Oligomerization of the ryanodine receptor, a homo-tetrameric ion channel mediating Ca2+ release from intracellular stores, is critical for skeletal and cardiac muscle contraction. Here, we present complementary in vivo and in vitro methods to detect protein self-association and determine homo-oligomer stoichiometry.
Oligomerization is often a structural requirement for proteins to accomplish their specific cellular function. For instance, tetramerization of the ryanodine receptor (RyR) is necessary for the formation of a functional Ca2+ release channel pore. Here, we describe detailed protocols for the assessment of protein self-association, including yeast two-hybrid (Y2H), co-immunoprecipitation (co-IP) and chemical cross-linking assays. In the Y2H system, protein self-interaction is detected by β-galactosidase assay in yeast co-expressing GAL4 bait and target fusions of the test protein. Protein self-interaction is further assessed by co-IP using HA- and cMyc-tagged fusions of the test protein co-expressed in mammalian HEK293 cells. The precise stoichiometry of the protein homo-oligomer is examined by cross-linking and SDS-PAGE analysis following expression in HEK293 cells. Using these different but complementary techniques, we have consistently observed the self-association of the RyR N-terminal domain and demonstrated its intrinsic ability to form tetramers. These methods can be applied to protein-protein interaction and homo-oligomerization studies of other mammalian integral membrane proteins.
Skjelett- og hjertemuskulatur sammentrekning er utløst av sarkoplasmatisk retikulum Ca 2+ utgivelsen mediert av RyR. Det er tre pattedyr RyR-isoformer med den funksjonelle kanal sammensatt av fire identiske subenheter. Hver RyR subenhet består av et stort cytoplasmatisk regulatorisk N-terminale delen og en liten C-terminale del inneholdende de transmembranområdene som danner en høy-konduktans Ca2 + pore. Unormal intra- og inter-subenheten interaksjoner til grunn RyR kanal dysfunksjon og resultere i nevromuskulær og hjertesykdommer 1. Identifisering og karakterisering av bestemte domener som er involvert i RyR struktur: funksjon forholdet er derfor avgjørende for forståelsen av RyR patofysiologi.
Tradisjonelle biokjemiske protein-protein interaksjon teknikker kreve betydelige mengder renset protein, ofte produsert i bakterier. Dette er ikke mulig i tilfelle av RyR, en meget stor membran protein sammensatt av ~ 5000 aminosyrer, mens dets rekombinante fragmenter er ikke lett mottagelig for bakteriell ekspresjon og rensing. Således er alternative ekspresjonssystemer som omfatter eukaryote vertsceller som er nødvendig for pattedyr integrerte membranproteiner. Vi har tidligere benyttet Y2H, co-IP og tverrbindingsanalyser til kollektivt vise at N-terminale tetramerization er en strukturell funksjon som er konservert over tre pattedyr RyR isoformene 2,3. Viktigere, har vi funnet ut at et enkelt punkt mutasjon assosiert med arytmogene hjertesykdom forstyrrer N-terminale selv forening og resulterer i en dysfunksjonell RyR kanal 4. Vi har også anvendt disse metoder til oligomerisering studier av RyR cytoplasmatiske C-terminale hale 5 så vel som den N-terminale ende av den homologe intracellulær Ca2 + frigivelse kanalen, inositol 1,4,5 trisphosphate reseptor 2.
