Rápido e simplificado método para isolamento alto Através-put de miRNA de altamente purificada lipoproteína de alta densidade

Resumo

MicroRNAs desempenhar um papel regulador importante e estão a emergir como novos alvos terapêuticos para várias doenças humanas. Tem sido demonstrado que miARNs são realizadas em lipoproteínas de alta densidade. Nós desenvolvemos um método simplificado para isolar rapidamente HDL purificada adequada para análise de miARN a partir de plasma humano.

Resumo

Pequenos RNAs não codificantes (miRNAs) têm sido implicados em uma variedade de doenças humanas, incluindo síndromes metabólicas. Eles podem ser utilizados como biomarcadores para diagnóstico e prognóstico ou podem servir como alvos para o desenvolvimento de medicamentos, respectivamente. Recentemente, foi demonstrado que os miRNAs são transportados em lipoproteínas, particularmente lipoproteínas de alta densidade (HDL) e são entregues às células receptoras para absorção. Isso levanta a possibilidade de que os miRNAs desempenhem um papel crítico e fundamental na função celular e orgânica por meio da regulação da expressão gênica, bem como mensageiros para comunicações célula-célula e diafonia entre órgãos. Os métodos atuais para isolamento de miRNA de HDL purificado são impraticáveis quando se utilizam pequenas amostras em grande escala. Isso se deve em grande parte aos métodos demorados e trabalhosos usados para o isolamento de lipoproteínas. Desenvolvemos uma abordagem simplificada para isolar rapidamente o HDL purificado adequado para análise de miRNA de amostras de plasma. Este método deve facilitar as investigações sobre o papel dos miRNAs na saúde e na doença e, em particular, fornecer novos insights sobre a variedade de funções biológicas, fora do transporte reverso do colesterol, que foram atribuídas ao HDL. Além disso, as espécies de miRNAs presentes no HDL podem fornecer informações valiosas de biomarcadores clínicos para o diagnóstico de várias doenças.

Introdução

MicroRNAs são minúsculas espécies de RNA endógenas não codificantes que são altamente conservadas e são consideradas atores-chave na regulação de vários processos biológicos, degradando ou reprimindo RNAs mensageiros alvo específicos¹. Como os miRNAs agem intracelularmente, eles foram explorados como biomarcadores derivados de tecidos, o que levou à descoberta de funções específicas desses miRNAs para tecidos. No entanto, os miRNAs também são encontrados extracelularmente associados a proteínas ou em exossomos/microvesículas que efetivamente podem protegê-los da degradação por RNases extracelulares². Estudos mais recentes mostraram que o efeito protetor do HDL pode não estar intimamente ligado à sua capacidade de promover o efluxo de colesterol, mas sim à sua carga sem colesterol, em particular como portador de miRNAs circulantes ^{3, 4}. Esses miRNAs podem não apenas modular o metabolismo lipídico, mas também estão associados a efeitos anti-inflamatórios, antioxidantes e antitrombóticos do complexo HDL-miRNA ^{5, 6}.

Para explorar ainda mais o papel dos miRNAs transportados nas partículas de HDL, um protocolo simples e fácil precisa ser estabelecido para extração de miRNAs de HDL isolado altamente purificado para uso na rotina clínica. Numerosos métodos foram descritos para isolar a HDL. Esses métodos são muito demorados ou requerem grande volume de plasma que pode exigir agrupamento de amostras, diálise extensa para dessalinização de lipoproteínas isoladas e não removem completamente os exossomos como fonte de miRNAs³, respectivamente. Aqui descrevemos um método simples e rápido que pode isolar miRNA de HDL altamente purificado utilizando pequeno volume de amostras de sangue em maior escala. Acreditamos que este método pode servir como uma boa referência para promover pesquisas sobre o papel dos miRNAs circulantes e, em particular, o papel do HDL na facilitação da comunicação entre várias células e órgãos.

