Artigo de método

Isolamento de perivascular Multipotentes populações de células precursoras a partir de tecido cardíaco humano

DOI:

10.3791/54252

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8 de outubro de 2016

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1Centre for Cardiovascular Science, Queen's Medical Research Institute, University of Edinburgh, 2Department of Bioengineering and Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 3Research Laboratory of Electronics and Department of Biological Engineering, Massachusetts Institute of Technology, 4MRC Centre for Regenerative Medicine, University of Edinburgh, 5Stem Cell Research Center, Department of Orthopaedic Surgery, University of Pittsburgh, 6Department of Orthopaedic Surgery, University of Texas Health Science Center at Houston, 7Department of Orthopaedic Surgery, UCLA Orthopaedic Hospital, David Geffen School of Medicine, University of California at Los Angeles

Neste artigo

Resumo

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tecido cardíaco humano abriga populações de células precursoras perivasculares multipotentes que podem ser adequados para a regeneração do miocárdio. A técnica aqui descrita permite o isolamento e purificação simultânea de duas populações de células estromais multipotentes associados com os vasos nativos de sangue, ie CD146 + CD34 - pericitos e células CD34 + CD146 - células adventícias, a partir do miocárdio humano.

Resumo

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As células-tronco/estromais mesenquimais multipotentes (MSC) foram isoladas convencionalmente, por meio de sua aderência plástica, de digestões de tecido primário, enquanto sua localização anatômica do tecido permaneceu incerta. A recente descoberta da expressão definida de marcadores de células perivasculares e MSC por células perivasculares em vários tecidos por nosso grupo e outros pesquisadores proporcionou uma oportunidade para isolar e purificar prospectivamente subpopulações homogêneas específicas de células precursoras perivasculares multipotentes. Demonstramos anteriormente o uso de classificação de células ativadas fluorescentes (FACS) para purificar pericitos microvasculares CD146 + CD34- e células vasculares CD34 + CD146- adventícias do músculo esquelético humano. Aqui, descrevemos um método para isolar simultaneamente esses dois subconjuntos de células perivasculares do miocárdio humano por FACS, com base na expressão de um conjunto definido de marcadores de superfície celular para seleções positivas e negativas. Este método disponibiliza, portanto, duas subpopulações específicas de células precursoras multipotentes do tipo MSC cardíaca para uso em pesquisa básica e / ou investigações terapêuticas.

Introdução

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O coração tem sido considerada um órgão de pós-mitótico. No entanto, estudos recentes têm demonstrado a presença de volume de negócios de cardiomiócitos limitada nos corações humanos adultos 1. As células-tronco / progenitoras nativas com potencial de diferenciação de cardiomiócitos também foram identificados dentro do miocárdio em roedores adultos e corações humanos, incluindo Sca-1 +, c-kit +, formando-cardiosphere e, mais recentemente, as células precursoras perivasculares 2,3. Estas células representam candidatos atraentes para terapias destinadas a reforçar cardíaca reparação / regeneração por meio de transplante de células ou a estimulação da proliferação in-situ.

Mesenquimais estaminais / células do estroma (MSC) foram isoladas a partir de quase todos os tecidos humanos 4,5 ensaios clínicos das aplicações terapêuticas de MSC foram realizadas para várias condições patológicas, tais como a reparação cardiovascular 6, reacção do enxerto contra o hospedeiro de doença 7 , E cirrose hepática 8. Efeitos benéficos têm sido atribuídas à capacidade de MSCs para: lar de locais de inflamação 9; diferenciarem em diferentes tipos de células 10; secretam moléculas pró-reparadoras 11; e modular a resposta imune do hospedeiro 12. O isolamento de MSCs tem tradicionalmente contado com a sua adesão preferencial aos substratos de plástico. No entanto, a população resultante de células é tipicamente sensivelmente 13 heterogénea. Através da utilização de células activadas fluorescentes (FACS) com uma combinação de marcadores chave de células perivasculares, fomos capazes de isolar e purificar uma população precursora MSC como multipotentes (CD146 + / CD31 - / CD34 - / CD45 - / CD56 -) a partir de vários tecidos humanos, incluindo adultos músculo esquelético e gordura branca 14.