I Y2H assay den interactipå mellom to proteiner (X og Y) er målt ved rekonstituering av et funksjonelt transkripsjonsfaktor (GAL4) og den påfølgende aktivering av rapportørgener 6-9. To forskjellige kloningsvektorer blir brukt til å generere fusjoner av de to testede proteiner med de to fysisk adskillbare, uavhengige domener av GAL4: DNA-bindende domene (DNA-BD) / protein-X-fusjons (agn) og aktiverings Domene (AD) / protein-Y fusjon (mål). Den Y2H kan brukes til å teste hvorvidt et protein interagerer med seg selv ved å generere GAL4 DNA-BD og AD fusjoner av det samme proteinet. Genetisk modifiserte Y2H stammer er GAL4 og GAL80 mangelfull (den GAL80 proteinet er en repressor av GAL4), samt TRP1 og LEU2 mangelfull (for å tilveiebringe ernæringsmessig valg for agn og byttedyr plasmider, henholdsvis). I gjær kjernen, blir de rekombinante DNA-BD og AD peptider bringes i nær fysisk nærhet for å fremstille et hybrid-transkripsjonsfaktor GAL4 bare gjennom sine fusjoner 'X: Y interaction. Denne tilnærmingen muliggjør rask genetisk screening for å påvise protein-protein interaksjoner gjennom parallelltranskripsjonelle aktivering av prototrofe (HIS3-kodende for et enzym som er nødvendig for biosyntese histidin) og kromogen (LacZ som koder for β-galaktosidase (β-Gal)) rapportørgener. Den største fordelen med den Y2H er at det er en in vivo-analyse som detekterer selv svake eller forbigående protein-protein-interaksjoner. Videre omfatter deteksjon den enkle bruken av vekst seleksjon (i media som mangler histidin) eller av en kolorimetrisk (β-Gal) analyse uten behov for rensing av agn og målproteiner eller dannelse av spesifikke antistoffer. I tillegg kan den Y2H brukes til å screene en samling av tilfeldige ukjente kloner (kloner cDNA-bibliotek kondensert til GAL4 AD) for nye bindingspartnere av et agn protein, også gir direkte adgang til cDNA biblioteket proteinet.
For å forlenge Y2H observasjoner, independent biokjemiske teknikker kan benyttes. Co-IP og tverrbindingsanalyser kombinert med immunoblotting er metoder som brukes for å påvise protein foreninger i komplekse prøveblandinger, f.eks., Helcellelysater 10. Deres viktigste fordelen er at de rapporterer på protein-protein interaksjoner fra naturlig vev, i motsetning til andre fremgangsmåter som krever bruk av rekombinante proteiner. Rekombinante proteiner kan også anvendes, typisk uttrykt i en pattedyrcellelinje, hvor de er sannsynlig å ha sin korrekte konformasjon og post-translasjonelle modifikasjoner, så vel som subcellulære lokalisering. Imidlertid, siden ko-IP og tverrbinding er i vitro analyser som gjør bruk av homogeniserte celler, er det nødvendig å bekrefte hvorvidt de to proteinpartnere er co-lokalisert i den intakte cellen 11. Vi benytter rutinemessig transfeksjon av pattedyr HEK293 celler til forbigående å uttrykke pattedyr integral membran og cytosoliske proteiner ved hjelp av kalsiumfosfat-utfellingsmetoden 2-4,12-14, Som er beskrevet her i detalj. Dette er en billig måte for effektiv levering av plasmid DNA i celler, men den er avhengig av den spesielle cellelinje som brukes, og cellesammenløpet, samt renhet av plasmid DNA 11,15.
Den ko-IP måling involverer isolering av det naturlige eller rekombinante protein av interesse fra cellelysater under ikke-denaturerende betingelser som muliggjør at ko-rensning av mulige interaksjonspartnere 10,16. Den krever bruk av to uavhengige antistoffer, den immunoutfelling antistoffet for isolering av protein X, og immunoblotting antistoff for påvisning av proteinpartner Y. Den kan brukes til å teste hvorvidt et protein interagerer med seg selv ved å generere to forskjellige fusjoner med to forskjellig epitop tags (f.eks., HA og cMyc). Den immunoutfelling antistoffet er bundet gjennom sitt Fc-område på protein-A (eller protein-G, avhengig av dyrearten, hvor antistoffet ble hevet), hvilkener konjugert til agarose (eller sepharose) harpiks. Protein X utfelles ved antistoff: Protein-A-harpiks etter inkubasjon med cellelysatet, nemlig den vaskemiddel-oppløselige fraksjon av homogeniserte celler. Protein immuno-komplekser eluert med SDS-holdig buffer og deretter analysert ved hjelp av SDS-PAGE og immunblotting ved bruk av et antistoff for å påvise tilstedeværelse av protein Y-17. Co-IP-bør utføres med detergentløselige proteiner for å unngå overdreven ikke-spesifikk binding. Valg av vaskemiddel og dets konsentrasjon, samt antall vaskinger, bør optimaliseres for hver X: Y par 10,16,18.
