    4. Insira dois capilares de aço inoxidável (G.3) em uma tampa de borracha grande butil (G.2) e anexar os tubos apropriados de borracha (G.4; G.5). Ligue a extremidade livre do tubo de borracha mais curto (G.4) para um capilar garrafa de descarga médio (W2). Equipar a extremidade livre do tubo mais longo (G.5) com um conector de tubo pequeno (G.6). Repita essas etapas, a fim de preparar uma nova rolha de borracha butílica para uma segunda garrafa de descarga.
  3. Prepara-se o tampão para o painel de distribuição médio (M) através da inserção de duas agulhas de aço inoxidável (F.3) para uma rolha de borracha de butilo (F.2), a fim de produzir linhas de fornecimento de dois meios para a coluna. Anexar um tubo de borracha (F.4) a cada uma das agulhas e conectar uma garrafa de forma capilar (C1) a um dos tubos de borracha, respectivamente.
  4. A fim de preparar as glândulas para a linha de fornecimento de meio (B), conectar um meiocapilar de fornecimento (C2) a um conector de tubo pequeno (B.3) com um tubo de borracha (B.4). Repita esta etapa para outra glândula de alimentação médio.
    1. Use o capilar de descarga mais médio (w1) em vez de preparar as glândulas para a linha de descarga médio e siga os passos anteriores (compare (B) na Figura 1).
      Nota: É útil para rotular entrada e na saída com diferentes cores de fita para auxiliar na montagem apropriada.
  5. Montar as peças de painel de troca de gás do espaço interno (C) através da inserção de dois longo Luer Lock agulhas de aço inoxidável (c.2) para um tubo de borracha (C.1) e certificar-se de que as pontas das agulhas atingir 4 cm para fora da outra extremidade do tubo. Encha o tubo com Polymers cola (C.8) e deixar secar o conjunto por pelo menos 6 horas.
    1. Vagamente encher duas seringas Luer bloqueio de vidro (C.3) com algodão (C.4).
    2. Separadamente preparar dois esfregar butilber rolhas (C.5), um com uma agulha de aço inoxidável inseridas (C.6) eo outro com uma agulha de aço inoxidável (C.7). Não ligue para as seringas de vidro, ainda.
  6. Prepara-se uma seringa de vidro (E.8) cheia com algodão (E.9) para uso posterior de acordo com a garrafa e gás bloco médio (GP).
  7. Montar o equipamento para um pacote de gás de 10 L (gp) ligando um tubo de borracha (gp.1) na válvula do bloco de gás. Inserir um conector de tubo (gp.2) na extremidade livre do tubo de borracha. Repita este procedimento para um segundo pacote de gás de 10 L.

4. Esterilização da coluna e do Equipamento

Nota: Dependendo das propriedades do material, o equipamento é esterilizado por um dos três métodos seguintes:

