Wet Chemistry and Peptide Imobilização em Polytetrafluoroethylene para Melhoria de adesão celular

Resumo

A adesividade celular é a chave para muitas abordagens na pesquisa de biomateriais e engenharia de tecidos. Uma técnica passo a passo é apresentada usando química úmida para a modificação da superfície do importante polímero PTFE com peptídeos.

Resumo

Dotando materiais de superfície com propriedades de células-adesivo é uma estratégia comum em pesquisa biomaterial e engenharia de tecidos. Isto é particularmente interessante para os polímeros já aprovados que têm uma utilização de longa data na medicina, pois estes materiais são bem caracterizadas e questões legais relacionadas com a introdução de polímeros sintetizados de novo podem ser evitadas. Politetrafluoroetileno (PTFE) é um dos materiais mais utilizados para a produção de enxertos vasculares, mas o polímero carece de promover a adesão celular características. Endotelização, ou seja, a cobertura completa dos enxertos superfície interior com uma camada confluente de células endoteliais é considerada chave para um desempenho óptimo, principalmente pela redução da trombogenicidade da interface artificial.

Este estudo investiga o crescimento de células endoteliais em PTFE modificado com péptido e compara estes resultados com os obtidos no substrato não modificado. Acoplamento com opéptido de adesão celular endotelial Arg-Glu-Asp-Val (REDV) é realizada através da activação do polímero contendo fluorin usando o reagente de naftaleneto de sódio, seguido de passos subsequentes de conjugação. A cultura de células é realizado utilizando Células Endoteliais da Veia Umbilical Humana (HUVECs) e excelente crescimento celular em material imobilizado-péptido é demonstrada ao longo de um período de duas semanas.

Introdução

Vários polímeros utilizados na medicina que tenham sido aprovados por algum tempo não apresentam biocompatibilidade melhorada, isto é, a falta de adesão célula-a adesividade, a indução de encapsulamento fibrótica e trombogenicidade, para mencionar alguns. As interacções entre o biomaterial e o sistema biológico ocorre principalmente na superfície do implante. Como consequência, a investigação centrou-se na modificação da superfície, a fim de criar propriedades apropriadas para uma aplicação desejada, deixando as propriedades de volume do material afectado. Politetrafluoroetileno (PTFE) como um polímero fisiologicamente inerte é utilizado em muitos campos médicos, tais como hérnia ^uma malha cirúrgica, portas médicos ² e, o mais importante, os enxertos vasculares ^3.

Especialmente em situações de contacto de sangue a natureza hidrofóbica de PTFE faz com que a adsorção não específica dos componentes do plasma e como uma consequência a adesão de plaquetas, frequentemente resultando em thrombotieventos c e oclusão do enxerto ^4. Além disso, o PTFE, como a maioria dos polímeros, não suporta a adesão celular e da cobertura que seria uma característica desejável para induzir a formação de uma camada de células endoteliais benéfico (ECS) no interior (luminal) da superfície do enxerto vascular ^5. A endotélio biomimética é esperado para cumprir muitas das funções de seu equivalente natural, nomeadamente as suas propriedades antitrombogênicas ^6. Uma estratégia geral biomimética modificação baseia-se no conceito de dotar exclusivamente com o material de células-adesividade, deixando as propriedades materiais a granel afectada. Além disso, a adesão de plaquetas pode ser reduzida através da incorporação de anti-adesivo (anti-incrustação) ⁷ atributos. Vários péptidos - principalmente derivados de proteínas da matriz extracelular - foram descritas que aumentam fortemente de adesão celular através da ligação a receptores celulares, que pertence à classe de integrinas ^8. O serr exemplo conhecido a este respeito, é o péptido Arg-Gly-Asp (RGD) que interage com a maioria dos tipos de células. Outras sequências de aminoácidos são reconhecidas pelas integrinas exclusivamente expressa em células específicas. Por exemplo, Arg-Glu-Asp-Val (REDV) e Tyr-Ile-Gly-Ser-Arg (YIGSR), foram encontrados para se ligarem a células endoteliais de uma forma específica ^9. Imobilização covalente de tais péptidos foi levada a cabo numa multiplicidade de materiais inerentemente não aderentes, incluindo metais e polímeros ^10,11.

PTFE poroso, mais precisamente, de PTFE expandido (ePTFE) - juntamente com tereftalato de polietileno (PET) - é o material mais importante para a produção de enxertos vasculares ^12. Técnicas físicas estabelecidas para os tratamentos apropriados, tais como a modificação de plasma ¹³ ou por métodos fotoquímicos ^14, está dificultada pelo facto de que as estruturas porosas e / ou tubulares não são prontamente tratáveis ​​no interior dos poros ou o lúmen, respectivamente. química úmidaem PTFE é uma tarefa difícil devido à natureza altamente inerte do polímero contendo fluorin que resiste a ataques mais químicas ^15.