Tverrbinding anvendes for å bestemme støkiometrien av den oligomere proteinkomplekset. Den er basert på en kjemisk reaksjon for å lage kovalente bindinger mellom tilstøtende samvirkende protomere, og derfor, det muliggjør bevaring av proteinets oligomere status ved SDS-PAGE separasjon. Det er mange kryssbinding reagents av ulike lengder og kjemi er målrettet mot forskjellige reaktive grupper på et proteiner, vanligvis primære aminer, karboksyl eller tiolgrupper. Her beskriver vi bruken av glutaraldehyd (OHC (CH2) 3 CHO), en homo-bi-funksjonelle tverrbindingsmiddel med to aldehydgrupper på hver ende som reagerer med frie aminogrupper som er tilstede i lysinrester 19,20. Tverrbinding er fulgt i en treringstrinnet eller tidsavhengig måte som resulterer i adduktdannelse. Glutaraldehyd reaksjonen stoppes med hydrazin (H 2 NNH 2) og proteinprøver blir deretter analysert ved SDS-PAGE og immunblotting 17 for å evaluere deres oligomerisering tilstand. Vi bør merke seg at kryssbinding induserer ikke oligomeriseringsprosessen men bare skaper stabile broer mellom eksisterende protein komplekser. Viktige hensyn ved gjennomføring av tverrbindingseksperimenter omfatter valget av kryssbindingsmiddel, dets konsentrasjon og reaksjonstiden 19,20.
Dannelsen av protein homo-oligomerer er en fundamental biologisk prosess som regulerer aktiviteten av transkripsjonsfaktorer, enzymer, ionekanaler og reseptorer 25,26. Viktigere, har protein oligomeriseringsprosessen også patologiske konsekvenser inkludert nevrodegenerasjon og arytmogene hjertesykdom 4,27. De metoder som er skissert i denne artikkelen brukes til å identifisere domene-domene interaksjoner formidler protein selv forening og oligomerisering. Nedenfor peker vi på kritiske trinnene i hver protokoll, og vi diskutere viktige hensyn, begrensninger og feilsøking.
Den Y2H Systemet kan benyttes først å screene for potensielle samspill protein partnere på grunn av sin relativt høy gjennomstrømning screening, brukervennlighet og svært reproduserbare resultater. Y2H prosedyrer er utført i et mikrobiologisk laboratorium med standard (plate eller shaker) inkubatorer og rom containment fasiliteter. Bruken av freshly forberedt kompetente celler (trinn 1.1.8) er kritisk for høy effektivitet gjær transformasjon, mens det for de beste resultater i β-Gal analyser, fersk vokst gjær kolonier (opp til 5 dager gamle) bør brukes (trinn 1.2.3). Systemer basert på annet enn GAL4 og / eller ekstra / alternative reporter gener transkripsjonsfaktorer er tilgjengelig, og derfor agn og byttedyr plasmider bør matches med riktig Y2H belastning.