  1. Esterilizar o material feito de vidro por forno seco (180 ° C durante 4,25 h):
    1. Esterilizar o equipamento para fazer média (ver Tabela 1 e 1.2) separadamente e com antecedência. Portanto, prepare-se 2 x 5 L garrafas de vidro e cobrir a abertura e o gargalo com folha de alumínio. Pacote de 4 x 5 ml e 5 x 2 pipetas ml de vidro em um recipiente resistente ao calor e forno-esterilizar todos os equipamentos.
    2. Esteriliza-se o equipamento para a coluna instalado num segundo passo. Enrole as seringas de vidro (C.3; E.8; F.1 - preparado na seção 3) com folha de alumínio e certifique-se de que as rolhas de borracha butílica correspondentes são removidos.
    3. Coloque as esferas de vidro (a.2) numa proveta de vidro e cobrem a parte superior com a folha de alumínio. Também cobrir a placa de vidro transparente (A.4), 4 x grandes conectores tubulares (b.2) e o conector de 3 vias (G.7) ​​com folha de alumínio e forno-esterilizar tudo.
  2. Esterilizar plásticos e líquidos autoclaváveis ​​em autoclave (120 ° C, 10 bar, 20 min):
    1. No primeiro passo, Sterilize Widdel o balão com o meio, a solução -buffer NaHCO3 e duas rolhas de borracha butílica para o frasco de vidro de 5 L.
      Nota: rolhas de borracha de butilo são preparados primeiro por ebulição em água ultrapura 3 vezes e, em seguida autoclavada em um copo de vidro com um pouco de água, coberta com folha de alumínio. As rolhas de molhadas são mais fáceis de inserir em garrafas de vidro.
    2. Num segundo passo esterilizar o equipamento para a coluna de montagem experimental. A fim de preparar a coluna para esterilização na autoclave, enrole a abertura superior, as aberturas de fornecimento de mídia, as aberturas de descarga media, eo headspace desabafar com folha de alumínio antes da autoclavagem.
    3. Cobrir as portas de amostragem (D.'5) com as tampas de plástico apropriados (D.'6) e certifique-se de remover os grampos (D.4) antes da autoclavagem.
    4. Enrole as rolhas de borracha butílica e os capilares correspondentes para as garrafas de médio e de descarga (E.2; 2 x G.2 - i preparadosecção n 3), as rolhas de menores para as seringas de vidro (2 x C.5; E.'10 '; F.'2 - preparado na seção 3) e os capilares ligados às glândulas meio de alimentação e de descarga (s2; w1 - preparada na secção 3.4) em uma folha de alumínio e esterilizar todos os equipamentos na autoclave.
    5. Após a esterilização, a coluna secar e equipamento esterilizado num forno a 60 ° C durante mais 4 h.
  3. Uma vez que o tubo de bomba (AP) não é autoclavável, esterilizá-los em uma solução de etanol (EtOH) (80% de EtOH, 20% de água). Encher um copo adequado com EtOH-solução e coloque o tubo de bomba na mesma, assegurando que o tubo é completamente cheio com EtOH-solução. Retire depois de 3 horas e envolva diretamente em folha de alumínio pré-esterilizado (forno-esterilizado) e deixe secar à temperatura ambiente durante 2 h.

