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Artigo de método

Transcrição in vitro Ensaios e sua aplicação em Drug Discovery

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DOI:

10.3791/54256

⸱

20 de setembro de 2016

 , 
1School of Environmental and Life Sciences, University of Newcastle, 2Department of Applied Biology and Chemical Technology, The State Key Laboratory of Chirosciences, The Hong Kong Polytechnic University

Neste artigo

Resumo

Neste manuscrito, descrevemos um protocolo para examinar funcionalmente a transcrição e a atividade inibitória de agentes antibacterianos direcionados à transcrição bacteriana.

Resumo

Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos e amplamente utilizados durante muitos anos para estudar os mecanismos moleculares envolvidos na transcrição. Este processo requer múltiplas subunidades de polimerase de ADN dependente de ARN (RNAP) e uma série de factores de transcrição que actuam para modular a actividade de RNAP durante a expressão do gene. eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos radiomarcados é usado para fornecer informações mecanicista detalhadas sobre como rendimentos de transcrição e quais parâmetros podem afetá-lo. Neste artigo descrevemos o protocolo para estudar como o factor de alongamento essencial NusA regula a pausa de transcrição, bem como um método para identificar um agente antibacteriano alvo de iniciação de transcrição através da inibição da formação holoenzyme RNAP. Estes métodos podem ser usados ​​como uma plataforma para o desenvolvimento de abordagens adicionais para explorar o mecanismo de acção dos factores de transcrição que ainda permanecem incertos, bem como novos agen antibacterianats alvo de transcrição que é um alvo da droga subutilizados em pesquisa e desenvolvimento de antibióticos.

Introdução

A transcrição é o processo em que o ARN é sintetizado a partir de um molde de ADN específica. Em células eucariotas, existem três RNAPs distintas: eu RNAP transcreve precursores de rRNA, RNAP II é responsável pela síntese de ARNm e de certos RNAs nucleares pequenos, e a síntese de rRNA 5S e tRNA é realizada por RNAP III. Em bactérias, existe apenas uma RNAP responsável pela transcrição de todas as classes de ARN. Existem três fases de transcrição: iniciação, alongamento e terminação. A transcrição é um dos processos mais altamente reguladas na célula. Cada etapa do ciclo de transcrição representa um ponto de verificação para a regulação da expressão do gene 1. Para a iniciação, RNAP tem de se associar com um factor sigma para formar holoenzima, o que é necessário para dirigir a enzima para locais específicos chamados promotores de 2 para formar um complexo promotor aberta. Posteriormente, um grande conjunto de fatores de transcrição são responsáveis ​​pela regulação oatividades f RNAP durante as fases de alongamento e terminação. O fator de transcrição aqui examinado é a proteína altamente conservada e essencial, Nusa. Ele está envolvido na regulação da transcrição e a pausa de terminação, bem como anti-terminação durante a síntese de rRNA 3-5.

Os ensaios in vitro de transcrição foram desenvolvidos como poderosas ferramentas para estudar os passos de regulação complexos durante a transcrição 6. Em geral, um fragmento linear de ADN incluindo uma região promotora é necessária como molde para a transcrição. O molde de ADN é normalmente gerado por PCR ou por linearização um plasmídeo. proteínas e os NTP (incluindo uma NTP marcado radioactivamente para fins de detecção) purificados são então adicionados e produto analisado a seguir ao período de incubação necessário. Usando modelos apropriados e condições de reacção, todas as etapas de transcrição foram examinadas utilizando esta abordagem, o que permitiu a caracterização molecular detalhada da transcription ao longo do último meio século 7. Em combinação com a informação sobre a estrutura 3-dimensional da RNAP Também foi possível investigar o mecanismo molecular da inibição da transcrição pelos antibióticos e conduz a antibióticos, e utilizar essa informação para o desenvolvimento de novas e melhores drogas 8-10.

Neste trabalho fornecem exemplos de como ensaios de transcrição pode ser usada para determinar o mecanismo de regulação da transcrição por alongamento / factor de terminação NusA, e a forma como o mecanismo de acção de um inibidor da ligação de iniciação da transcrição podem ser determinados novos.

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Protocolo

Cuidado: As experiências envolvem o uso do isótopo radioactivo 32 P e nenhum trabalho deve ser realizado até que tenham sido cumpridas todas as condições de segurança adequadas. Geralmente são necessárias de pessoal para participar de um curso de segurança e submetidos a prática supervisionada antes experimentos utilizando reagentes radioativos. Por favor, usar equipamento de proteção individual (dosímetro termoluminescente, óculos de segurança, luvas, sala de radiação jalecos, calças de comprimento total, fechou-toe sapatos) ao realizar a reação.