populações de células em vários tecidos perivasculares não cardíacos foram mostrados como tendo propriedades / progenitoras de células-tronco umnd estão sendo investigados para uso clínico no cenário cardiovascular. Pericitos, um dos subconjuntos de células perivasculares mais conhecidos, são uma população heterogênea que desempenhar vários papéis fisiopatológicos, incluindo no desenvolvimento de novos vasos 15, a regulação da pressão arterial 16, e manutenção da integridade vascular 17,18. Como mostrado em vários tecidos, subconjuntos específicos de pericitos nativamente expressar antigénios MSC e sustentar seus fenótipos MSC-like em cultura primária após FACS purificação 14. Além disso, estas células de manter de forma estável os seus fenótipos de longo prazo no interior da cultura e exibem potencial de diferenciação de multi-linhagem, semelhante ao MSC 19,20. Estes resultados sugerem que pericitos são uma das origens da MSC evasivo 14. O potencial terapêutico dos pericitos foi demonstrada com uma redução na formação de cicatrizes do miocárdio e função cardíaca melhorada após o transplante em feridas isquemicamentecorações 21. Recentemente, purificado com sucesso pericitos do miocárdio humano e demonstrou seus fenótipos MSC-like e multipotency (adipogênese, condrogênese e osteogênese) com a ausência de tecido muscular esquelético 3. Além disso, pericitos do miocárdio apresentaram diferenciais cardiomiogênico capacidades potenciais e angiogénicos quando comparado com os seus homólogos purificados a partir de outros órgãos.

A segunda população de células estaminais / progenitoras multipotentes perivasculares, a célula adventícia, foi isolado a partir de veias safenas humanas com base na expressão positiva CD34 22. Células adventícias venoso foram mostrados como tendo um potencial clonogénico, capacidade de diferenciação mesodérmicos e potencial pró-angiogénico in vitro. Transplante destas células para os corações de ratos lesionados por isquemia resultou numa redução na fibrose intersticial, um aumento na angiogénese e o fluxo sanguíneo do miocárdio, reduzida dil ventricularção, e aumento da ejecção cardíaca fracção 23. Interessantemente, as células adiposas adventícia foram mostrados a perder expressão de CD34 e CD146 regular a expressão na cultura em resposta ao tratamento angiopoietina II, sugerindo que a adopção de um fenótipo de pericitos estimulação com 24. Dentro do coração, no entanto, a população de células da adventícia ainda não foi prospectivamente purificado por FACS e / ou bem caracterizados. Utilizando os procedimentos de isolamento celular descritos nas seções a seguir, estamos actualmente a caracterizar células adventícias do miocárdio e investigar o seu potencial para aplicações regenerativas.

Aqui nós descrevemos um método para isolar e purificar duas subpopulações de células estaminais / progenitoras perivasculares do miocárdio fetal ou adulto humano. Este método de isolamento de células prospectivo vai permitir aos investigadores obter subconjuntos de células tronco / progenitoras perivasculares isogênicas de biópsias cardíacas humanas para estudos comparativos e furtheR explorar o seu potencial terapêutico em várias condições patológicas cardíacas.

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Protocolo

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1. Processamento de Cardiac Humano Amostra

  1. Certifique-se que todos os fluidos, recipientes, instrumentos e da área operacional dedicado são estéreis.
  2. Colocar a amostra de tecido cardíaco (adquiridos pelo banco de tecidos ou equipa cirúrgica) em meio de armazenamento composto de forma refrigerada de Dulbecco modificado de Eagle (DMEM) contendo 20% de soro fetal de bovino (FBS) e 1% de penicilina-estreptomicina (P / S) em gelo para o transporte 3.
  3. Retirar a amostra cardíaca a partir do meio de armazenamento e lava-se com um meio de lavagem constituído por soluto salino tamponado com fosfato (PBS) suplementada com 2% de FBS e 1% de P / S. Ao manusear a amostra, utilize uma pinça bem cotado para captar grandes vasos ou pericárdio e minimizar o esmagamento do miocárdio.
  4. Submergir a amostra em meio de lavagem em uma placa de Petri e retire o pericárdio, endocárdio e grandes vasos sanguíneos com tesoura de íris esterilizadas e uma pinça de ponta fina, tal como descrito 3.
  5. Corte o restante myocardium em pequenos pedaços de aproximadamente 1 mm3 utilizando uma única lâmina de barbear lado ou um par de íris tesoura afiada. Nota: As maiores produções de células será obtida se as amostras são processadas imediatamente. Se um atraso é inevitável, a armazenagem do tecido cardíaco processada no meio de armazenamento de fresco (> 5 ml por 1 cm3 de tecido) a 4 ° C durante até 72 h, é possível, no entanto, presumivelmente com um declínio associado no rendimento celular.