5. Montagem da coluna e do Equipamento

  1. Colocar a coluna (A) sobre uma superfície plana e estabilizar com um suporte de laboratório e grampos. Certifique-se de trabalhar em condições estéreis (por exemplo, dentro de 40 cm de um bico de Bunsen ou sob um capuz de fluxo laminar). Remova cuidadosamente a folha de alumínio da abertura superior e preencher as vidro-esferas esterilizadas (a.2).
    1. Prepara-se o vidro de relógio (a.4), a fim de fechar hermeticamente a coluna através da aplicação da cola Polímeros (A. 5) para a superfície interior na área onde estarão em contacto com a coluna. Pressione levemente o vidro de relógio no lugar no topo da coluna, a fim de cola ambas as partes firmemente junto. Permitir que pelo menos 6 horas para a instalação para secar.
      Nota: É possível colocar um arame flexível estéril, fina entre a borda e a coluna de vidro de relógio, a fim de remover facilmente o vidro de relógio depois do experimento.
  2. Enquanto trabalhava em condições estéreis anexar os seguintes componentes para a coluna:
    1. Ligue os tubos de borracha (b.1) e os conectores de tubo correspondentes (b.2) ao fornecimento e descarga aberturas médias (compare (B) na Figura 1).
    2. Ligar as ligações de tubo das glândulas (b.3) para fornecimento de meios de comunicação e de descarga (preparada na secção 3.4) para os conectores correspondentes na coluna (comparar (B) na Figura 1).
    3. Fixe o painel de troca de gás headspace (compare (C) na Figura 1 - preparado na seção 3.5) ao headspace de ventilação na coluna e conectar as seringas de vidro (C.3) para as agulhas correspondentes de aço inox (c.2) e inserção as rolhas apropriadas de borracha butílica (C.6; C.7 - preparados na seção 3.5.2) para as seringas de vidro cheio de algodão (C.3).
  3. Insira as rolhas de borracha butílica para as garrafas de descarga (2 x G.20; - preparado na seção 3.2) em dois frascos de 3 L de vidro estéreis (G.1), e ligar as ligações de tubo das garrafas (G.6) para o conector de 3 vias (G.7).
  4. Conecte a extremidade livre do capilar Glândula de descarga médio (W1) à extremidade livre de um capilar garrafa de descarga (W2) com tubos de bomba (pt). Repita este procedimento para o segundo capilar Glândula de descarga médio e a segunda garrafa de descarga.
  5. Ligar a extremidade livre de uma garrafa capilar médio (S1) para a extremidade livre do capilar de fornecimento glândula médio (S2) com o tubo de bomba (PT). Repita este procedimento para o segundo capilar garrafa médio e o segundo meio capilar glândula abastecimento.
  6. Monte o painel de distribuição médio, inserindo a rolha com os capilares correspondentes (F.2 - preparado na seção 3.3) para dentro da seringa de vidro do meiopainel de distribuição (F.1).
  7. Ligue o painel de distribuição de média ao conector da rolha de borracha butílica para o frasco de forma (E.7 - comparar F na Figura 1).
  8. Ligue a linha 2 de gás N2 / CO para o painel de troca gasosa do espaço livre acima do Luer Lock agulha de aço inoxidável (ver a posição (LLF) na Figura 1), e descarregar a instalação coluna e sistema capilar com N2 / CO2 a baixa pressão (<10 mbar). Manter uma saída de gás nas extremidades abertas do capilar forma garrafa (E.3), o conector de 3 vias (G. 7), e as portas de amostragem (D.5). Portanto, certifique-se de ter as tampas das portas de amostragem (D.6) ligeiramente abertos, para manter condições estéreis através de uma sobrepressão de gás que flui para fora.
    1. Lave a instalação completa durante pelo menos 20 min.
      Nota: Além disso, é possível fechar a outgassing agulha (C.6) do painel de troca gasosa do espaço de cabeça com um tubo de borracha apropriado e uma pinça, a fim de aumentar a eficiência de lavagem a instalação completa.
  9. Enquanto isso, encher um saco de gás de 10 G (GP) com N2 / CO2 (v / v, 90/10), na sequência de 10 ciclos de enchimento e a eliminação de ar (usando uma bomba de vácuo) a totalidade do volume para garantir que o saco é completamente anóxica . Certifique-se de fechar a válvula da embalagem de gás após o preenchimento final. Repita este procedimento com um segundo pacote de gás, mas fechar a válvula depois de purga (ou seja, deixá-lo vazio).
    Nota: O N 2 / CO 2 pacote cheio de gás vai ser ligado ao frasco de forma a fim de compensar o volume superior a aumentar devido à perda de meio por bombagem. O N 2 / CO 2 lavada, mas pacote de gás vazia, vai depois ser ligados às garrafas de descarga, a fim de permitir que o gás escape no espaço superior, devido ao aumento do volume de descarga de líquido.