1. Preparação de Materiais de Ensaio

  1. Obter a proteínas necessárias para o ensaio de transcrição.
    1. Para o experimento descrito aqui, produzir mais e purificar E. coli RNAP em laboratório, conforme descrito 11, ou obter a partir de uma fonte comercial (Lista de Materiais).
      Nota: Ambos fornecem resultados semelhantes. Outros métodos para purificação de RNAP nativo ou de afinidade marcado pode também ser usado 12,13. / factores nusa Sigma pode ser obtido sob a forma described em trabalhos anteriores 14,15.
  2. Água Preparação de dietil pirocarbonato (DEPC) tratados
    Nota: Como alternativa, água RNase-livre pode ser obtida a partir de fontes comerciais (lista de materiais).
    1. Adicionar 1 ml de pirocarbonato de dietilo (DEPC) a 1 L de água purificada (0,1% v / v) e misturar durante a noite.
    2. água DEPC autoclave e dicas duas vezes.
  3. Template Preparação DNA
    1. Purifica-se o plasmídeo pSG1154 16 e / ou 17 pIA226 utilizando um kit de purificação de plasmídeo (Lista de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante.
    2. Para amplificar o molde para ensaios de transcrição run-off (um fragmento de 360 pb que abrange a região do promotor xil a P), montar uma reacção de PCR em gelo incluindo 25 ul mistura 2x PCR (Lista de Materiais), 2 ul de cada um dos iniciadores (5? M) : 5'-CAAAGCCTGTCGGAATTGG-3 '(directo) e 5'-CCCATTAACATCACCATC-3' (inverso), 1 ul de plasmídeo pr pSG1154eparation (250 uM) e 20 ul de água purificada).
      1. Ou, em alternativa, para os ensaios individuais transcrição redondas, amplificar um fragmento de 447 pb abrangendo a região R promotor λ P de pIA226 17. Defina-se uma reacção de PCR em gelo utilizando 25 ul de mistura de PCR 2x, 2 ul de cada um dos iniciadores (5 uM): 5'-GTGCTCATACGTTAAATCT-3 '(directo) e 5'-CAGTTCCCTACTCTCGCATG-3' (inverso), 1 ul pIA226 17 preparação de plasmídeo (250 uM) e 20 ul de água purificada).
        Nota: Este modelo carece de citosina até que a posição nt 26, que é o dia 26 nucleótidos a partir do sítio do início da transcrição. Por isso, a transcrição utilizando este molde irá permitir a iniciação, a liberação de promotor e parando no nt 26 de modo a formar um complexo estável alongamento transcrição (CE) quando apenas ATP, UTP e GTP estão presentes na reacção.
    3. Defina-se uma reacção de PCR com as seguintes condições: 95 °; C durante 30 seg, 50 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg, repetindo-se durante 30 ciclos.
    4. Purifica-se o produto utilizando um kit de PCR clean-up (Lista de Materiais) de acordo com as instruções do fabricante e elui-se em 100 ul de tampão de transcrição para o ensaio de transcrição.
    5. Determinar a concentração de DNA modelo usando um fluorospectrometer (Lista de Materiais).
  4. NTP Preparação
    Nota: os NTP pode ser obtido de diferentes fontes comerciais (lista de materiais).
    1. Dissolve-se os NTP (≥99% de pureza) em água tratada com DEPC para fazer um estoque H, alíquota de 1 ml da solução em tubos de 1,5 ml (50 ul em cada tubo) e armazenar a -20 ° C.
    2. Pedido α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol) antes da experiência. 32 P tem uma meia-vida curta de 14,29 dias.
      Nota: O uso de UTP marcados com alfa evita comparação da intensidade das bandas com comprimento diferente.
  5. Preparação de ARN Escada
    1. Monte o following de reacção à temperatura ambiente: 0,5 ug de ARN mistura Molde (Lista de Materiais), 80 mM de HEPES tampão a pH 7,5, MgCl 2 12 mM, NaCl 10 mM, DTT 10 mM, ATP 2 mM / CTP / GTP, UTP 0,5 mM, 2 ul a- 32 P UTP, 0,5 mL T7 RNAP (Lista de Materiais), DEPC-água tratada a 20 l.
    2. Permitir a reacção prosseguir a 37 ° C durante 1 h. Utilizar imediatamente ou armazenar a -80 ° C.