2. Digestão do tecido e Isolamento de células

  1. Recentemente fazer-se a solução de digestão que compreende 1,5 ml de cada de colagenase I, II, colagenase, e a colagenase IV (todos a 0,5 mg / ml em DMEM) e aquecido a 37 ° C num banho de água.
    Nota: O volume e concentração de colagenases são adequados para amostras de aproximadamente 1 cm3.
  2. Filtrar os pedaços de tecido em suspensão através de um filtro de 100 um e lavar duas vezes com PBS. Transferir os pedaços de tecido para um recipiente estéril de 30 ml comuma tampa hermeticamente fechado.
    Nota: potes de largura curtas em vez de tubos estreitos altos dar melhores resultados. Como alternativa, pedaços de tecido colocado num tubo estéril de 50 ml e colocar na horizontal, se um recipiente de 30 ml não está disponível.
  3. Adicionar todas as soluções de digestão (4,5 mL no total) e colocar o recipiente dentro de um saco de plástico selado num banho de água com agitação a 37 ° C definida para 120 rpm. Alternativamente, selar o recipiente com película de parafina e coloque em um agitador orbital aquecida definido para 120 rpm.
  4. Após 15 min, remover e inverter o pote três vezes antes de substituir durante mais 15 min. Remover e extinguir as colagenases com 5 ml de DMEM suplementado com 20% de FBS e 1% de P / S.
  5. Tritura-se o produto da digestão por pipetagem suave dez a vinte vezes com uma pipeta de 10 ml serológico para quebrar quaisquer aglomerados de tecido. Filtra-se a suspensão sequencialmente através de 100 um, 70 um e, finalmente, 40 filtros celulares uM para remover materiais não digeridos e se obter uma suspensão de célula única.
    Nota:Não enxaguar entre filtros celulares para evitar célula debrisgenerated pelo processo de digestão enzimática.
  6. Centrifugar a suspensão de células a 200 xg durante 4 min, decanta-se cuidadosamente o sobrenadante e ressuspender o sedimento em 1 ml de tampão de lise de glóbulos vermelhos durante 2 min à temperatura ambiente antes de se diluir com 4 ml de meio de lavagem.
  7. Repetir o passo de centrifugação e re-suspender o sedimento em 1 ml de meio de lavagem. Misturar bem e tomar 10 ml da suspensão de células para contagem das células.
  8. Misturar 10 ul da suspensão celular com 10 ul de tripano mancha azul e colocar 10 ul da mistura em um hemocitómetro padrão para contagem das células. Contar o número de células vivas, redondo presente nas quatro esquinas (cada uma subdividida em dezesseis pequenos quadrados) e dividir por 4 para obter a média por metro quadrado de canto. Multiplicar a média de 2 a conta para o factor de diluição e, em seguida, mancha por 10 4 para se obter o número total de células por 1 ml de amostra.