Noen stammer som skal bli dyrket i nærvær av 3-amino-1,2,4-triazol, en konkurrerende inhibitor av HIS3-protein, for å slukke enhver konstitutiv ekspresjon av HIS3 reportergen 7,8. Uttrykk for agn og målet fusjonsproteiner bør verifiseres av immunoblotting 17. I tilfelle agn / byttedyr fusjonsproteiner er giftig for gjær, kan lavere akseptable proteinnivåer oppnås ved kloning i forskjellige vektorer hvor agnet / byttedyr ekspresjon drives av en annen promoter. Videre er det viktig å sikre tlue agn / byttedyr fusjonsproteiner viser ikke autonom reporter genaktivitet. Autonomous reporter gen aktivering kan bli reddet ved å endre konstruksjonen for å fjerne ansvarlig region, eller ved å bytte GAL4 DNA-BD og AD fusjoner for de to testede proteiner. Videre er transmembranområdene bedre utelatt fra agn / byttedyr konstruksjoner fordi de kan forårsake uriktig folding eller mislocalization av fusjonsproteiner i intracellulære membranlommer. Faktisk, er den største ulempen med den Y2H system som agn og target-proteiner er lokalisert i gjær kjernen bort fra deres fysiologiske subcellulære beliggenheten og potensielt mangler spesielle post-translasjonelle modifikasjoner, noe som resulterer i falske positive eller falske negative interaksjoner 6-9 .
Pattedyr heterologe ekspresjonssystemer er bedre egnet for studier av pattedyr integrerte membranproteiner i form av conformation, post-translasjonelle modifiseringer og subcellulære lokalisering.En av de mest brukte celle transfeksjonsmetoder er det kalsiumfosfatutfelling, hovedsakelig på grunn av den minimale utstyr og reagenser nødvendig 11,15. Alternative metoder, nemlig elektroporering, liposomer, kationiske lipider og polymerer, kan gi høyere transfeksjonseffektiviteten avhengig av cellelinjen og konstruere brukt. Generelt er de viktigste faktorene som påvirker transfeksjonseffektiviteten er plasmid DNA kvalitet og celle helse / levedyktighet. De beste resultatene oppnås når plasmid-DNA av den høyeste renhet (260 nm / 280 nm absorbans-forhold på ~ 1,8) og aktivt delende celler brukes. Celler bør derfor transfekteres på ikke mer enn 60 – 70% konfluens (trinn 2.1.2), fordi evnen til å ta opp fremmed DNA er relatert til overflatearealet av cellen utsettes for mediet 11. I tillegg er inkludering av antibiotika i kulturmediet i løpet av transfeksjon (trinn 2.1.3) ikke anbefales på grunn av økt celledød 15.
Feller kalsiumfosfat utfelling særlig nøye planlegging og pH-justering (til 7,05 presist) av 2x HBS-oppløsning (trinn 2.1.1), og riktig dannelse av plasmid DNA / kalsium / fosfat-komplekser ved kraftig blanding (trinn 2.1.5) ligger viktige skritt for høy effektivitet transfeksjon. Vanligvis protein uttrykk ved forbigående transfeksjon topper innen 24-72 timer.
Når cellene er høstet, må påfølgende prosedyrer utføres ved 4 ° C for å minimalisere proteaseaktivitet, og tilsetning av protease-inhibitorer er anbefalt. Celle homogenisering bør følges av et sentrifugeringstrinn for å fjerne kjerner fordi kromosomalt DNA kan øke løsningens viskositet og øke ikke-spesifikk binding. Således, blir homogeniseringen ved hjelp av mekaniske midler i en iso-osmotisk buffer foretrekkes, vanligvis i (0,3 M) sukrose eller (150 mM) NaCl. Generelt er sukrose-baserte buffere er kjent for å forbedre proteinstabilitet og redusere potensiell ikke-nativt protein aggregasjon, men på grunn av phenvisnings hydrering på proteinflaten, er elektrostatisk protein-protein interaksjoner foretrukket. Omvendt, salt-baserte buffere påvirker nettoladningen av ladede aminosyre-sidegrupper på proteinflaten, og dermed ha en forspenning mot mer hydrofobe interaksjoner baserte 28.