Neste artigo descrevemos um método relativamente fácil para uma estratégia de modificação covalente. Adaptado a partir de um processo para processar PTFE colável, grupos funcionais foram criados na superfície de materiais que servem como pontos de ancoragem para posterior conjugação de moléculas biologicamente activas.

Protocolo

1. Preparação de sódio naftaleneto Activar Solution e ativação de superfície

Nota: Realizar reações em um exaustor bem ventilado. Siga as regras gerais para lidar com solventes altamente inflamáveis ​​e corrosivos metais como o sódio metálico. Naftaleno tem um cheiro muito desagradável (naftalina), mesmo em quantidades muito pequenas! Se não for indicado de outro modo as reacções são realizadas à temperatura ambiente. A azida de sódio é altamente tóxico! THF (99,9%, ver Lista de Materiais) foi armazenada ao longo de aproximadamente 20% (em volume) de crivo molecular. Destila-se THF com um teor de água perceptível ao longo de sódio. A formação de naftaleneto de sódio não ocorre se pequenas quantidades de água estão presentes.

1. A uma solução de 1,4 g (10,9 mmol) de naftaleno em 20 ml de tetra-hidrofurano (THF, seco sobre peneiro molecular de 3 Á), adicionar 0,25 g (10,9 mmol) de metal de sódio em uma garrafa de vidro de 100 ml com tampa de rosca equipado com um PTFE revestido barra de agitação magnética.
   Nota: dissolução pode ser grandemente aumentada através do corte do de sódio em pedaços pequenos e aquecimento moderado (35 - 40 ° C). A solução final tem uma cor ligeiramente esverdeada escura e podem ser armazenadas em condições rigorosamente seco.
2. Punch out discos de PTFE de 12 mm de diâmetro a partir de material de folha de espessura de 0,5 mm. Mark um lado (por exemplo, usando uma carta carimbo de soco) e limpo, com iso-propanol.
3. Incubar PTFE-amostras individualmente na solução de activação (passo 1.1) para 1 - 2 min usando uma pinça. Nota: A mudança de cor do branco ao marrom escuro indica o sucesso do tratamento.
4. Subsequentemente lavar duas vezes com THF e depois com iso-propanol.
   Nota: A solução naftaleneto se esgota quando sua cor muda para um castanho claro aguado. naftaleneto solução não utilizada (possivelmente contendo sódio metálico) tem de ser decomposto por adição lenta de iso-propanol antes da sua eliminação.
5. Oxidar amostras tratadas em peróxido de hidrogénio (30%) contendo 20% (w / v) de ácido tricloroacético, durante 3 h. lavarcom água e seco. A superfície agora tem uma aparência leve acastanhada. Nota: A activação e o resultado de oxidação em uma molhabilidade drasticamente aumentada da superfície. Esta descoberta foi examinada em detalhe anteriormente ^14.
6. Tratar discos oxidados com 50% (v / v) de diisocianato de hexametileno (HMDI) em THF seco durante 2 h, lavar com THF e deixar secar.
7. Hidrolisar amostras com isocianato em água por 2-3 horas e seco. Nota: A superfície de PTFE amino-funcionalizado final é muito mais estável do que as amostras de rolamento isocianato e é compatível com muitos agentes de ligação cruzada standard para acoplamento adicional.

2. Peptide Imobilização

1. Prepara-se uma solução de 20% (v / v) de éter de diglicidilo de dietilenoglicol (diepóxido) em 50 mM de tampão carbonato, pH 9.
2. Colocar os discos aminado com o lado marcados individualmente para uma placa de 24 poços e adicionar 1,5 ml da solução de epóxido. Assegurar uma cobertura completa das amostras. Incubar durante 2 horas e lavar duasvezes com água e uma vez com tampão de carbonato.
3. Adicionar 50 ul de uma solução a 0,5 mg / ml de péptido (por exemplo, REDV) em 50 mM de tampão carbonato, pH 9 contendo 0,01% de NaN _3, ao fundo dos poços individuais de uma placa de 24 poços frescas e colocar cuidadosamente os discos de cabeça funcionalizado com epoxi -down (isto é, marcada voltado para baixo) para a gota de solução de péptido. Certifique-se de que o espaço entre a parte inferior do poço e o disco de PTFE é completamente molhado devido à acção capilar.
4. Incubar numa câmara húmida (por exemplo, qualquer caixa de plástico lacrado com uma tampa de fecho estanque) com atmosfera húmida (por colocação de papel de tecido húmido na parte inferior) durante pelo menos 3 horas ou durante a noite.
   Nota: Embora o motivo REDV pode ser considerado como bem caracterizado, uma sequência de aminoácido codificado ou inverso pode ser incluído como um controlo negativo adicional.
5. Lavar três vezes com água e esterilizar em 50% de iso-propanol / água durante pelo menos 30 min. Antes da sementeira, célula RinsÊ O amostras em solução salina estéril tamponada de fosfato (PBS).