Protocolo

1. Recolha de amostras de sangue

1. Recolha de amostras de sangue em jejum venosos periféricos em tubos de 10 ml em plástico contendo anticoagulante ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) (que tem diversas vantagens sobre os outros anticoagulantes) por punção venosa de uma veia padrão proeminente na fossa antecubital.
2. Centrifugar as amostras de sangue a 1600 xg durante 20 min a 4 ° C numa centrífuga de mesa a obter o plasma livre de células vermelhas do sangue e pequenas quantidades de ARN.
3. Sequencialmente centrifugar o sobrenadante a 3000 g (4 ° C) num rotor de balde oscilante durante 10 min para remover WBC e plaquetas e, em seguida, mais 15 min para remover as partículas remanescentes de células, respectivamente.
4. Medir a densidade do plasma, utilizando um densitómetro à TA de acordo com as instruções de fabrico.
   NOTA: O ajuste da densidade (d = 1,023 g / ml), com solução salina a 0,9% pode ser necessário após a remoção de exossomas, mas antes a uma ultracentrifugação de gradiente de densidade.

2. exossomo Remoção de Plasma

1. Retire os exossomos circulantes que têm uma densidade semelhante ao HDL e representam uma fonte quantitativamente significativo de miRNA ^3.
   1. Para fazer isso, a adição de 252 ul de solução exossomo precipitação a 1 ml de plasma, seguido por incubação durante 30 min a 4 ° C. Para peletizar os exossomas, centrifugar a mistura durante 30 min a 1500 g a 4 ° C.
   2. Para isolar o HDL, Transferir 1 ml do sobrenadante resultante para um tubo de ultracentrífuga policarbonato de parede espessa para processamento adicional com ultracentrifugação em gradiente de densidade (ver abaixo).

3. gradiente de densidade Ultracentrifugação (Figura 1).

1. Para separar HDL usar um processo de três passos empregando uma ultracentrífuga chão com um rotor de ângulo fixo operando a 448811 x G e 8 ° C, respectivamente.
2. Preparar três soluções de densidade diferentes sequencialmente e fresco para cada isolamento.
   1. Preparar a solução de A (isolamento de VLDL, d = 1,006 g / ml) por dissolução de 11,4 g de NaCl (NaCl: 0,195 mol), 0,1 g EDTA2Na e 1 ml de NaOH 1 N em 1000 mL de água destilada autoclavada-. Em seguida, adicionar um adicional de 3 ml de água esterilizada destilada.
   2. Preparar a solução de B (isolamento de LDL, d = 1,182 g / ml) por adição de 25,2 g de NaBr a 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 2,44 mol).
   3. Preparar a solução de C (isolamento de HDL, d = 1,470 g / ml) por mistura de 78,8 g de NaBr com 100 ml de solução A (NaCl 0,195 mol, NaBr 7,7 mol). Confirmar a densidade adequada à temperatura ambiente usando um densitômetro. Mantenha todas as soluções a 4 ° C até uso posterior.

4. Isolamento de VLDL

1. Misture 1 ml de plasma (densidade média = 1,023 g / ml) e nuclease livre 200 mL de Fat Red 7B em um tubo de ultracentrífuga 6,5 ​​ml de policarbonato de paredes espessas.
2. Em seguida, a camada cuidadosamente 5 ml de solução A em cima da mistura. Se necessário, adicionar gordura adicional Red 7B no topo da solução A, TO equilibrar o peso de cada tubo. Centrifugar durante 2 h (aceleração - 5), (desaceleração - 7).
   Nota: Durante a centrifugação, as lipoproteínas são acumulados como uma banda nas suas regiões de densidade de equilíbrio.
3. No final da corrida observar 2 camadas. Remover 1,5 mL da fracção VLDL representando a camada superior e armazenar a 4 ° C.
4. Finalmente, usando uma pipeta de transferência de 4 ml a partir do fundo do tubo contendo o LDL, HDL, albumina e fracção de ácido gordo para um novo tubo de policarbonato para o isolamento de LDL.