  10. Inserir tele butil rolha de borracha (E.10 - preparada no ponto 3.2.3) para a seringa de vidro esterilizada preenchido com algodão (E.8 - preparada na secção 3.6).
  11. Coloque a garrafa meio cheia e fechada (E - preparado na seção 1) na bancada do laboratório ao lado da rolha para o meio garrafa (E.2), e preparar-se para ligar a rolha da garrafa meio utilizando o seguinte procedimento:
    1. Feche o fluxo de gás N 2 / CO 2 no capilar (E.3) fechando o tubo de borracha correspondente (E.5) com uma braçadeira.
    2. Levemente levantar a tampa de borracha butílica da garrafa médio e liberar o espaço livre com N 2 / CO 2 (50 mbar) por enforcamento um, algodão seringa -filled esterilizado com uma inclinação, longa agulha de metal (1 mm x 140 mm) no gargalo da garrafa meio (compare Hungate & Macy 17).
    3. Remover rapidamente a rolha de borracha de butilo a partir da garrafa de forma e inserir a rolha de borracha de butilo preparado (E.2) dentro da garrafa de forma (E).
    4. Mudar a agulha de metal longo da seringa (anteriormente utilizado para a lavagem do headspace) a uma agulha descartável (0,9 mm x 45 mm; amplamente disponível) e injetar na rolha, a fim de liberar o espaço superior do frasco de meio com N 2 / CO 2.
    5. Certifique-se de que tem um ligeiro fluxo de saída de gás na extremidade aberta da seringa gás (E.8 - montada na secção 5.10) ligado à tampa da garrafa forma. Lavar o espaço superior do frasco de forma (E) e a seringa de vidro (E.8) durante pelo menos 4 minutos.
  12. Enquanto isso, aperte as tampas de plástico (D.6) dos portos de amostragem (D.'5) e fechar o tubo de borracha correspondente (D.2) com uma braçadeira (D.4).
    Nota: Se necessário, abra aagulha desgaseificação (C.6) do painel de troca gasosa do espaço de cabeça de novo, a fim de manter um fluxo de saída de gás na extremidade aberta da agulha.
  13. Coloque o pacote de gás 10 G, encheu-se com N2 / CO2 (preparada na secção 5.9), sobre a bancada de laboratório. Certifique-se de que o conector do tubo está numa posição ao lado da extremidade aberta da seringa de vidro (E.8) ligado à garrafa de forma.
  14. Após lavar o espaço superior do frasco de forma (E), para, pelo menos, 4 min, fechar a linha de gás N2 / CO 2 a seringa de lavagem e rapidamente puxar a agulha da injecção para fora do bujão (E.2). A sobrepressão restante de gás dentro do espaço superior do frasco de forma será libertado por meio de seringa de vidro (E.8).
    1. Rapidamente abrir a válvula de gás do pacote e pressionar ligeiramente sobre o saco para manter uma saída de N2 / CO2, a fim de limpar o tubo e o conector do bloco de gás.
    2. Assim que o excesso de pressão é libertado a partir da forma garrafa, rapidamente ligar o conector do bloco de gás (gp.3) ao conector correspondente da seringa de vidro (E.8).
  15. Conectar um pacote vazio 10 L de gás (GP) que foi previamente lavada 10 vezes com N2 / CO2 (preparada na secção 5.9) para a porta livre do conector de 3 vias (G.7) ​​ligados às garrafas de descarga. Certifique-se de manter a válvula da embalagem de gás fechado.
  16. Reduzir a pressão da linha de N2 / CO2 gasoso (<0,1 mbar) no painel de troca gasosa do espaço livre (C na figura 1; posição LLF) para manter uma saída de gás a partir da agulha de saída de gás (C.6).
  17. Insira a tubulação da bomba (pt) para a bomba (P) e retirar a braçadeira do tubo de borracha correspondente (E.6) da garrafa médio (E).
    1. Abrir a válvula de gás do pacote (GP)ligado às garrafas de descarga (G) para permitir ao ar ser libertado para o pacote de gás, enquanto as garrafas de descarga de encher com meio de saída.
  18. Ligue a bomba e monitorar o painel de distribuição médio (ver (F)) enchendo de meio. Certifique-se de remover o gás remanescente no painel que enche-se, segurando-o em uma posição invertida. O gás é libertado através dos capilares que estão ligados à bomba.
  19. Monitorar a coluna enquanto se enche com o meio, e ajustar a bomba a uma taxa de bombagem adequada de 0,45 L / dia, que pode ser convertida para um fluxo vertical de Fe 10 mM (II) / m 2 / d, de modo a simular o fluxo química de interesse.
  20. Instalar a fonte de luz (L) 2 cm acima da extremidade superior da coluna e cobrir os 10 cm de profundidade em torno da coluna com uma fita escura e / ou folha de alumínio a fim de evitar que a luz que irradiam para fora da parte superior da coluna e iluminar a parte inferior da coluna. Cobrir a totalidadeinstalação de um forro têxtil escuro, a fim de impedir que a iluminação de coluna de fontes de luz externas.