Sementeira 3. celular

1. HUVECs crescem utilizando procedimentos de cultura celular padrão ^17,18.
2. Colocar as amostras de peptídeos conjugados com o lado alterado em um placas de 24 poços. Use discos de PTFE não tratado como um controlo.
3. Semente de 5 x 10 ⁴ HUVEC em 2 ml de meio por poço e incubar durante 4 horas a 37 ° C e _CO2 a 5% numa incubadora.
4. Retire os discos, lavar cuidadosamente para remover células não ligadas e transferir para um placa de 24 poços fresco. Adicionar 2 ml de meio fresco e incubação durante o período desejado (por exemplo, 24 horas, 1 W, etc.). Mudança do meio de dois em dois dias.
5. Prepara-se uma solução stock de 1 mg / ml de Calcein-AM em sulfóxido de dimetilo (DMSO).
6. Após o crescimento as células de remover o meio, lava-se com PBS e adicionar PBS contendo 1 ul / ml de mancha calceína-AM (por exemplo, 1 ul de uma solução de stock por ml de PBS). Agite suavemente e incubate a 37 ° C durante 45 min no escuro.
7. Lava-se com PBS e imediatamente tomar micrografias num microscópio de fluorescência equipado com filtros FITC padrão (Ex 488 nm, Em 515 nm). Use ampliação de 100 vezes. Execute triplicados de não modificada, bem como amostras tratadas.
8. Utilizando o software ImageJ determinar a área colonizados pelas células. Alternativamente contar as células manualmente ou usar ImageJ. Ambos os métodos lhe dará informações semelhantes sobre a ligação e crescimento de células nas respectivas superfícies.

Resultados

Os resultados dos passos de reacção químicos cruciais foram monitorizadas por espectroscopia de IV (Figura 1). A ativação inicial com naftaleneto de sódio gera ligações duplas - e, em menor medida - OH-funcionalidades. O sinal que indica C = ligações C desaparecer por oxidação, dando origem a uma superfície de rolamento quase exclusivamente grupos hidroxilo. Análise de novos passos de conjugação padrão não são mostradas aqui. As mudanças de cor devido à oxidação de activ...

Discussão

A descrição detalhada do protocolo de modificação da superfície de PTFE consiste em passos sucessivos começando com a eliminação de flúor a partir da espinha dorsal do polímero, como representado na Figura 6. Como resultado, uma camada é formada, que contém uma quantidade abundante de ligações duplas conjugadas carbono-carbono em acordo com a cor marrom escuro que se desenvolveu após tratamento naftaleneto. oxidação padrão com água oxigenada ácida produz uma superfície hidroxilada acompanhada por clarea...

Materiais

Lista de materiais utilizados neste artigo

Nome	Empresa	Número de catálogo	Comentários
Folha de PTFE 0.5 mm	Plástico Cadillac	n/a
Peptídeo REDV	Genecust	n/a	síntese personalizada >95% de pureza
iso-propanol	Sigma Aldrich	34965
tetrahidrofurano (THF)	Sigma Aldrich	401757
dimetilsulfóxido	Sigma Aldrich	D8418
peneira molecular 3 &	Sigma Aldrich	208574
sódio metálico	Sigma Aldrich	483745
fosfato tamponado salino (PBS)	Sigma Aldrich	D8537
naftaleno	Sigma Aldrich	147141
peróxido de hidrogênio 30%	Sigma Aldrich	95321
ácido tricloroacético	Sigma Aldrich	T6399
éter diglicidílico de dietilenoglicol	Sigma Aldrich	17741
diisocianato de hexametileno (HMDI)	Sigma Aldrich	52650
Calceína-AM	Sigma Aldrich	56496
bicarbonato de sódio	Sigma Aldrich	S6014
azida de sódio	Sigma Aldrich	71290
placas de 24 poços	Greiner-Bio-One	662 160
ATR-FTIR espectrofotômetro Nicolet Magna-IR 850	Microscópio	n/a
Olympus X-70	Olympus	n/a
células endoteliais da veia humbilical (HUVECs)	Lonza	n/a
ePTFE enxerto vascular	Gore	n/a

de fluorescência Nicolet