5. Isolamento de LDL

1. Misturar 2 ml de solução B e 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B para dentro do tubo que contém a fracção LDL e HDL (ponto 4), respectivamente.
2. Em seguida, centrifugar para fora para 3 horas (aceleração 9, desaceleração 7). Em seguida, remover 1,5 ml da fracção de LDL que representa a camada superior e manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C. Finalmente, transferir 4 ml a partir do fundo do tubo contendo a HDLfracção para um novo tubo de policarbonato.

6. Isolamento de HDL

1. Misturar 2 ml de solução C, 100 ul de nuclease isenta de gordura Red 7B e 15 ul de 98% β-mercaptoetanol para o tubo contendo a fracção HDL, respectivamente.
2. Centrifugar durante 3 h (9 aceleração, desaceleração 7). Em seguida remover 2 ml da fracção de HDL que representam a camada de topo e, ou manter a 4 ° C ou armazenar a -80 ° C.

7. A dessalinização e concentração da lipoproteína de Frações

1. Para evitar a interferência com electroforese em gel de agarose subsequente e PCR, remover excesso de sal adicionada durante a ultracentrifugação em gradiente de densidade usando dispositivos de filtro centrífugo com o corte de peso molecular apropriado (tubo 3K para VLDL e tubo de 10K para LDL / HDL) tal como descrito nas instruções do fabricante.
   1. Resumidamente, após a adição de 2,5 ml de PBS frio (NaCl 137 mM, KCl 2,7 mM, Na2HPO4 8 mM, KH2PO4 2 mM; pH 7,4) centrifuGE toda a fracção VLDL recolhidos durante densidade-gradiente ultracentrifugação a 4 ° C durante 60 min, utilizando um rotor basculante.
   2. Dessalinizar a fracção LDL duas vezes com 10 ml de PBS frio de gelo durante 30 min cada. Em seguida, use 13 ml de gelo frio PBS duas vezes para dessalgar a fração HDL. O volume PBS maior é necessário para melhorar a mobilidade com eletroforese em gel de agarose. Após centrifugação, remove as lipoproteínas contendo solutos e manter a 4 ° C, ou armazenada a -80 ° C.

8. Agarose Gel Eletroforese

1. Perfrom electroforese em gel de agarose utilizando o kit lipoproteína com pequenas modificações de instruções do fabricante, tal como se segue.
   Nota: Esta etapa é apenas para avaliar a qualidade e pureza das amostras de lipoproteína concentradas.
   1. Resumidamente, 6 ul de obter a fracção de lipoproteína dessalinizada com ultracentrifugação em gradiente de densidade e carregar num gel de lipoproteína de pré-molde. Use lipop humananormas rotein para VLDL, LDL e HDL como referência de tamanho. Realizar electroforese a RT a 100 V durante 60 min utilizando tampão de Rep Prep.
   2. Seca-se o gel durante 10 min e em seguida corar durante 10 min à TA com Fat Red 7B. Destain o gel em uma mistura de metanol-água 75:25 (v / v) e seco de novo durante 5 min.

9. Extracção e purificação de ARN

1. Perfrom isolamento de miARN pela HDL humana purificada utilizando o kit de soro / plasma de miARN isolamento e purificação.
   1. Resumidamente, adicionar 1 ml de reagente de lise de ARN de 200 ul de HDL purificada, misturar com um vortex e depois incubada durante 5 min à temperatura ambiente para garantir a completa dissociação de complexos nucleoproteicos e inactivação de RNases.
   2. Em seguida 3,5 ul de pico sintético Caenorhabditis elegans microARN (CEL-miR-39; 1,6 x 10 ⁸ cópias / ul) na mistura. Em seguida, realizar a extracção de ARN de acordo com as instruções do fabricante.
2. execute purificatina de extraiu-miARN com colunas de giro eluir conforme as instruções do fabricante. Medir a concentração de miARN de HDL purificada com um spectrophorometer.
   NOTA: eluição de miRNA das colunas de spin empregadas 16 mL de água livre de RNase.