3. Rotulagem celular e classificação

  1. Adicionar 50 ul de soro de ratinho para a suspensão de células e incubar a 4 ° C durante 20 min para bloquear o anticorpo não específico de ligação.
  2. Centrifugar a suspensão de células com soro de ratinho a 200 xg durante 4 min, remover o sobrenadante, e re-suspensão em meio de lavagem, a uma concentração de 1 x 10 6 células por 100 ul.
  3. Alíquota de 50 ul cada da suspensão de células para o isotipo e em controlos não coradas de poliestireno de fundo redondo de dois tubos de citometria de fluxo, em seguida, colocar o volume remanescente para um terceiro tubo para a coloração de multi-cor.
  4. Adicionar CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, e anticorpos CD146-AF647 (todos 1: 100) para a suspensão de células individuais para a coloração de multi-cor. Para o controle isotipo, adicione volumes equivalentes de PE-, APC-Cy7-, PE-Cy7-, PerCP-Cy5.5- e anticorpos do isotipo AF647-conjugados. Suavemente pipeta para misturar os anticorpos com as células e incubar todos os tubos a 4 ° C durante 20min no escuro.
  5. Prepare esferas de controlo de compensação pela adição de uma gota de grânulos positivas para 100 l de meio de lavagem em cada cinco poliestireno rodada tubos de citometria de fluxo de fundo. Adicionar CD34-PE, CD45-APC-Cy7, CD56-PE-Cy7, CD144-PerCP-Cy5.5, e anticorpos CD146-AF647 (todos 1: 100) individualmente para cada um dos 5 tubos. Incubar todos os tubos a 4 ° C durante 20 min no escuro.
  6. Durante a incubação, preparar tubos de colheita de células, cada uma com 500 uL de Meio de Crescimento Endotelial-2 (EGM-2) meio de cultura e colocar a 4 ° C.
  7. A seguir à incubação do anticorpo, adicionam-se 5 ml de meio de lavagem para lavar as células e os grânulos a fim de remover anticorpo não ligado. Centrifugar todos os tubos a 200 xg durante 4 min. Repetir o passo de lavagem e centrifugação. Cuidadosamente decantar o sobrenadante e pipeta suavemente quando as células re-suspensão.
  8. Re-suspender em meio de lavagem, a uma concentração de aproximadamente 1 x 10 6 células por 250 ul. Re-suspender as contas em 100 ml de lavar medium.
  9. Transportar todas as suspensões celulares e talão para a separação de células em gelo no escuro. Adicione 1 gota de contas negativas aos tubos de controlo positivo de compensação de contas e usá-los para definir a compensação de fluorescência.
  10. Execute as células de controlo não coradas de acordo com as instruções do fabricante para determinar a fluorescência de fundo e definir as tensões com o seguinte: FSC 150V; SSC 290V; V450 / 50 350V; V710 / 50 620V; B530 / 30 400V; B710 / 50 530V; YG780 / 60 460; R670 / 30 480V; R780 / 60 460V. controlos isotipos executado de acordo com as instruções do fabricante para estabelecer os limites de fluorescência de fundo relacionada com a ligação não-específica. Execute o multi-color amostra corada e recolher o pericyte e populações de células adventícias nos tubos de recolha (Figura 1).
    NOTA: os rendimentos de células viáveis ​​óptimas são de aproximadamente 3% da dissociação de células vivas totais para pericitos e 4% para células adventícias.

Cultura 4. celular

  1. Selecione placas de cultura de tamanho adequado de acordo com o resultado da triagem FACS. Adicionar 100 ul de solução estéril de gelatina 0,2% por cm2 de área de crescimento e agitar manualmente para revestir os poços inteiras. Incubar as placas a 4 ° C durante 10 min e remover a solução de gelatina completamente. Manter as células recolhidas no gelo enquanto prepara placas de cultura.
    Nota: pericitos recentemente classificada e células adventícias crescem bem quando semeadas a uma densidade de 30.000 a 40.000 células / cm2 sobre a superfície de cultura revestidos com gelatina.
  2. Centrifugar as células recolhidas recentemente a 200 xg durante 4 min e suavemente re-suspender o sedimento de células em uma quantidade apropriada de AGE-2.Seed as células em placas revestidas com gelatina.
    Nota: O número real de células a serem semeadas por poço e a quantidade de AGE-2 a ser adicionado depende da selecção placa. Por exemplo, 0,5 ml e 1 ml de EGM-2 são necessários por poço para placas de 48 poços e 24, respectivamente.
  3. Troca EGM-2 para meio de crescimento celular perivascular (DMEM suplementado com 20% FBS e 1% de P / S) para ambos os pericitos e células adventícias uma vez as células se estabeleceram e aderiu à placa (depois de pelo menos 72 horas). Troque a mídia cada 72 horas a partir de então. Levar a cabo as incubações subsequentes iniciais e todos em 5% de CO 2 e a 37 ° C.
  4. Separar as células utilizando EDTA de tripsina a 0,05% quando pericitos e células adventícias atingir 80 a 90% de confluência. Extingue-se com 20% de FBS em PBS, centrifugação a 200 xg durante 4 min, re-suspender em meio de crescimento celular perivascular, e, em seguida, a passagem das células a uma razão de 1: 3 em placas de cultura de poliestireno não revestidas. De passagem 2 em diante, as células de passagem a uma relação de 1: 5 (ou em cerca de 7.000 células / cm2) para placas de cultura de poliestireno não revestidas ou frascos.