Co-IP-er den mest vanlig anvendt biokjemisk analyse for å vurdere protein-protein interaksjoner, spesielt fra opprinnelig vev. Dens viktigste ulempen er kravet for svært spesifikke antistoffer validert for bruk i IP og immunblot 10,16,18. Dermed er rekombinante proteiner ofte merket med en peptid-epitop, f.eks., Influensa hemagglutinin (YPYDVPDYA) eller human cMyc (EQKLISEEDL), hvor det høy-affinitet spesifikke antistoffer er kommersielt tilgjengelige. Om ønsket, kan den immunoutfelling antistoffet være kjemisk konjugert på protein-A-harpiks for å unngå dens eluering og deteksjon i løpet av immunblotting scenen som kan tilsløre det ko-utfelte protein 16; for å oppnå dette, har vi med hell brukt den kjemiske kryssbinder 3,3'-ditiobis (sulfosuccinimidylpropionate) 24. Det er viktig at et passende vaskemiddel er inkludert i IP-buffer, og det uoppløselige materiale av homogeniserte celler ble fjernet ved sentrifugering for å minimere ikke-spesifikk binding (trinn 3.1.3). Valget og konsentrasjonen av vaskemiddel er viktige betraktninger: sterkere vaskemidler og / eller høyere konsentrasjoner vil vesentlig redusere ikke-spesifikk binding, men kan også oppheve X: Y proteininteraksjon, mens lavere konsentrasjoner eller mildere detergenter kan tillate en svak interaksjon som skal følges, men kanskje resultere i store ikke-spesifikk binding. Mellomliggende styrke vaskemidler er foretrukket, for eksempel Triton X-100 0.5 -. 1% konsentrasjon. For ytterligere å redusere ikke-spesifikk binding, et nøytralt protein (for eksempel bovint serumalbumin ved 100 ug / ml) kan inkluderes i IP-buffer, og / eller cellelysatet kan forhånds Cleared med før inkubasjon med protein-A harpiks alene. Antall vaskinger bør optimaliseres for X: Y par testet, typisk tre 10-minutters vaskinger med IP-buffer (trinn 3.1.9). I alle fall bør en ko-IP-prøven med ikke-immun IgG som immunoutfelling antistoffet alltid bli behandlet parallelt for å tjene som negativ kontroll (trinn 3.1.6).
Den største fordelen med kjemisk tverrbinding er at den informerer om den støkiometriske sammensetning av proteinet homo-oligomer. Glutaraldehyd er et vanlig kryss-linker fordi det krever ingen spesialutstyr, og det genererer termisk og kjemisk stabile kryssbindinger mellom samspill proteiner 19,20. Forbindelser med frie aminogrupper bør sløyfes fra analysebuffere (trinn 3.2.1) fordi de vil slukke den kjemiske reaksjonen. Glutaraldehyd-konsentrasjonen og reaksjonstiden (trinn 3.2.4) bør være optimalisert for de oligomere proteinkomplekset av interesse. Den største ulempen med denne teknikken, especially når den utføres på hele cellepreparater, er den ikke-spesifisiteten av den kjemiske reaksjon som kan gi kunstige proteinaggregater som mangler biologisk betydning.
Alternative in vivo (f.eks. Fluorescens resonans energioverføring, bi-molekylær fluorescens eller luminescens komplementering) og in vitro-teknikker (f.eks., Størrelseseksklusjons-kromatografi, analytisk ultrasentrifugering, isoterm titrering kalorimetri) er tilgjengelige for å karakterisere proteinet selv-assosiasjon og vurdering oligomeriseringsgrad støkiometri 29,30. Hver metode har sine egne fordeler og ulemper, og det kan være mer egnet for studium av et spesifikt protein, avhengig av proteinrensing / stabilitet og utstyr / reagens tilgjengelighet. De tre komplementære metoder som beskrives her i detalj, nemlig Y2H, co-IP og kryssbinding, er blitt brukt i kombinasjon for å gi overbevisende bevis for RyR2 homo-oligomer dannelse isolert og i en levende celle.