10. Transcrição Reversa (RT-PCR)

1. Isolar 100 ng do miARN de HDL enriquecida com miARN sintético (CEL-miR-39) e sujeitos a transcrição reversa num volume de reacção de 20 ul utilizando o kit de transcrição reversa e de acordo com as instruções do fabricante.
2. Realizar os controlos adequados, sem modelo de miRNA (NTC) e sem mistura de enzima transcriptase reversa (NRT).

11. Real-time PCR (qRT-PCR)

1. Perfrom-PCR em tempo real em um volume total de 20 ul com 2 ul de uma diluição 1: 2 do ADNc, 10 ul de mistura de PCR, 2 ul de iniciador universal, 2 ul de iniciadores de miARN e 4 ul de água livre de RNase-.
2. Execute os Reactiem em placas de 96 poços a 95 ° C durante 15 min, seguido de 45 ciclos de 94 ° C durante 15 seg e 55 ° C durante 30 s e uma fase de extensão a 70 ° C durante 30 s.ec perfrom todas as reacções em triplicado .
3. Em seguida, calcuate quantidades relativas de miARN usando o método 2 ^-ΔΔ Ct após a normalização para o gene doméstico de síntese de acordo com as instruções do fabricante.

Resultados

Isolamento de lipoproteína de alta densidade após a remoção dos exossomas
Para obter a partir de miARN HDL altamente purificada é necessário remover exossomas que representam uma fonte de contaminação miARN ^7. Isto foi feito antes de ultracentrifugação em gradiente de densidade com um kit disponível comercialmente. Para fins práticos um padrão de três passos protocolo de ultracentrifugação de gradiente de densidade desenvolvido pela empre...

Discussão

A identificação de novos biomarcadores a partir de sangue irá ajudar no diagnóstico e prognóstico clínico de várias doenças. MicroRNAs têm conhecido por possuir todas as qualidades de biomarcadores e tem sido demonstrado em vários estudos ^14-17. Neste estudo demonstrámos método fácil rápida e simples para isolar miARN de HDL no plasma. Densidade convencional gradiente método ultra-centrifugação de isolamento de VLDL, LDL e HDL depende amostragem exacta de plasma, preparação precisa da solução tampão, a mediçã...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Tubos de plástico Vacutainer Lavender K2EDTA	Becton, Dickinson and Company	366643
Centrífuga	Thermo Scientific, Sorvall Legend X1R
Densitômetro 75004261 Densito 30PX	Mettler Toledo	MT51324450
solução ExoQuick		Invitrogen
	Thermo Scientific	O3237
Sorvall WX100 ultracentrífuga	Thermo Scientific	46902
Fat Red 7B	Sigma-Aldrich
	Sigma-Aldrich
Amicon Ultra-15 10K	Millipore	UFC901008
Amicon Dispositivos de filtro ultra-centrífugo 3K	Millipore	UFC800308
QuickGel Lipo kit	Laboratórios Helena	3344,3544T
Padrões de lipoproteína humana para VLDL, LDL e HDL	LipoTrol; Helena Laboratories	5069
Rep Prep buffer	Laboratórios Helena	3100
RNeasy MinElute	Analisador Qiagen
NanoDrop 1000	Thermo Scientific
miScript II RT Kit	de	Qiagen
CFX96 Touch	Kit de
miRNeasy	Ensaios de
miScript	QIAGEN	141078139
miScript SYBR Green PCR Kit	QIAGEN	218073
miRNeasy Serum/Plasma Spike-In Control	QIAGEN	219610
NaOH	SIGMA-ALDRICH
0,20 µ filtro de seringa estéril	M SIGMA-ALDRICH	Z227536