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Resultados

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As células individuais foram distinguidos dos detritos e dupletos na base de distribuições dispersão frontal e lateral. células vivas foram identificados por sua incapacidade de absorver o corante DAPI. A estratégia gating foi escolhido com base na rotulagem deste vivo, dissociação de células inteiras cardíaca (Figura 1) controlo de isotipo. A partir das células vivas, células CD45 + foram fechado em primeiro lugar para fora, seguido de células CD56 +.

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Discussão

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A evidência crescente suporta uma capacidade regenerativa limitada do coração humano adulto após a lesão. Identificação e caracterização de células precursoras nativas responsáveis ​​por estas respostas regenerativos em corações feridos são crítica, tanto para a compreensão dos mecanismos associados e vias de sinalização e o desenvolvimento de abordagens para utilizar estas células terapeuticamente.

Protocolos anteriores descreveram o isolamento de subconjuntos de células precursoras perivas...

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Divulgações

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Os autores não têm conflito a divulgar.

Agradecimentos

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Os autores gostariam de agradecer a Shonna Johnston, Claire Cryer, Fiona Rossi e Will Ramsay, da Universidade de Edimburgo, e a Alison Logar e Megan Blanchard, da Universidade de Pittsburgh, por sua assistência especializada em citometria de fluxo. Também gostaríamos de agradecer a Anne Saunderson e Lindsay Mock por sua ajuda na obtenção de tecidos humanos. Amostras de tecido cardíaco humano adulto e fetal foram obtidas com total permissão ética do Comitê de Ética em Pesquisa Médica do NHS Scotland Tayside e do Comitê de Ética em Pesquisa do NHS Lothian (REC08 / S1101 / 1), respectivamente. Este trabalho foi apoiado por doações do Conselho de Pesquisa Médica (BP), British Heart Foundation (BP), Commonwealth of Pennsylvania (BP), Children's Hospital of Pittsburgh (BP), National Institute of Health R01AR49684 (JH) e R21HL083057 (BP) e Henry J. Mankin Endowed Chair na Universidade de Pittsburgh (JH). O JEB foi apoiado por um prêmio de treinamento de doutorado do Centro de Excelência em Pesquisa da British Heart Foundation (RE/08/001/23904). O WC foi apoiado em parte por uma bolsa de pré-doutorado da American Heart Association (11PRE7490001).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Kit de contas anti-rato AbCSondas molecularesA-10344
Colagenase IGibco17100-017Reconstituir o pó conforme necessário e esterilizar o filtro
Colagenase IIGibco17101-015
Colagenase IVGibco17104-019
anti-humano CD34-PEBD Pharmingen555822Manter estéril
anti-humano CD45-APC-Cy7BD Pharmingen557833Manter estéril
anti-humano CD56-PE-Cy7BD Pharmingen557747Manter estéril
anti-humano CD144-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566Manter estéril
anti-humano CD146-AF647AbD SerotecMCA2141A647Manter estéril
EGM2-BulletKitLonzaCC-3162Para coleta de células e cultura até aderir
DMEM, glicose alta, GlutaMAX sem piruvato de sódioThermoFischer Scientific10566-016
Soro Fetal BovinoThermoFischer Scientific10500-064Congele em alíquotas e mantenha estéril
GelatinaSigma AldrichG1393Diluir com água estéril
IgG1k-PEBD Pharmingen559320Mantenha estéril
IgG1k-APC-Cy7BD Pharmingen557873Mantenha estéril
IgG1k-PE-Cy7BD Pharmingen557872Mantenha estéril
IgG1k-PerCP-Cy5.5BD Pharmingen561566Mantenha estéril
IgG1k-647AbD SerotecMCA1209A647Mantenha estéril
Soro de camundongoSigma AldrichM5905Mantenha estéril Filme de Parafina Estéril
- Parafilm MSigma AldrichP7793
Penicilina-EstreptomicinaGibco15979-063Congele em alíquotas e mantenha estéril
Solução salina tamponada com fosfato pH 7.4ThermoFischer Scientific10010-023vermelhos estéreis
Hybri-MaxSigmaAldrich R7757Mantenha o
tripano estéril Solução AzulSigma AldrichT8154
Tripsina-EDTA 0.5%(10x)Invitrogen15400-054
  FACSARIA FUSIONBD PharmingenClassificador de Células Ativadas por Fluorescência
Mantenha o tampão de lise de glóbulos

Referências

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