2. Preparação de RNA Gel Sequencial

  1. Preparação gel
    1. Limpar as placas de um aparelho de gel de sequenciação (Lista de Materiais) duas vezes com etanol a 70% e água purificada, e montar a célula com um pente e dois espaçadores.
      Nota: Uma placa pode ser revestida com reagente de siliconização (Lista de Materiais) para facilitar a remoção de gel no passo 4.2.
    2. Dissolve-se 33,6 g de ureia em 22 ml de água e 16,4 ml de / borato / EDTA (TBE) de tampão (54 g de tris (hidroximetil) aminometano 5x Tris; 27,5 g de ácido bórico, 10 ml de ácido etilenodiaminotetra-acético 1 M (EDTA), pH 7,4, em 1 L de água) utilizando um agitador magnético.
    3. Adicionar 16 ml de solução a 40% de acrilamida / bis-acrilamida (19: 1) à solução de ureia e filtrar através de um filtro de 0,45 um.
    4. Adicionar 514 ul de 10% (w / v) recém-preparada de persulfato de amónio em água seguido por 51,4 ​​uL de N, N, N ', N' tetrametiletilenodiamina (TEMED) à solução filtrada.
    5. Inverta suavemente a solução de gel para evitar a aeração excessiva e injectar imediatamente e sem problemas para dentro da célula seqüenciamento pré-embalados colocada na horizontal a partir do furo de injecção inferior. Tome cuidado para evitar fazer bolhas durante a injeção.
    6. Permitir 1-1,5 horas até que o gel é completamente definido antes da sua utilização num ensaio de transcrição. O gel pode ser armazenada à temperatura ambiente durante dois ou três dias, quando envolvido com tecido molhado em água na parte superior da célula de sequenciação.

Reação 3. Transcrição

  1. Transcrição Alongamento Pausa Assay
    1. A formação de um complexo de transcrição alongamento
      1. Adicionar 1 ml de enzima núcleo RNAP (1? M de ações em tampão de transcrição) para um tubo de 1,5 ml.
      2. Adicionar 1 ml de factor de Sigma-purificada 70 (σ 70; 3 uM em tampão da transcrição) para o RNAP e incubar em gelo durante 10 min para formar RNAP holoenzima.
      3. Adiciona-se 3 ul de 500 nM ADN molde purificado (λ promotor P R a partir do produto de PCR pIA226) em tampão de transcrição para a holoenzima RNAP e incubar a 37 ° C durante 5 minutos para formar o complexo aberto.
      4. Prepara-se uma mistura de componentes de reacção na outra tubo de 1,5 ml utilizando 5 ul de tampão de transcrição 10x (Lista de Materiais: 400 mM de Tris-HCl, 1,6 M de KCl, MgCl2 100, 10 mM de DTT, 50% de glicerol, pH 7,9 em tratada com DEPC água), 2 ul de 250 uM cada de GTP e UTP, 1 ul de ATP 1 mM e 1 uL de α- 32 P UTP (3000 Ci / mmol). Adicionar DEPC água tratada a 41 mL.
        NãoTE: inibidor de RNase (Lista de Materiais) pode ser utilizada para minimizar a contaminação com RNase.
      5. Transferir a solução de mistura para o tubo contendo o complexo aberto e incubar a 37 ° C durante 15 minutos para formar o complexo de transcrição alongamento parou em 26 nt.
      6. Mover a reacção até à temperatura ambiente (~ 21 ° C) e adicionar 1 ul de 2,5 mg / ml de rifampicina a uma concentração final de 50 ug / ml.
      7. Adicionar 1 ml de 0.1 mM purificados NusA à mistura reaccional e incuba-se durante 5 min à temperatura ambiente.
      8. Adicionar 2 ul de 250 uM de CTP na mistura de reacção para fazer um volume final de 50 ul e medir o tempo de reacção, utilizando um temporizador.
      9. Transferência de 5 ul da solução de reacção em 2 ul de tampão de gel de ARN de carga (formamida a 95%, 0,05% de azul de bromofenol e 0,05% xileno cianol) a 30, 60, 120, 240, 480, 1200 e seg para extinguir a reacção.
      10. Descarte as pontas 32 ​​P UTP e tubos em um cont resíduos radioactivosainer.
  2. Transcrição Iniciação Assay
    1. Formação do complexo aberto
      1. Diluir purificada σ 70-0,5 uM.
      2. Repita os passos 3.1.1.1 a 3.1.1.3 utilizando 0,5 mM (em vez de 3 M) purificada σ 70, e do modelo de DNA (região promotora xil o P de produto pSG1154 PCR).
    2. Ensaio de inibição da iniciação da transcrição
      1. Adicionar o inibidor concebido para evitar a formação de RNAP holoenzima a enzima RNAP núcleo antes da adição de σ 70 (depois do passo 3.1.1.1), seguido por passos de 3.1.1.2 e 3.1.1.3 examinar se o inibidor é capaz de interromper a formação holoenzima.
      2. Alternativamente, após a etapa 3.1.1.2, adicione o inibidor para examinar se é capaz de inibir competitivamente σ 70 ligação a RNAP.
      3. Usar a mesma quantidade de DMSO, o solvente do inibidor, em vez de o inibidor staque nas reacções de controlo.
    3. A conclusão da reacção
      1. Dissolve-se heparina em água até uma concentração de estoque de 1 mg / ml e estoque a -20 ° C.
        Nota: A heparina é um concorrente do DNA que podem sequestrar RNAP que não formou um complexo aberto. Uma vez que o complexo aberto é formado, a heparina não pode entrar no local da ligação do DNA de RNAP e inibir a transcrição a partir do complexo aberto pré-formado. Portanto, a heparina só é necessária para os ensaios rodada único; ele não é necessário para os ensaios multi-redondas.
      2. Preparar a mistura de reacção utilizando 5 ul de tampão de transcrição 10x (Lista de Materiais), 1 ul de uma solução de heparina mg / ml, 1 ul de 10 mM de cada de ATP, GTP, CTP e UTP 2,5 mM, e 1 ul de 32 α- P UTP (3000 Ci / mmol). Adicionar DEPC água tratada a 45 mL.
      3. Misturar a mistura de reacção com o complexo de transcrição aberta, rotação do pulso e incubar a 37 ° C durante 20 min.
      4. Transferir 10 uL da reacção assimlução em 5 ul de tampão de gel de ARN de carga (formamida a 95%, 0,05% de azul de bromofenol e 0,05% xileno cianol) para extinguir a reacção.