6. A inoculação de bactérias na Coluna

Nota: Para uma experiência de controlo abiótico este passo é ignorado.

  1. Uma vez que a cultura de células irá ser injectado directamente na coluna através de rolhas de borracha de butilo dos principais pontos de amostragem ao longo do lado da coluna, certifique-se de ter preparado seis seringas com agulhas que são o tempo suficiente para atingir o centro do corpo da coluna.
  2. Esteriliza-se o lado de fora da tampa de borracha de butilo das seis portas de amostragem principais na coluna (A.3) com uma solução de EtOH (80%).
  3. Tenha a garrafa de soro com a cultura para inoculação pronto (preparado na seção 2) e esterilizar a rolha de borracha butílica por chamas várias gotas de solução de EtOH. Lave a seringa estéril com N2 / CO2, antes de tomar uma aliquota da cultura. Tomar 1 ml of a solução da célula anóxica e injectá-la no centro da coluna através das rolhas de borracha de butilo dos principais portos de amostragem (a.3).
    Nota: Dependendo do crescimento bacteriano, pode ser necessário ajustar a velocidade de bombeamento (ou mesmo parar a bombagem) durante os primeiros dias da fase de retardamento para o crescimento e desenvolvimento de células para prevenir as culturas de ser lavado para fora.

7. Amostragem

Nota: A fim de recolher amostras através dos gradientes químicos que se desenvolvem no interior da coluna, é necessário iniciar a amostragem dos pontos de amostragem superiores antes de as portas mais profundas, como a perda de volume ocorre. Certifique-se de manter condições estéreis (por exemplo, através do trabalho dentro de 40 cm de um bico de Bunsen ou sob um capuz de fluxo laminar).

  1. Recolher as primeiras amostras de 24 h após a inoculação. Lave a seringa que vai ser utilizado para a amostragem com N estéril 2 / CO 2, a fim de evitar a injecção de oxigénio para o SAportos mpling (D). Certifique-se para encher a seringa com N 2 / CO 2 antes da amostragem.
  2. Remover rapidamente a tampa de plástico (D.6) e inserir a seringa de amostragem para o conector do tubo (D.5). Manter um pequeno intervalo entre seringa e conector do tubo. Libertar o gás a partir da seringa e lave o conector do tubo com N2 / CO2.
    1. Firmemente ligar a seringa ao conector do tubo. Remover o grampo (D4) e tomar uma amostra de cerca de 1 ml.
  3. Depois de desenhar a amostra e antes de retirar a seringa, coloque a braçadeira (D.4). Em seguida, retire a seringa de amostragem e firmemente fechar o conector do tubo (D.5), com a tampa de plástico correspondente (D.6).
  4. repita imediatamente passos 7,1-7,3 para a amostragem de cada porto.
  5. Recolher o próximo conjunto de amostras a cada 24 horas.
    Nota: Para amostras adicionais em diferentes intervalos de tempo, que é necessário para remover uma pequena AMount de amostra (por exemplo, 0,2-0,4 ml) inicialmente antes que a amostra pode ser feita, de modo a remover o elemento residual no interior do tubo de recolha de amostras e para atingir as amostras representativas do interior da coluna.

8. Métodos de Análise

  1. Quantificação de oxigénio:
    Nota: A concentração de oxigénio no interior do meio de fluxo e o espaço da cabeça da coluna é quantificada de forma não invasiva e não destrutiva utilizando os sensores de oxigénio ópticos e manchas da folha fluorescentes oxigénio sensível de 0,5 x 0,5 cm (chamados optodes), colada ao longo a parede de vidro interna da coluna, utilizando cola de silicone (A.6). Garantiu-se que os adesivos sensíveis a oxigénio da folha são insensíveis às espécies de Fe, a fim de conseguir leituras fiáveis.
    1. Certifique-se para calibrar o software de computador com os parâmetros de calibração adequados para os optodes que são utilizados na coluna. Os sensores de oxigênio ópticos vêm com um Calibrat específicaião para a medição utilizando um medidor de oxigénio de fibra óptica controlada por computador correspondente.
    2. Inicie a medição e ter o cuidado de manter a fibra óptica polímero do medidor de oxigénio a um ângulo recto com a folha sensível ao oxigénio que é colada no interior da parede de vidro transparente da coluna.
    3. Repetir a medição para cada ponto de medição de O 2 ao longo da coluna.
  2. Fe (II) e análise de Fe total de amostras aquosas:
    1. Uma vez que o Fe (II) é rapidamente oxidado pelo oxigénio no ar, a pH neutro, estabilizar as amostras de líquido aquoso para Fe (II) quantificação imediatamente em solução de 1 M de HCl. Para um volume de amostra final de 1 ml de mistura de 0,5 ml da amostra líquida com HCl 0,5 M ml 2.
    2. Quantificar Fe total após a incubação de uma aliquota da amostra M de HCl-1 estabilizada com cloridrato de hidroxilamina (10% p / v, em HCl 1 M) durante 30 min. Este reagente reduz todo o Fe (III) a Fe (II), que pode, então, ser quantificada através do ensaio Ferrozine 21.
    3. Executar uma Ferrozine ensaio utilizando um leitor de placas de micro-titulação. Medir a absorvância a um comprimento de onda de 562 nm. Certifique-se de ter padrões dentro da faixa de Fe detectável (II) e as concentrações de Fe total.
      Nota: Se as concentrações de Fe, na amostra de líquido exceder calibrações padrão, é necessário diluir a amostra estabilizada com HCl 1M.
    4. Calcular a concentração de Fe (III) por a diferença entre o total de Fe e de Fe (II).