The authors have nothing to disclose.
Dette arbeidet ble støttet av British Heart Foundation Fellowships til SZ (FS / 08/063 og FS / 15/30/31494).
1. PART 1 yeast two-hybrid | |||
Plate incubator | Hereaus | B6120 | Used at 30°C |
Orbital shaker incubator | New Brunswick Scientific | INNOVA 4300 | Used at 30°C with shaking at 230-250 rpm |
Spectrophotometer | Perkin Elmer | Lambda Bio+ | To measure OD600 of yeast culture; to measure Absorbance at 420 nm in liquid b-Gal assay |
Matchmaker Two-Hybrid System 2 Kit | Takara Clontech | K1604-1 | Contains bait vector pGBKT7, prey vector pACT2 and yeast strain Y190 |
Yeast Nitrogen Base | Sigma-Aldrich | Y0626 | To prepare minimal SD growh medium |
Dropout supplement lacking leucine and tryptophan | Sigma-Aldrich | Y0750 | To prepare minimal SD growh medium |
Dropout supplement lacking leucine, tryptophan, histidine | Sigma-Aldrich | Y2001 | To prepare minimal SD growh medium |
Herring testes carrier DNA | Takara Clontech | 630440 | For yeast transformation |
Whatman filter paper Grade 5 | Sigma-Aldrich | WHA1005070 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
X-Gal (5-bromo-4-chloro-3-indolyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | B4252 | for use in colony-lift filter paper b-Gal assay |
ONPG (o-nitrophenyl-β-D-galactopyranoside) | Sigma-Aldrich | N1127 | for use in liquid b-Gal assay |
PART 2. Protein expression in a mammalian cell line | |||
HEK293 cell line | ATCC | ATCC® CRL-1573™ | |
Humidified incubator (5% CO2, 37 °C) | SANYO | MCO-18AIC | To culture mammalian cells |
DMEM (Dulbecco's Modified Eagle's medium) | Invitrogen (ThermoFisher) | 41966 | To prepare growth medium for mammalian cells |
Fetal Bovine Serum | Invitrogen (ThermoFisher) | 10500 | To prepare growth medium for mammalian cells |
Glass beads | Sigma-Aldrich | G8772 | To homogenise cells |
Needle 23G (0.6 x 30mm) | BD Microlance | 300700 | To homogenise cells |
Protease inhibitor cocktail (Complete) | Roche | 11873508001 | To prevent proteolysis |
PART 3. In vitro biochemical methods | |||
Mini-PROTEAN Tetra Cell (SDS-PAGE system) | Bio-Rad | 1658000EDU | For polyacrylamide gel electrophoresis |
Trans-Blot SD (Semi-dry transfer system) | Bio-Rad | 1703940 | For electrophoretic transfer |
Compact X-ray film processor | Xograph | X4 | For use in immunoblotting |
Glutaraldehyde | Sigma-Aldrich | G5882 | For use in chemical cross-linking |
Protein-A sepharose beads | GE Healthcare Life Sciences | 17-5280-01 | For use in co-IP assay |
Anti-HA (Y-11 rabbit polyclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-805 | For use in co-IP assay |
Non-immune rabbit IgG | Santa Cruz Biotechnology | sc-2027 | For use in co-IP assay |
Anti-cMyc (9E10 mouse monoclonal IgG) | Santa Cruz Biotechnology | sc-40 | For use in immunoblotting |
Anti-HA (16B12 mouse monoclonal IgG) | Covance | MMS-101P | For use in immunoblotting |
Anti-mouse IgG-HRP | Santa Cruz Biotechnology | sc-2005 | For use in immunoblotting |
Hyperfilm ECL | GE Healthcare Life Sciences | 28906836 | For use in immunoblotting |
ECL Western Blotting Substrate | Pierce (ThermoFisher) | 32106 | For use in immunoblotting |