4. duração e Desenvolvimento RNA Gel

  1. Executando o gel de poliacrilamida de desnaturação
    1. Submeter o gel a 50 ° C e 50 W, em tampão 1 x TBE durante aproximadamente 1,5 horas até que a temperatura do gel e o tampão é estável a 50 ° C.
    2. Amostras de calor a 90 ºC durante 30 segundos e movê-los em gelo carregamento antecipado no gel.
    3. amostras de carga nas cavidades sobre o topo do gel ao lado de uma faixa contendo 2 ul escada de ARN (diluição 1: 100).
    4. Submeter o gel a 50 W e 50 ºC em tampão 1x TBE até que o corante azul de bromofenol atinge ~ 2/3 para baixo do gel.
  2. Tratamento gel
    1. Abrir lentamente e cuidadosamente separar a placa superior da célula de sequenciação. Tome muito cuidado para evitar a quebra do gel.
    2. chromatograp CutHY papel (Lista de Materiais) para coincidir com o tamanho do gel a partir do topo para o corante azul de bromofenol. Utilizar um contador Geiger para confirmar a posição aproximada dos transcritos de RNA marcados radioactivamente.
    3. cobrir cuidadosamente o gel com o papel de filtro, e pressione com firmeza até que o gel adere ao papel de filtro. Cortar e descartar o fundo do gel de resíduos radioactivos como os PNT não incorporados correr para o fundo do gel, que pode ser muito quente.
    4. Coloque um pedaço de tamanho semelhante de papel de filtro sobre a cama de secagem de uma máquina de vácuo de secagem, e colocar cuidadosamente o papel revestido de gel para ele com o lado gel para cima.
    5. Cobrir o gel com uma película de plástico e seco a 60 ° C durante 1,5 h.
    6. Envolver o outro lado do papel de filtro de gel revestido com película de plástico, e colocar em uma placa de fósforo fotoestimuláveis ​​no caso de imagem, com o tempo de exposição apropriado, que pode variar de 1 hora a durante a noite, dependendo da eficiência da reacção.
    7. Imagem da placa de fósforo usandoum scanner gerador de imagens de acordo com as instruções do fabricante. Determinar a intensidade da banda relativa usando software ImageJ de acordo com o manual do software.
    8. Use um contador Geiger para verificar a contaminação radioactiva na área de trabalho, limpe os itens suspeitos e área com tecido e um agente de limpeza e descarte o lenço no recipiente de descarte.