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Resultados

experimento controle

Experimentos de controle abiótico (10 dias) demonstraram concentrações consistentemente baixos de oxigênio (O 2 <0,15 mg / L) sem flutuações significativas na Fe (II) -profile ao longo da coluna de água de ressurgência. A formação de precipitados (presumivelmente Fe (III) (oxyhydr-) óxidos) no reservatório médio e a ligeira diminuição do Fe (II) concentração glob...

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Discussão

comunidades microbianas no oceano Pré-Cambriano eram regulados pelo, ou modificados como resultado de, a sua actividade e as prevalecentes condições geoquímicas. Ao interpretar as origens da BIF, investigadores geralmente inferir a presença ou a actividade de micro-organismos com base na sedimentology ou Geochemistry de BIF, por exemplo, Smith et ai. 23 e Johnson et ai. 24. O estudo de organismos modernos em ambientes modernos que têm análogos geoquímicos para ambientes a...

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Divulgações

Autores não têm nada a revelar.

Agradecimentos

Mark Nordhoff ajudou na concepção e implementação de conexões de tubos. Ellen Struve ajudou a seleccionar e adquirir equipamentos utilizados.

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Balão Widdel (5 L)Ochs110015labor-ochs.de
Frascos de vidro (5 L)RotilaboY682.1carlroth.com
Pipetas de vidro (5 ml)51714labor-ochs.de
0.22 µ m Unidade de filtro Steritop (0.22  µ m Membrana de polietersulfona)MilliporeX337.1carlroth.com
Seringa de vidro Luer Lock estéril
mm ID)201015labor-ochs.de
NaClSigma433209sigmaaldrich.com
MgSO4Sigma208094sigmaaldrich.com
CaCl2SigmaC4901sigmaaldrich.com
NH4ClSigmaA9434sigmaaldrich.com
KH< sub>2PO4SigmaP5655sigmaaldrich.com
KBrSigmaP3691sigmaaldrich.com
KClSigmaP9541sigmaaldrich.com
CilindroY310.1carlroth.com
Lã7377.2carlroth.com
Contas de vidro (ø 0.55 - 0.7& nbsp; mm)11079105 biospec.com
Rolha de borracha butílica (ø 1.2 cm)271024labor-ochs.de
Placa de Petri, vidro (ø 8.0  cm)T939.1carlroth.com
Cola de polímerosOTTOSEAL S68adchem.de
Folha de sensor óptico de oxigênio (para análise de oxigênio, veja abaixo)- a pedido -presens.de
Tubo de borracha (35 mm, 7  mm ID)770350labor-ochs.de Conector
tubo Luer Lock (3,0 mm, Luer lock macho = LLM)P343.1carlroth.com
Conector de tubo Luer Lock (3,0 mm, Luer lock fêmea = LLF)P335.1carlroth.com
Tubo de borracha (25 mm, 0,72 mm ID)2600185newageindustries.com
Tubo de borracha (50 mm, 7  mm ID)770350labor-ochs.de
Agulha de aço inoxidável Luer Lock (150 mm, 1.0 mm ID)201015Seringa de
vidro labor-ochs.de Luer Lock (10 ml)C680.1carlroth.com
Algodão solto –
Tampa de borracha butílica (ø 1.75 cm)271050labor-ochs.de
Agulha de aço inoxidável (40 mm, 1.0  mm ID)Agulhade aço
inoxidável bbraun.de Luer Lock 4665120 esterilizada (150 mm, 1,5 mm ID)201520labor-ochs.de