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Resultados

eficiência da transcrição pode ser determinada pela medição do nível de radiação nas bandas a diferentes pontos de tempo. O ensaio parando para testar a função do fator NusA visualização da pausa, terminação habilitada, e produtos (Figura 1A) run-off. Na presença do domínio N-terminal de NusA (NTD NusA; resíduos de aminoácidos 1-137), a aparência dos produtos de ARN foi significativamente retardado em comparação com a experiência de controlo sem NusA. A deleção de resídu...

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Discussão

Em todos os organismos, a transcrição é um processo fortemente regulado. Os ensaios in vitro de transcrição têm sido desenvolvidos para proporcionar uma plataforma para testar os efeitos de factores de transcrição, moléculas pequenas e inibidores da transcrição. Neste trabalho método, foi descrito um ensaio para a transcrição bacteriana geral. ensaios de transcrição combinados com eletroforese em gel de sequenciamento de transcritos são muito importantes para estudos sobre os mecanismos que permitem a ...

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Divulgações

Os autores não têm nada a divulgar.

Agradecimentos

Este trabalho reconhece uma bolsa de início de carreira do corpo docente da Universidade de Newcastle (CM).

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Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo
NomeEmpresaNúmero de catálogoComentários
Obter as proteínas necessárias para o ensaio
E. coli RNAPEpicentroS90250
tratada com
DEPC (DEPC) Sigma-Aldrich D5758
Água sem RNase 
Ambion Nuclease-Free WaterThermoFisherAM9937
DNA template template template
wizard  Sistema de Purificação de DNA Plus SV MiniprepsPromegaA1330
ACCUZYME MixBiolineBIO-25028
Primers
Wizard SV Gel e Sistema de Limpeza de PCR PromegaA9281
NanoDrop 3300 fluoroespectrômetroThermo ScientificND-3300
NTP Preparação
ATPSigma-Aldrich A6559
UTPSigma-Aldrich U1006
GTPSigma-Aldrich G3776
CTPSigma-Aldrich C9274
rNTPs de alta purezaGE Healthcare27-2025-01
α-32P UTP PerkinElmer   BLU007C001MCcomposto radioativo
 
Novagen Perfect RNA Marker Template Mix 0.1– 1 kbMillipore69003
HEPESSigma-Aldrich H7006
Cloreto de sódioSigma-Aldrich S7653
Cloretode magnésio Sigma-Aldrich M8266
DTTSigma-AldrichDTT-RO
T7 RNAPPromegaP2075
Gel de preparação
Sequi-Gen GT célula de sequenciamento de ácido nucleico Bio-Rad   165-3804
Sigmacote   Sigma-Aldrich SL2
ureia   Sigma-Aldrich U6504
tris(hidroximetil)aminometano   Sigma-Aldrich 
ácido bórico Sigma-Aldrich B7901
ácido etilenodiaminotetracéticoSigma-Aldrich ED
40% Acrilamida/bis-acrilamida Sigma-Aldrich A9926
Sigma-Aldrich A3678
N,N,N',N'-Tetrametiletilenodiamina (TEMED)Sigma-Aldrich T9281
de Transcrição
Cloreto de potássioSigma-Aldrich P9541
glicerol   Sigma-Aldrich G5516
rifampicina   Sigma-Aldrich Formamida R3501
 Sigma-Aldrich F9037
azul de bromofenol Sigma-Aldrich B0126
xileno cianol Sigma-Aldrich X4126
heparina Sigma-Aldrich 84020
Inibidor de Ribonuclease RNasinPromegaN2511
Tampão de Transcrição 
Base TrisSigma-Aldrich T1503
Cloretode potássio Sigma-Aldrich P9541
Cloretode magnésio Sigma-Aldrich M2393
TDT   Sigma-Aldrich DTT-RO
glicerol   Sigma-Aldrich G5516
Papel
Whatman  3MM Chr Cromatografia PapelFisher Scientific05-714-5
Descontaminante
Decon 90decondecon90
Tratamento
Typhoon Trio + imagerGE Healthcare Life Sciences63-0055-89
de transcriçãoPreparação de dietilpirocarbonato de água PCR Preparação de escada de RNA 154563Persulfato de amônio Ensaio de filtroradioativoem gel

Referências

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