: Peça do conector fêmea Luer Lock em C.7
ColaOTTOSEAL S68adchem.de
Agulha de aço inoxidável (120 mm, 0,7 mm ID)Sterican4665643bbraun.de
Tubo de borracha (40 mm, 0,74 mm ID)2600185newageindustries.com
Tubo termorretrátil (35  mm, 3 mm ID encolhido)541458 - 62conrad.de
BraçadeiraSTHC-C-500-4tekproducts.com
Conector de tubo Luer Lock (1,0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
Tampa de plástico Luer Lock (LLM)CT69.1carlroth.com
Garrafa de vidro (5 L)RotilaboY682.1carlroth.com
Rolha de borracha butílica (para GL45)444704labor-ochs.de
Capilar de aço inoxidável (300 mm, 0,74 mm de diâmetro interno)56736sigmaaldrich.com
Capilar de aço inoxidável (50 mm, 0,74 mm de diâmetro interno)56737sigmaaldrich.com
Tubo retrátil (35 mm, 3  mm ID encolhido)541458 - 62conrad.de
Tubo de borracha (100 mm, 0.74 mm ID)2600185newageindustries.com
Conector de tubo Luer Lock (1.0 mm, LLF)P334.1Seringa de
vidro Luer Lock carlroth.com (10 ml)C680.1carlroth.com
Algodão solto –
Rolha de borracha butílica (ø 1,75 cm)271050 labor-ochs.de
Agulha de aço inoxidável (40 mm, 0,8  mm ID)Seringade vidro com trava Luer bbraun.de 4657519
esterilizada (5 ml)C679.1carlroth.com
Rolha de borracha butílica (ø 1,75 mm)271050labor-ochs.de
Tubo de borracha (40 mm, 0,74 mm ID)2600185newageindustries.com
Frasco de vidro (2 L)RotilaboX716.1carlroth.com
Rolha de borracha butílica (para GL45)444704labor-ochs.de
Capilar de aço inoxidável (50 mm, 0,74 mm de diâmetro)56736sigmaaldrich.com
Tubo de borracha (30 mm x 0,74 mm de diâmetro interno)2600185newageindustries.com
Tubo de borracha (100 mm x 0,74 mm de diâmetro interno)2600185newageindustries.com
Conector de tubo Luer Lock (1,0 mm, LLF)P334.1carlroth.com
Conector Luer Lock de 3 vias (LLF, 2x LLM)6134cadenceinc.com
Fonte de luzSamsungSI-P8V151DB1USsamsung.com
Bomba peristálicaIsmatecEW-78017-35coleparmer.com
Tubulação de bombeamento (0.89  mm ID)EW-97628-26coleparmer.com
Capilar de aço inoxidável (200 mm, 0.74 mm ID)56736sigmaaldrich.com
Capilar de aço inoxidável (400 mm, 0.74 mm ID)56737sigmaaldrich.com
Pacote de gás Supel-Inert Foil (Tedlar - PFC) (10 L)30240-U sigmaaldrich.com
Tubo de borracha (30 mm, 6  mm ID)770300labor-ochs.de
Conector de tubo Luer Lock (3,0 mm, LLM)P343.1carlroth.com
Conector de tubo Luer Lock (3,0 mm, LLF)P335.1
Seringa à prova de gás carlroth.com (20  ml)C681.1carlroth.com
queimadorBunsen–
Medidor de oxigênio de fibra óptica para quantificação de oxigênioPresensTR-FB-10-01presens.de
Bomba–
Cola de silicone para optódios de oxigênioPresensPS1presens.de
de folha de alumínio, preenchida com agulhas de aço inoxidável C681.1 carlroth.com Luer Lock de algodão (150 mm, 1.0  de vidro de vidro de Posição de polímeros de tubo de de vácuo

Referências

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